309
10
4482
-
https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/053da4a0b4583099c79e24942dc9a9d2.pdf
2a8aec12370912caef69d053574d23fb
PDF Text
Text
������
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resolución SENASA N° 0731/2010
Description
An account of the resource
Picudo del Algodonero. Desmontadoras y Centros de acopio de algodón.
Creator
An entity primarily responsible for making the resource
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Source
A related resource from which the described resource is derived
<a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=173609">Resolución SENASA N° 0731/2010</a>
Date
A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource
Miércoles 13 de Octubre de 2010
Language
A language of the resource
Es
Type
The nature or genre of the resource
Resolución
Abstract
A summary of the resource.
El transporte de carga vacío (en lastre) que egrese de las desmotadoras y centros de acopio de algodón en bruto, deberá ser desinsectado contra la plaga del Picudo del Algodonero (Anthonomus grandis, Boheman).
-
https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/5739db8e1ce20155ca9a96f3ea7f818d.pdf
8a4b6eaceaf2f02cff8e91d02643dbcc
PDF Text
Text
República Argentina - Poder Ejecutivo Nacional
2019 - Año de la Exportación
Resolución
Número: RESOL-2019-1530-APN-PRES#SENASA
CIUDAD DE BUENOS AIRES
Jueves 14 de Noviembre de 2019
Referencia: EE 50600308/2019 - MODIFICA RESOLUCIONES SENASA NROS. 22/16 Y 731/10 (PICUDO
DEL ALGODONERO)
VISTO el Expediente Nº EX-2019-50600308- -APN-DGTYA#SENASA; la Norma Internacional para Medidas
Fitosanitarias N° 5 de la Convención Internacional de Protección Fitosanitaria de la ORGANIZACIÓN DE LAS
NACIONES UNIDAS PARA LA ALIMENTACIÓN Y LA AGRICULTURA (FAO); las Leyes Nros. 26.060 y
27.233; los Decretos Nros. 434 del 1 de marzo de 2016 y 891 del 1 de noviembre de 2017; las Resoluciones Nros.
95 del 4 de junio de 1993 y 213 del 5 de octubre de 1993, ambas del entonces INSTITUTO ARGENTINO DE
SANIDAD Y CALIDAD VEGETAL, 905 del 30 de noviembre de 2009, 731 del 13 de octubre de 2010, 559 del
9 de diciembre de 2014 y 22 del 20 de enero de 2016, todas del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y
CALIDAD AGROALIMENTARIA, y
CONSIDERANDO:
Que en el marco de las políticas públicas, el ESTADO NACIONAL ha instrumentado herramientas de
transformación del sector algodonero argentino mediante la promulgación de la Ley N° 26.060, estableciendo el
Plan de Desarrollo Sustentable y Fomento de la Producción Algodonera.
Que la Ley N° 27.233 declaró de interés nacional la sanidad de los animales y los vegetales, así como la
prevención, el control y la erradicación de las enfermedades y plagas que afecten la producción silvoagropecuaria
nacional.
Que, asimismo, el citado cuerpo normativo declaró de orden público las normas nacionales por las cuales se
instrumenta o reglamenta el desarrollo de las acciones destinadas a preservar la sanidad animal y la protección de
las especies de origen vegetal, y estableció la responsabilidad primaria e ineludible de toda persona física o
jurídica vinculada a la producción, obtención o industrialización de productos, subproductos y derivados de
origen silvoagropecuario y de la pesca, a responder por la sanidad, inocuidad, higiene y calidad de su producción.
Que, a tal fin, designó al SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA como la
autoridad de aplicación y el encargado de planificar, ejecutar y controlar el desarrollo de las acciones para
�preservar la sanidad de los animales y vegetales, la prevención, control y erradicación de enfermedades y plagas
que afecten la producción silvoagropecuaria nacional, como también la producción, inocuidad y calidad de los
agroalimentos, como el comercio nacional e internacional de dichos productos y subproductos.
Que el Picudo del Algodonero (Anthonomus Grandis Boheman) ha sido declarado plaga de la agricultura por la
Resolución N° 95 del 4 de junio de 1993 del ex-INSTITUTO ARGENTINO DE SANIDAD Y CALIDAD
VEGETAL.
Que la referida plaga hoy se encuentra clasificada como plaga cuarentenaria presente bajo control oficial.
Que mediante la Resolución N° 213 del 5 de octubre de 1993 del citado ex-Instituto, se creó el Programa
Nacional de Prevención y Erradicación del Picudo Mexicano del Algodonero (PNPEPA), actualmente en
ejecución.
Que la Norma Internacional para Medidas Fitosanitarias (NIMF) N° 5 de la Convención Internacional de
Protección Fitosanitaria de la ORGANIZACIÓN DE LAS NACIONES UNIDAS PARA LA ALIMENTACIÓN
Y LA AGRICULTURA (FAO), definió los conceptos de áreas bajo cuarentena, áreas de baja prevalencia de
plagas y áreas libres de plaga.
Que por la Resolución N° 905 del 30 de noviembre de 2009 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y
CALIDAD AGROALIMENTARIA, se declararon las áreas bajo cuarentena o Zona Roja Infestada con Picudo
del Algodonero (Anthonomus grandis, Boheman) y las áreas controladas o Zona Amarilla sin presencia de focos
de la citada plaga, estableciendo los tratamientos químicos y las prohibiciones de movimientos de algodón y
subproductos, en tanto que su modificatoria N° 559 del 9 de diciembre de 2014 del mentado Servicio Nacional,
actualizó las áreas referidas e incorporó las áreas libres para la referida plaga.
Que la Resolución N° 731 del 13 de octubre de 2010 del mencionado Servicio Nacional, dispuso que el transporte
de carga vacío (en lastre) que egrese de las desmotadoras y centros de acopio de algodón en bruto, debe ser
desinsectado contra la citada plaga.
Que, asimismo, la Resolución N° 22 del 20 de enero de 2016 del referido Servicio Nacional, estableció el
mantenimiento del Registro Oficial de Desmotadoras, Hilanderías y Operadores Intermediarios de Algodón
oportunamente creado por el Artículo 1º de la Resolución N° 228 del 24 de julio de 2001, ampliada por su similar
Nº 218 del 23 de mayo de 2003, ambas del citado Servicio Nacional, denominándolo Registro Fitosanitario
Algodonero.
Que, en el mismo sentido, la mentada Resolución N° 22/16 en su Artículo 11 aprobó la implementación del
Documento de Tránsito Sanitario Vegetal (DTV), estableciendo los requisitos para realizar movimientos de
algodón y sus subproductos.
Que en el Artículo 19 de dicha norma se dispuso la obligatoriedad en el Territorio Nacional del encarpado total de
todo medio que transporte algodón en bruto, fibra, semilla, grano, cascarilla, fibrilla, linter de algodón y/o
desechos de desmote de algodón, cualquiera fuera su calidad y modalidad, de modo tal que no permita la pérdida
alguna de la carga.
Que dada la realidad actual de la plaga y la detección de nuevos focos en áreas no afectadas con anterioridad, se
advierte la necesidad de modificar el estatus fitosanitario de las zonas afectadas a fin de permitir la adopción de
las medidas pertinentes para lograr el control de la misma ante el nuevo estatus de la región.
�Que por el Decreto N° 434 del 1 de marzo de 2016, se aprobó el Plan de Modernización del Estado como el
instrumento mediante el cual se definen los ejes centrales, las prioridades y los fundamentos para promover las
acciones necesarias orientadas a convertir al Estado en el principal garante de la transparencia y del bien común.
Que dicho Plan de Modernización tiene entre sus objetivos constituir una Administración Pública al servicio del
ciudadano en un marco de eficiencia, eficacia y calidad en la prestación de servicios, a partir del diseño de
organizaciones flexibles orientadas a la gestión por resultados.
Que, asimismo, se plantea la necesidad de iniciar un proceso de eliminación y simplificación de normas en
diversos regímenes para brindar una respuesta rápida y transparente a los requerimientos del ciudadano.
Que, del mismo modo, el Decreto N° 891 del 1 de noviembre de 2017, aprobó las Buenas Prácticas en Materia de
Simplificación, aplicables para el funcionamiento del Sector Público Nacional, el dictado de la normativa y sus
regulaciones; propiciándose, entre otras medidas, la simplificación normativa, la mejora continua de los procesos,
la participación ciudadana y el silencio positivo.
Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete.
Que el suscripto es competente para dictar el presente acto en virtud de las facultades conferidas por los Artículos
4° y 8°, incisos e) y f) del Decreto N° 1.585 del 19 de diciembre de 1996, sustituido por su similar N° 825 del 10
de junio de 2010.
Por ello,
EL PRESIDENTE DEL SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA
RESUELVE:
ARTÍCULO 1°.- Artículo 18 de la Resolución N° 22 del 20 de enero de 2016 del SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. Sustitución. Se sustituye el Artículo 18 de la citada
Resolución N° 22/16, el que queda redactado de la siguiente manera: “ARTÍCULO 18.- Declaración de áreas para
la Plaga Picudo del Algodonero (Anthonomus grandis, Boheman). Se declaran las siguientes áreas de
conformidad con lo establecido por la Norma Internacional para Medidas Fitosanitarias (NIMF) N° 5 de la
Convención Internacional de Protección Fitosanitaria de la ORGANIZACIÓN DE LAS NACIONES UNIDAS
PARA LA ALIMENTACIÓN Y LA AGRICULTURA (FAO):
Inciso a) Área Bajo Cuarentena (ABC). Región comprendida por: la Provincia del CHACO determinada por los
Departamentos 1° de Mayo, Bermejo, Libertad, General Donovan, Libertador General San Martín, Sargento
Cabral, San Fernando, Presidencia de la Plaza, 25 de Mayo, Quitilipi, San Lorenzo, Tapenagá, General Güemes,
Maipú, Comandante Fernández, Independencia, General Belgrano, 9 de Julio, Chacabuco, 12 de Octubre, 2 de
Abril, Fray Justo Santa María de Oro, Mayor Jorge Luis Fontana, O’Higgins y Almirante Brown; la Provincia de
FORMOSA determinada por los Departamentos Patiño al Este de la Ruta Provincial N° 28, Pilagás, Pirané,
Pilcomayo, Formosa, Laishi; la Provincia de CORRIENTES determinada por el Departamento Sauce; y la
Provincia de SANTA FE determinada por el Departamento General Obligado.
�Inciso b) Área de Baja Prevalencia de la Plaga (ABPP). Región comprendida por: la Provincia de FORMOSA
determinada por los Departamentos Patiño al Oeste de la Ruta Provincial N° 28, Bermejo, Matacos y Ramón
Lista; la Provincia de CORRIENTES determinada por los Departamentos Goya, Lavalle, San Roque,
Concepción, San Miguel e Ituzaingó; la Provincia de SANTIAGO DEL ESTERO determinada por los
Departamentos Copo, Alberdi, Moreno, Juan Felipe Ibarra, Capital, Banda, Figueroa, Robles, Sarmiento, San
Martín y Silípica; y la Provincia de SANTA FE determinada por los Departamentos 9 de Julio, San Javier y Vera.
Inciso c) Área Libre de Plagas (ALP): región comprendida por: la Provincia de SALTA determinada por el
Departamento Anta; la Provincia de SAN LUIS determinada por los Departamentos Ayacucho y Junín; la
Provincia de ENTRE RÍOS determinada por el Departamento La Paz; la Provincia de CÓRDOBA determinada
por los Departamentos Cruz del Eje, Ischilín y San Javier; la Provincia de CATAMARCA determinada por el
Departamento Capayán; y la Provincia de LA RIOJA determinada por el Departamento San Martín.”.
ARTÍCULO 2°.- Artículo 18 bis de la Resolución N° 22 del 20 de enero de 2016 del SERVICIO NACIONAL
DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. Incorporación. Se incorpora como Artículo 18 bis de la
mentada Resolución N° 22/16, el siguiente: “ARTÍCULO 18 bis.- Prohibición de movimiento. Se prohíbe el
egreso de partidas de algodón en bruto, cascarilla y desechos/desperdicios de las desmotadoras desde Áreas Bajo
Cuarentena (ABC) y Áreas de Baja Prevalencia de Plagas (ABPP) hacia Áreas Libres de Plagas (ALP),
establecidas en la presente resolución, siendo obligatorio el desmote de algodón en bruto dentro de las áreas de
origen.”.
ARTÍCULO 3°.- Artículo 1° de la Resolución N° 731 del 13 de octubre de 2010 del SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. Sustitución. Se sustituye el Artículo 1° de la mencionada
Resolución N° 731/10, el que queda redactado de la siguiente manera: “ARTÍCULO 1°.- Se prohíbe el egreso de
partidas de fibra, fibrilla, grano, semillas, linter, maquinaria e implementos agrícolas, y transportes utilizados para
el traslado de algodón con carga y/o vacíos, y bolsas utilizadas para la cosecha de las Áreas Bajo Cuarentena
(ABC) y de las Áreas de Baja Prevalencia de Plagas (ABPP), establecidas por la Resolución N° 22 del 20 de
enero de 2016 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, hacia otras
zonas del país, sin el debido tratamiento químico de desinsectación contra la plaga del Picudo del Algodonero (
Anthonomus grandis, Boheman), conforme lo establecido en la presente.”.
ARTÍCULO 4°.- Abrogaciones. Se abrogan las Resoluciones Nros. 905 del 30 de noviembre de 2009 y 559 del 9
de diciembre de 2014, ambas del referido Servicio Nacional.
ARTÍCULO 5°.- Vigencia. La presente resolución entra en vigencia a partir del día siguiente al de su publicación
en el Boletín Oficial.
ARTÍCULO 6°.- Comuníquese, publíquese dese a la DIRECCIÓN NACIONAL DEL REGISTRO OFICIAL y
archívese.
�Digitally signed by NEGRI Ricardo Luis
Date: 2019.11.14 17:50:04 ART
Location: Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Ricardo Luis Negri
Presidente
Presidencia
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Digitally signed by GESTION DOCUMENTAL
ELECTRONICA - GDE
Date: 2019.11.14 17:50:08 -03:00
�
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resolución SENASA N° 1530/2019
Description
An account of the resource
Modifica Resoluciones SENASA N° 22/2016 y N° 731/2010 sobre Picudo del Algodonero
Creator
An entity primarily responsible for making the resource
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Source
A related resource from which the described resource is derived
<a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=331862">Resolución SENASA N° 1530/2019</a>
Date
A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource
Jueves 14 de Noviembre de 2019
Language
A language of the resource
Es
Type
The nature or genre of the resource
Resolución
Abstract
A summary of the resource.
Ante la necesidad de actualizar y simplificar la normativa y ante la realidad actual de la plaga y la detección de nuevos focos en áreas no afectadas con anterioridad, seintroducen modificaciones en el estatus fitosanitario de las zonas afectadas a fin de permitir la adopción de las medidas pertinentes para lograr el control de la misma ante el nuevo estatus de la región.
-
https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/b3ef31a2002a0eb3d42eafabd1cca03d.pdf
dcacbc97fff8b70e3dee03244fd6119b
PDF Text
Text
Dirección Nacional de Protección Vegetal
SANIDAD VEGETAL
Disposición 10/2005
Declárase zona de emergencia fitosanitaria al departamento de Presidencia de la
Plaza, de la provincia de Chaco, y el estado de alerta sanitaria a todos los
departamentos colindantes con el mencionado.
Bs. As., 18/7/2005
VISTO el Expediente CUDAP: EXP-S01:0174803/ 2005, la Ley 25.369, el Decreto Nº
2017 del 27 de febrero de 1957, las Resoluciones Nros. 219 del 27 de marzo de 2002, 679
del 12 de agosto de 2002, 224 del 5 de abril de 2005, todos del Registro del SERVICIO
NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, y
CONSIDERANDO:
Que mediante el trampeo y monitoreo de cultivos de algodón en la Provincia de CHACO,
realizado a través de la Red Oficial del Programa Nacional de Prevención y Erradicación
del Picudo del Algodonero, se ha detectado la presencia de la plaga denominada picudo del
algodonero (Anthonomus grandis B.) en el Departamento de Presidencia de la Plaza de la
mencionada provincia.
Que la detección de la Plaga Picudo del Algodonero implica riesgo fitosanitario para otros
Departamentos de la misma provincia y para otras provincias algodoneras, lo cual se ve
acrecentado por la elevada tasa de reproducción de este insecto en presencia de plantas de
algodón.
Que el transporte de algodón en bruto, fibra de algodón o semillas de algodón, sin
tratamiento previo con insecticidas, aumenta la posibilidad de la difusión masiva del
insecto, por lo que es necesario adoptar medidas fitosanitarias que eviten la dispersión de la
plaga.
Que la destrucción de los rastrojos es una medida eficiente para el control de plagas del
cultivo de algodón contemplada en el Artículo 2º inciso e) del Decreto Nº 2017/57.
Que los manuales que establecen los procedimientos para las situaciones de captura y
control de focos de Picudo del Algodonero han sido aprobado por las Resoluciones
SENASA Nros. 679/02 y 219/02 respectivamente.
Que el estado de emergencia que afecta al Departamento amerita la adopción de medidas
fitosanitarias excepcionales.
Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete.
�Que la presente disposición se dicta en ejercicio de las atribuciones conferidas por el
artículo 8º de la Resolución Nº 224 del 5 de abril de 2005 del SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA.
Por ello,
LA DIRECTORA NACIONAL DE PROTECCION VEGETAL
DISPONE:
Artículo 1º — Declárase zona de emergencia fitosanitaria al Departamento de Presidencia
de la Plaza, de la Provincia de CHACO.
Art. 2º — Declárase estado de Alerta Sanitaria a todos los Departamentos colindantes con
el mencionado en el Artículo 1º, adecuándose en ellos la red de monitoreo de la plaga para
tal fin.
Art. 3º — Solicítese a las autoridades de los municipios la adhesión a las medidas previstas
en la presente disposición a efectos de proveer la colaboración para la ejecución de las
mismas.
Art. 4º — Los productores del departamento de Presidencia de la Plaza deberán proceder
en forma inmediata a la destrucción de rastrojos de algodón, no pudiendo extender dicha
destrucción más allá de la fecha fijada anualmente a tal efecto.
Art. 5º — Prohíbese el egreso del Departamento Presidencia de la Plaza, partidas de
algodón en bruto, excepto que a través de la Dirección Nacional de Protección Vegetal se
fije un corredor fitosanitario por el cual se permita la circulación de las partidas de algodón
sin desmotar que cumplan con el tratamiento químico previo y otras medidas fitosanitarias
correspondientes al transporte, con el fin de minimizar los riesgos de dispersión de la plaga.
Art. 6º — Prohíbese el egreso del Departamento Presidencia de la Plaza, partidas de fibra,
semillas y otros subproductos de algodón, maquinaria agrícola así como también de las
bolsas utilizadas para la cosecha, sin tratamiento químico con insecticidas.
Art. 7º — Estas prohibiciones rigen por el plazo de SESENTA (60) días contados a partir
de la publicación de la presente Disposición, plazo que podrá ser extendido si el Programa
de Prevención y Erradicación del Picudo del Algodonero determina que las condiciones de
infestación así lo exigen.
Art. 8º — El incumplimiento de lo establecido en la presente disposición, hará pasible a los
infractores de las sanciones previstas en el artículo 18 del Decreto Nº 1585 del 19 de
diciembre de 1996.
Art. 9º — La presente disposición entrará en vigencia a partir de su publicación en el
Boletín Oficial.
�Art. 10. — Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y
archívese. — Diana M. Guillén.
�
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Disposición DNPV N° 0010/2005
Description
An account of the resource
Plaga Picudo del Algodonero. Declaración de de Emergencia Fitosanitaria
Creator
An entity primarily responsible for making the resource
Dirección Nacional de Protección Vegetal
Source
A related resource from which the described resource is derived
<a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=108323">Disposición DNPV N° 0010/2005</a>
Date
A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource
Lunes 18 de Julio de 2005
Language
A language of the resource
Es
Type
The nature or genre of the resource
Disposición
Abstract
A summary of the resource.
Se declara zona de emergencia fitosanitaria al Departamento de Presidencia de la Plaza, de la Provincia de Chaco, y el estado de alerta sanitaria a todos los departamentos colindantes con el mencionado.
-
https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/3d2c5f81ca1f492b5eaa6f1634bd58eb.pdf
60329ef5915741f79dce88edac563172
PDF Text
Text
�����������������������������������
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resoluciones SENASA
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resolución SENASA N° 0058/2001
Description
An account of the resource
Establece la regionalización del territorio nacional a los efectos de la vigilancia, prevención, control, limitación y erradicación de la fiebre aftosa.
Creator
An entity primarily responsible for making the resource
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Source
A related resource from which the described resource is derived
<a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do;jsessionid=ED1B15E4737142B2276A9D2C86411DBF?id=67156">Resolución SENASA N° 0058/2001</a>
Date
A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource
Jueves 24 de Mayo de 2001
Language
A language of the resource
Es
Type
The nature or genre of the resource
Resolución
Abstract
A summary of the resource.
Establece la regionalización del territorio nacional a los efectos de la vigilancia, prevención, control, limitación y erradicación de la fiebre aftosa.
Is Replaced By
A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource.
<strong>Abrogada por<span> el Art. 6 de la</span> <a href="https://digesto.senasa.gob.ar/items/show/901">Resolucion N° 180/2025 de SENASA</a></strong>
-
https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/0446d8f70a38125b09cf02c5cf1a2400.pdf
13f525ed4b521127a4ff168b828bf605
PDF Text
Text
����������
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resoluciones SENASA
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resolución SENASA N° 0249/2016
Description
An account of the resource
Se establecen los requisitos de ingreso de animales de especies susceptibles a la Fiebre Aftosa desde la Patagonia Norte A hacia la Patagonia Norte B y Sur.
Creator
An entity primarily responsible for making the resource
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Source
A related resource from which the described resource is derived
<a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=261407">Resolución SENASA N° 0249/2016</a>
Date
A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource
Jueves 12 de Mayo de 2016
Language
A language of the resource
Es
Type
The nature or genre of the resource
Resolución
Abstract
A summary of the resource.
Se establecen los requisitos de ingreso de animales de especies susceptibles a la Fiebre Aftosa desde la Patagonia Norte A hacia la Patagonia Norte B y Sur.
Is Replaced By
A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource.
<strong>Abrogada por<span> el Art. 6 de la</span> <a href="https://digesto.senasa.gob.ar/items/show/901">Resolucion N° 180/2025 del SENASA</a></strong>
-
https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/069fa80bbb09fb9f405765b4080957cc.pdf
0d5010692eb91b6bc55aa61768775872
PDF Text
Text
República Argentina - Poder Ejecutivo Nacional
AÑO DE LA RECONSTRUCCIÓN DE LA NACIÓN ARGENTINA
Resolución
Número: RESOL-2025-186-APN-PRES#SENASA
CIUDAD DE BUENOS AIRES
Martes 18 de Marzo de 2025
Referencia: EX-2025-09492695- -APN-DGTYA#SENASA - PRORROGA LA ENTRADA EN VIGENCIA DE
LA RESOLUCIÓN Nº RESOL-2025-180-APN-PRES#SENASA
VISTO el Expediente N° EX-2025-09492695- -APN-DGTYA#SENASA; las Resoluciones Nros. RESOL-20231259-APN-PRES#SENASA del 4 de diciembre de 2023 y RESOL-2025-180-APN-PRES#SENASA del 17 de
marzo de 2025, ambas del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, y
CONSIDERANDO:
Que a través de la Resolución N° RESOL-2025-180-APN-PRES#SENASA del 17 de marzo de 2025 del
SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA se establecen las condiciones
sanitarias para el ingreso de material reproductivo, carnes y productos cárnicos de animales susceptibles a la
Fiebre Aftosa, desde las Zonas Libres de Fiebre Aftosa con vacunación con destino a las Zonas Libres de Fiebre
Aftosa sin vacunación, ambas de la REPÚBLICA ARGENTINA, reconocidas por la ORGANIZACIÓN
MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL (OMSA).
Que, asimismo, por el Artículo 2° de la citada norma se dispone que la misma comenzará a regir a partir de su
publicación en el Boletín Oficial.
Que mediante la Resolución N° RESOL-2023-1259-APN-PRES#SENASA del 4 de diciembre de 2023 del
aludido Servicio Nacional se establece, a los fines de la vigilancia, la prevención y el control de la Fiebre Aftosa,
la zonificación del Territorio Nacional.
Que, por consiguiente, la Región Patagónica se integra por las Provincias de RÍO NEGRO, del NEUQUÉN, del
CHUBUT, de SANTA CRUZ y de TIERRA DEL FUEGO, ANTÁRTIDA E ISLAS DEL ATLÁNTICO SUR, y
del Partido de Patagones de la Provincia de BUENOS AIRES.
Que las provincias que integran la Región Patagónica han realizado consultas y pedidos relacionados con la
temática de la mentada Resolución N° RESOL-2025-180-APN-PRES#SENASA.
�Que, en consecuencia, a fin de dar respuesta respecto de los alcances y la coordinación de acciones tendientes a la
implementación de las medidas establecidas en la mencionada Resolución N° RESOL-2025-180-APNPRES#SENASA, deviene necesario conformar una mesa de diálogo y de trabajo integrada por representantes de
dichas jurisdicciones.
Que la Dirección Nacional de Sanidad Animal y sus Direcciones dependientes, como así también la Dirección
Nacional de Inocuidad y Calidad Agroalimentaria, han tomado debida intervención.
Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete.
Que el suscripto es competente para dictar la presente medida en virtud de lo dispuesto en el Artículo 8º, incisos
e) y f), del Decreto Nº 1.585 del 19 de diciembre de 1996 y sus modificatorios.
Por ello,
EL PRESIDENTE DEL SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA
RESUELVE:
ARTÍCULO 1°.- Prórroga. Se prorroga por NOVENTA (90) días corridos la entrada en vigencia de la Resolución
N° RESOL-2025-180-APN-PRES#SENASA del 17 de marzo de 2025 del SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA.
ARTÍCULO 2°.- Invitación. Se invita a los gobernadores de las provincias que integran la Región Patagónica
(Provincias de RÍO NEGRO, del NEUQUÉN, del CHUBUT, de SANTA CRUZ, de TIERRA DEL FUEGO,
ANTÁRTIDA E ISLAS DEL ATLÁNTICO SUR y de BUENOS AIRES) y entidades representativas del sector
agropecuario a la Mesa de Diálogo y Trabajo, la cual funcionará en el ámbito de la SECRETARÍA DE
AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA del MINISTERIO DE ECONOMÍA, en la que se trabajarán
conjuntamente los alcances y la coordinación de acciones tendientes a la implementación de las medidas
establecidas en la citada Resolución N° RESOL-2025-180-APN-PRES#SENASA.
ARTÍCULO 3°.- Vigencia. La presente resolución entra en vigencia a partir de su publicación en el Boletín
Oficial.
ARTÍCULO 4°.- Comuníquese, publíquese, dese a la DIRECCIÓN NACIONAL DEL REGISTRO OFICIAL y
archívese.
�Digitally signed by CORTESE Pablo Luis
Date: 2025.03.18 17:31:11 ART
Location: Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Pablo Cortese
Presidente
Presidencia
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Digitally signed by GESTION DOCUMENTAL
ELECTRONICA - GDE
Date: 2025.03.18 17:31:22 -03:00
�
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resoluciones SENASA
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resolución SENASA N° 0186/2025
Description
An account of the resource
Se prorroga por NOVENTA (90) días corridos la entrada la Resolución N°180/2025 del SENASA.
Creator
An entity primarily responsible for making the resource
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Abstract
A summary of the resource.
Se prorroga por NOVENTA (90) días corridos la entrada en vigencia de la <a href="https://digesto.senasa.gob.ar/items/show/901">Resolución N°180/2025</a> del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA.
Source
A related resource from which the described resource is derived
<a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do;jsessionid=44A1E151BC483E9271B57392497A3AE7?id=410754">Resolución SENASA N° 0186/2025</a>
Date
A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource
Martes 18 de Marzo de 2025
Language
A language of the resource
Es
Type
The nature or genre of the resource
Resolución
Is Replaced By
A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource.
<strong>Abrogada por artículo 6° de la <a href="https://biblioteca.senasa.gob.ar/items/show/7225">Resolución N° 460/2025 del SENASA</a></strong>
-
https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/5b5bbb1b837ae9d40e3373f9f8d94467.pdf
6e233efc1a0bf67307a3f822a1d42644
PDF Text
Text
�����
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Secretaría de Agricultura y Ganadería
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resolucion SAyG N° 1352/1967
Description
An account of the resource
Reglamenta el Decreto 9244/63 en lo referente a frutas secas.
Creator
An entity primarily responsible for making the resource
Secretaría de Agricultura y Ganadería
Source
A related resource from which the described resource is derived
<a href="http://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=157438">Resolucion SAyG N° 1352/1967</a>
Date
A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource
Martes 14 de Noviembre de 1967
Language
A language of the resource
Es
Type
The nature or genre of the resource
Resolución
Abstract
A summary of the resource.
Aprueba, como reglamentación del Decreto-Ley N° 9.244/63, en lo referente a frutas secas destinadas al mercado interno y a la exportación, el texto anexo.
Is Replaced By
A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource.
<strong>Abrogada por el Art. 18 de la <a href="https://biblioteca.senasa.gob.ar//items/show/4423#?c=0&m=0&s=0&cv=0">Resolucion N° 22/2025 de la Secretaria de Agricultura, Ganaderia y Pesca </a></strong>
-
https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/e2cb337bc99d48ac0b51f8a384949dd9.pdf
9983045d49c79284f0ffa7734f96734e
PDF Text
Text
DECRETO N° 4830/73
RESUMEN: Decreto reglamentario de la Ley 20.466
BUENOS AIRES, 23 de mayo de 1973.
VISTO el expediente N° 75.250/73 por el cual el MINISTERIO DE AGRICULTURA
Y GANADERIA propone las normas reglamentarias de la Ley N° 20.466 que
prescribe el contralor de la producción y comercialización de fertilizantes y
enmiendas y
CONSIDERANDO:
Que es necesario fijar las normas a que deberá ajustarse la elaboración,
distribución, fraccionamiento, importación, exportación, y venta de fertilizantes y
enmiendas.
Que corresponde establecer las características que deben reunir estos insumos y la
forma en que se ha de realizar el contralor de los mismos, por considerárselo
factores preponderantes para la economía agropecuaria.
Que es imprescindible dictar las normas de orden técnico y administrativo, en
salvaguardia de los intereses de los usuarios de fertilizantes y enmiendas.
Que deben establecerse los aranceles a que estarán sujetas las solicitudes de
inscripción, reinscripción, inspección y certificación de los productos antes
mencionados.
Por ello, de acuerdo a lo propuesto por el señor Ministro de Agricultura y Ganadería
EL PRESIDENTE DE LA NACION ARGENTINA
DECRETA:
ARTICULO 1°.- EL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA será el órgano
de aplicación de la Ley N° 20.466.
ARTICULO 2°.- Los fertilizantes y enmiendas que se elaboren, fraccionen, vendan,
importen o exporten estarán sujetos al requisito de la certificación de aptitud para
su empleo como tales, registro y control de calidad, a cargo de los servicios
técnicos del MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA, conforme lo
establezca la reglamentación que este organismo dicte.
Sin perjuicio de lo dispuesto precedentemente, los fertilizantes y enmiendas
destinados a la exportación deberán ser inspeccionados y certificados previamente
al otorgamiento de la respectiva autorización de embarque. Igualmente serán
inspeccionadas y certificadas, previamente a su despacho a plaza, todas las
partidas de fertilizantes y enmiendas que se importen.
ARTICULO 3°.- Se considera FERTILIZANTE a toda sustancia o mezcla de
sustancias que incorporada al suelo o aplicada sobre la parte aérea de las plantas,
suministre el o los elementos que requieren los vegetales para su nutrición, con el
propósito de estimular su crecimiento, aumentar su productividad y mejorar la
calidad de las cosechas.
�Estas sustancias podrán ser de carácter mineral u orgánico y deberán contener
elementos nutrientes primarios: NITROGENO, FOSFORO, o POTASIO; o
elementos nutrientes secundarios; CALCIO, MAGNESIO o AZUFRE o elementos
menores o micronutrientes: BORO, CINC, COBRE, HIERRO, MOLIBDENO,
MANGANESO, etc. susceptibles de ser aplicadas en forma capaz de ser asimiladas
por los vegetales.
Con la denominación de "Fertilizante Simple" se considera a aquel constituido por
una sola sustancia aunque ésta posea uno o más elementos nutrientes en su
molécula.
Con la denominación de "Fertilizantes Compuestos" se considera a la mezcla de
DOS (2) o más fertilizantes simples.
Con la denominación de "Fertilizante Foliar" se consideran aquellas sustancias o
mezclas de sustancias solubles en agua que posean elementos nutrientes
susceptibles de ser asimilados y se apliquen directamente sobre la parte aérea de
los vegetales.
ARTICULO 4°.- Se considera "ENMIENDA" a toda sustancia o mezcla de
sustancias de carácter mineral u orgánico, que incorporada al suelo modifique
favorablemente sus caracteres físicos o físico químicos, sin tener en cuenta su
valor como fertilizante, como ser: yeso, cales, azufre, dolomita, turba y toda otra
sustancia o mezcla, que el MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA
considere apropiado incluirla en esta denominación.
ARTICULO 5°.- EL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA por
intermedio de su Servicio especializado llevará el Registro Nacional en el cual
deberán inscribirse las personas físicas o jurídicas que fabriquen, importen,
exporten, fraccionen o distribuyan fertilizantes o enmiendas; dicho servicio también
llevará el Registro Nacional de todos los productos que se fabriquen, importen,
exporten, fraccionen o vendan, para de esta forma dar cumplimiento al artículo 3°
de la Ley 20.466.
ARTICULO 6°.- Las personas físicas o jurídicas que elaboren, importen o
fraccionen fertilizantes inscriptos en el registro a que se refiere el artículo anterior,
deberán contar con un servicio técnico a cargo de un Ingeniero Agrónomo
matriculado, responsable del equilibrio de las fórmulas y valor agronómico de las
mismas.
ARTICULO 7°.- Para inscribir un producto es necesario presentar el certificado de
aptitud, el cual será otorgado por el Servicio especializado del MINISTERIO DE
AGRICULTURA Y GANADERIA previo análisis del producto sobre la muestra
presentada a tal fin.
ARTICULO 8°.- Las inscripciones de los productos deberán efectuarse anualmente
y vencen el 31 de diciembre de cada año, pudiendo renovarse o reinscribirse
indefinidamente a partir del 1° de enero al 30 de abril de cada año.
�Al realizar la inscripción o reinscripción de cada producto se deberá presentar una
muestra del mismo con el objeto de comprobar si su contenido responde a lo
declarado.
ARTICULO 9°.- La inscripción de los productos se hará con carácter de declaración
jurada en la que se consignará:
a) Composición química y/o bioquímica, expresada en porcentaje en peso.
b) Estado de agregación, cuando corresponda.
c) Origen.
d) Instrucciones para su uso.
e) Precauciones y restricciones para su empleo.
f) Fecha de vencimiento si el producto fuera alterable.
En caso que el producto sea un fertilizante se indicará además:
1°.- Contenido de nutrientes expresado en porcentaje en peso de elementos.
2°.- Si es neutro, formador de ácido o álcali y su respectivo índice.
ARTICULO 10.- En los fertilizantes el contenido de elementos nutrientes primarios
se permitirá expresarlo en grados, entendiéndose por grado el porcentaje en peso
como elemento, en unidades y medias unidades de: NITROGENO total, FOSFORO
asimilable y POTASIO soluble en agua.
ARTICUTO 11°.- EL MINISTERIO DE COMERCIO no dará curso a las solicitudes
de aprobación de marbete o impresión de fertilizantes y enmiendas de acuerdo a la
Ley N° 20.466, su decreto reglamentario y disposiciones complementarias.
Otorgase un plazo de UN (1) año a partir de la publicación del presente decreto,
para dar cumplimiento a los requisitos de la Ley N° 20.466 y su reglamentación en
lo que a marbete o impresión se refiere.
ARTICULO 12°.- En fertilizantes "formadores de ácido", en el marbete o impresión
debe constar el "índice de acidez" y en los "formadores de base o alcalinos" el
"índice de basicidad".
ARTICULO 13°.- En la comercialización de fertilizantes a granel, los envíos deberán
ser comunicados al MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA con CINCO
(5) días hábiles de antelación, con el objeto de proceder a la extracción de
muestras y tomar las providencias necesarias para asegurar la calidad del producto
hasta su destino, de acuerdo a las condiciones que se fijen por Resolución del
MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA.
ARTICULO 14°.- Para verificar el cumplimiento de los requisitos de la mencionada
Ley, su decreto reglamentario y demás disposiciones, el MINISTERIO DE
AGRICULTURA Y GANADERIA por intermedio de sus agentes autorizados tendrá
acceso a cualquier predio público o privado durante las horas comerciales con el
objeto de proceder a la extracción de muestras de fertilizantes y enmiendas, en
todo el territorio de la República; el método de muestreo y demás modalidades se
establecerán por resolución del MINISTERIO DE AGRICULTURA Y. GANADERIA.
�ARTICULO 15°.- Los fertilizantes orgánicos como ser estiércol, compost, etc., y
enmiendas orgánicas no sometidas a manipulación industrial quedan exentos del
cumplimiento de los requisitos del presente decreto y su venta bajo análisis es
optativa. No se podrá hacer referencia a su composición química o bioquímica o
elementos nutrientes sin haberlos sometido a análisis previos.
ARTICULO 16°.- Las personas jurídicas o físicas inscriptas en el Registro
establecido en el Artículo 5° del presente decreto deberán informar bajo declaración
jurada durante el mes de junio de cada año, al servicio especializado del
MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA de acuerdo a las normas que
para tal efecto se dicten, un resumen anual de la producción y comercio de
fertilizantes y enmiendas.
Los establecimientos frigoríficos, fábricas, depósitos, etc., que produzcan o vendan
subproductos de la ganadería o agricultura o recolección de residuos, destinados a
la preparación de fertilizantes o enmiendas o a su empleo como tales deberán
cumplir con los requisitos exigidos en el apartado anterior.
ARTICULO 17°.- De acuerdo al Artículo 8° de la Ley N° 20 466, por resolución del
MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA se fijaran los márgenes de
tolerancia para los alimentos, componentes y estado de agregación de los
fertilizantes y enmiendas como así también para las sustancias nocivas que
contengan. Asimismo se determinará la intervención que corresponda en caso de
arbitraje.
ARTICULO 18°.- EL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA podrá
realizar ensayos con fertilizantes o enmiendas y estudios agrotécnicos que crea
necesario para establecer su valor agronómico, en función del suelo, clima, cultivo y
asesorar a los agricultores sobre el uso racional de estos productos.
ARTICULO 19°.- EL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA adoptará las
medidas necesarias para limitar y aun prohibir la aplicación de aquellos fertilizantes
y enmiendas que se consideren no apropiados para determinadas regiones o
cultivos.
ARTICULO 20°.- EL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA asesorará
sobre el carácter de fertilizante o enmienda a los efectos de la liberación de los
derechos de importación de los productos que se introduzcan al país, destinados
exclusivamente a ser utilizados como tales.
ARTICULO 21°.- Toda persona que importe, exporte, elabore, o distribuya
productos fertilizantes y/o enmiendas abonará los siguientes aranceles en concepto
de:
INSCRIPCION DE LA PERSONA FISICA O JURIDICA
Certificado de aptitud de un fertilizante
$200.Certificado de aptitud de una enmienda
$160.Inscripción de un fertilizante o enmienda
$100.-
$400.-
�Reinscripción de un fertilizante
$ 80.Reinscripción de una enmienda
$ 50.Inspecciones, exportación e importación......
$ 40.Análisis por servicios particulares por
determinación
$ 20.Todos los análisis serán realizados por el MINISTERIO DE AGRICULTURA Y
GANADERIA.
ARTICULO 22°.- Los gastos que demanden los análisis de verificación o
fiscalización de los productos inscriptos están incluidos en el arancel de inscripción
del producto. Todo otro análisis realizado a pedido de personas, productores, o
expendedores con el objeto de conocer la composición de determinada muestra o
producto estará sujeto al arancel fijado en el artículo anterior.
ARTICULO 23°.- Todas las infracciones al presente decreto o a las disposiciones
establecidas en los mismos serán reprimidas de acuerdo al Artículo 13 de la Ley N°
20.466.
ARTICULO 24°.- El presente decreto comenzará a regir, a partir de la fecha de la
publicación.
ARTICULO 25°.- Derógase el Decreto N° 14.407 de fecha 9 de setiembre de 1955,
y los demás en cuanto se opongan al presente decreto.
ARTICULO 26°.- Comuníquese, publíquese, dese a la Dirección Nacional del
Registro Oficial y vuelva al MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA,
DECRETO N° 4830
�
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Decretos
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Decreto N° 4830/1973
Description
An account of the resource
Fiscalización de fertilizantes y enmiendas. Reglamentación de la Ley N° 20466
Source
A related resource from which the described resource is derived
<a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=200202">Decreto N° 4830/1973</a>
Date
A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource
Miércoles 23 de mayo de 1973
Abstract
A summary of the resource.
Los fertilizantes y enmiendas que se elaboren, fraccionen, vendan, importen o exporten, estarán sujetos al requisito de la certificación de aptitud para su empleo como tales, registro y control de calidad, a cargo de los servicios técnicos del Ministerio de Agricultura y Ganadería, conforme lo establezca la reglamentación que este organismo dicte.
Is Replaced By
A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource.
<strong>Abrogada por el Art. 11 del <a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=409638">Decreto N° 101/2025 del Poder Ejecutivo Nacional</a></strong>
Language
A language of the resource
Es
Type
The nature or genre of the resource
Decreto
-
https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/39dd1833ac756eae39d3ff2b017fe40c.pdf
580cb04112f0314058bcc462b2431d2d
PDF Text
Text
MANUAL DE PROCEDIMIENTO
Diagnóstico serológico
de brucelosis
(B. abortus, B. melitensis, B. suis)
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa)
Edición 2025
�El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado,
responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal
y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento
de la normativa vigente en la materia.
Equipos de trabajo
Coordinación de Bacteriología
Dirección de Laboratorio Animal
Dirección General de Laboratorios y Control Técnico
Coordinación General de Comunicación Institucional
Edición 2025
�Índice
Introducción
6
Objetivos
6
Abreviaturas y definiciones
6
Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio
7
Principios de bioseguridad
7
Prácticas operativas seguras y hábitos personales
8
Limpieza y desinfección del laboratorio
10
Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos)
10
Aseguramiento de la calidad en el laboratorio
10
Control de calidad de insumos
11
Equipos
13
Sobre la enfermedad
13
Descripción de la enfermedad
14
Infección por Brucella en ganado bovino
14
Infección por Brucella en ovejas y cabras
15
Infección por Brucella en cerdos
15
Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes
16
en cautiverio o en libertad
Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad
Técnicas de diagnóstico
Pruebas serológicas
Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis
en el laboratorio de red
17
18
18
20
�Registro de entrada de muestras
20
Características y condiciones de las muestras
21
Condiciones de recepción de las muestras
21
Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las
21
muestras
Informes de resultados
Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT)
22
23
para la detección de anticuerpos contra Brucella spp
Desarrollo
23
Ejecución del ensayo de BPAT
23
Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala
24
Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de scree-
25
ning con antígeno tamponado en placa
Informes de resultados
Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME)
25
26
Desarrollo
26
Ejecución del ensayo
27
Incubación
28
Lectura e interpretación de resultados
28
Informes de resultados
30
Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME
31
Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos
31
Desarrollo
32
Toma de la muestra
33
Ejecución del ensayo
33
Lectura
33
Modificación de la prueba para tanques muy grandes
34
Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche)
34
Etapas
35
Desarrollo
36
�ELISA por competición / bloqueo
Desarrollo
Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos
38
38
41
contra brucella en suero
Desarrollo
42
Ejecución del ensayo
42
Lectura e interpretación
43
Fijación de complemento
44
Desarrollo
44
Manejo y conservación de las muestras
45
Condiciones del ensayo
46
Ejecución
46
Lectura de resultados
48
Anexos
52
Bibliografía
68
�Introducción
El presente manual está dirigido a profesionales que se desempeñan en la
Red de Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab) respecto a las técnicas
relacionadas con el diagnóstico serológico de brucelosis. Estas técnicas son
internacionalmente reconocidas y recomendadas por la Organización Mundial
de Sanidad Animal (OMSA) y el Senasa.
Objetivos
• Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los laboratorios que
realizan el diagnóstico serológico de la brucelosis en diferentes especies animales inscriptos en la Redlab.
• Proporcionar a la Redlab un instrumento que facilite el desarrollo adecuado,
sistematizado y estandarizado de los procedimientos técnicos que se realizan
en los laboratorios.
• Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de
calidad que deben cumplirse cuando se desarrolle un procedimiento técnico.
• Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo
de las actividades del laboratorio.
Abreviaturas y definiciones
• Ag: Antígeno
• Biovariedad: bv
• BPAT (Buffered plate antigen test): Aglutinación con antígeno bufferado en
placa
• CELISA: Enzimoinmunoensayo competitivo
• C’: Complemento de cobayo
• DGLYCT: Dirección General de Laboratorios y Control Técnico
• DLA: Dirección de Laboratorio Animal
• DNSA: Dirección Nacional de Sanidad Animal
• DT: Dilución de Trabajo
• ELISA: Enzimoinmunoensayo
• FCT: Fijación de Complemento Test
• FPA: Ensayo de Polarización Fluorescente
• GR: Glóbulos Rojos
• IELISA: Enzimoinmunoensayo Indirecto
• IgG: Inmunoglobulina G
• IgM: Inmunoglobulina M
• LPS: Lipopolisacárido
• 2-ME: 2- Mercaptoethanol
• M: Molar
• mP: milipolarización
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
6
�• MRT (PAL): Prueba de anillo en leche
• OMSA: Organización Mundial de Sanidad Animal
• PAC: Poder anticomplementario
• RBT: Rosa de Bengala Test
• Renspa: Registro Nacional de Productores Agropecuarios
• SAT: Seroaglutinación lenta en tubo
• SB: Solución Buffer
• Senasa: Servicio de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
• SH: Sistema Hemolítico
• UI/ml: Unidades Internacionales por mililitro
• UIFCT/ml: Unidad Internacional fijadora del complemento Test por mililitro
• UA: Unidad de Antígeno
• UC: Unidad de Complemento
• UH: Unidad de Hemolisina
Medidas generales de bioseguridad y seguridad en
el laboratorio
Se entiende por bioseguridad: La disciplina que trata el manejo seguro y la
contención de microorganismos infecciosos y materiales biológicos peligrosos. La práctica del manejo seguro de microorganismos patógenos y sus toxinas en el laboratorio biológico se realiza a través de la aplicación de los
principios de contención y la evaluación de riesgos.
Principios de bioseguridad
El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales infecciosos en el medio ambiente del laboratorio, donde son
manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar
la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.
Contención primaria: la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos es provista tanto
mediante buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de Equipos
de Protección Personal (EPP) de seguridad adecuados. La aplicación de vacunas al personal cuando corresponda puede brindar un mayor nivel de protección del personal.
Contención secundaria: la protección del medioambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos se logra a través de una combinación del diseño de la instalación y prácticas operativas.
Por lo tanto, los elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del
riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos.
Prácticas y técnicas de laboratorio: el elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
7
�estándares. Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales
potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales, y también
deben estar capacitados y ser expertos en las prácticas y técnicas requeridas
para manipular dichos materiales en forma segura.
Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o
puedan producirse, y que especifique las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se debe alertar
al personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las prácticas y procedimientos requeridos. El personal capacitado y bien
informado acerca de las técnicas de laboratorio adecuadas, procedimientos
de seguridad y riesgos asociados a la manipulación de agentes infecciosos
debe ser el responsable de la conducción de los trabajos con cualquier agente o material infeccioso. Esta persona tiene la obligación de consultar a profesionales especializados en bioseguridad u otros profesionales de la salud y
seguridad respecto de la evaluación del riesgo.
Cuando las prácticas de laboratorio estándares no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o a un procedimiento de laboratorio
particular, quizás sea necesario aplicar medidas adicionales. El director del
laboratorio es responsable de seleccionar prácticas de seguridad adicionales, que deben guardar relación con los riesgos relacionados con el agente o
procedimiento.
El director o la persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar
la capacitación adecuada del personal.
Prácticas operativas seguras y hábitos personales
• Limitar o restringir el acceso al laboratorio.
• Diseñar el laboratorio para que su limpieza sea sencilla. Las superficies de las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y ser
resistentes al calor moderado y a solventes orgánicos, ácidos, álcalis y
productos químicos utilizados para descontaminar la superficie de trabajo y los equipos.
• Seleccionar muebles de laboratorio con capacidad de soportar cargas
y usos previstos. Los espacios entre las mesas de trabajo, gabinetes y
equipos deben ser accesibles para su limpieza.
• Cada laboratorio debe contener una pileta para el lavado de manos.
• Adecuar la iluminación para todas las actividades, evitando los reflejos y el brillo que pueda molestar la visión.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
8
�• Proveer mosquiteros para las ventanas del laboratorio que se abren
hacia el exterior (en lo posible deberían ser fijas).
• Usar ambos, delantales, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados durante la permanencia en el mismo. Retirar y dejar
esta ropa de protección en el laboratorio antes de dirigirse a otras áreas
(por ejemplo, cafetería, biblioteca, oficinas administrativas); además,
usar calzado cerrado y cabello recogido.
• Es obligatorio el uso de guantes cuando es probable que las manos
entren en contacto con materiales infecciosos, superficies o equipos
contaminados (puede ser apropiado el uso de dos pares de guantes).
Descartar los guantes cuando están contaminados y retirarlos cuando se completa el trabajo con los materiales infecciosos o cuando está
comprometida la integridad del guante. Los guantes descartables no
se lavan, no se vuelven a usar, ni se utilizan para tocar superficies “limpias” (teclados, teléfonos, picaportes, entre otros), y no se deben usar
fuera del laboratorio.
• No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar alimentos para uso humano en áreas de
trabajo.
• Utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos. Las personas que usan lentes de contacto en laboratorios deben también utilizar antiparras o un protector facial.
• Lavarse las manos luego de manipular materiales viables, luego de
quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio. (Ver Anexo I).
• Almacenar los alimentos fuera del área de trabajo en gabinetes o refrigeradores designados y utilizados con este único fin.
• Está prohibido pipetear con la boca: utilizar dispositivos de pipeteo
mecánicos. Aplicar políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes.
• Llevar a cabo todos los procedimientos con precaución a fin de minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles.
• Descontaminar las superficies de trabajo como mínimo una vez por
día, luego de finalizar las tareas y ante todo derrame de material viable.
• Descontaminar todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados antes de ser desechados mediante un método aprobado, como
por ejemplo, mediante autoclave. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato son colocados en un recipiente
duradero, estanco y cerrado para su transporte desde el laboratorio.
Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de conformidad con las normas locales, estatales
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
9
�y federales aplicables antes de retirarlos del establecimiento de acuerdo a las indicaciones de la Ley 24.051 de Residuos Peligrosos.
• El laboratorio debe tener las hojas de seguridad1 de cada sustancia
química que utiliza en formato impreso y capacitar al personal sobre
las mismas.
Limpieza y desinfección del laboratorio
Todo laboratorio debe tener un programa con métodos de limpieza y desinfección bien definidos para disminuir los riesgos de contaminación con materiales peligrosos acorde a las características del lugar y volumen de trabajo.
La limpieza de los laboratorios incluye a los equipos, mesas de trabajo, heladeras, freezer, aberturas, etc. Dentro de la limpieza se debe incluir el control
de insectos y roedores.
Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos)
El laboratorio debe elaborar un procedimiento de la manipulación, clasificación y descarte de los residuos peligrosos ya que pueden causar daño, directa o indirectamente a seres vivos o contaminar el suelo, el agua, la atmósfera
o el ambiente en general.
Se consideran residuos patológicos/químicos al material biológico de diversos orígenes que puede no tener características infecciosas pero sí de toxicidad. Un residuo se considera tóxico cuando es capaz de, a determinadas
dosis, provocar una acción química o químico-física que cause daño en la
salud, luego de estar en contacto con la piel o las mucosas o de haber penetrado en el organismo por cualquier vía.
Los residuos serán acumulados en recipientes colocados convenientemente
y en cantidad suficiente en el lugar de generación de los mismos.
Los mismos se podrán tratar mediante los siguientes métodos: incineración,
enterramiento por relleno de seguridad, esterilización por autoclave, ya sea
por el mismo laboratorio o por empresas dedicadas a ese fin. Se ajustará a la
normativa establecida por la jurisdicción donde se encuentra el laboratorio.
Aseguramiento de la calidad en el laboratorio
Se debe cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (buenas prácticas de laboratorio), requisitos particulares del Senasa y la Norma
ISO/IEC 17025 (última versión vigente) según la categoría del laboratorio.
Es un documento que indica las particularidades y propiedades de una determinada sustancia para su uso más adecuado (en inglés, Material Safety Data
Sheet o MSDS). El principal objetivo de esta hoja es proteger la integridad física del operador durante la manipulación de la sustancia. Esta hoja o ficha
contiene las instrucciones detalladas para su manejo y persigue reducir los riesgos laborales y medioambientales.
1
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
10
�Para que los resultados del diagnóstico sean uniformes, confiables y trazables, deben efectuarse siguiendo técnicas estandarizadas, con operadores
capacitados en la realización e interpretación de los resultados, utilizando
equipos y reactivos controlados.
Los procedimientos de laboratorio están sujetos a múltiples causas de error
que deben ser detectados para poder aplicar correcciones o acciones correctivas.
Los procedimientos se pueden monitorear mediante controles internos con la
utilización diaria de sueros controles internos con títulos conocidos; mientras
que el control externo –que se refiere al realizado por un laboratorio de referencia– se puede hacer mediante auditorías que revisen los métodos analíticos, la organización del trabajo del laboratorio y los procedimientos de control
de calidad internos implementados.
Respecto a la participación en ensayos interlaboratorios, los mismos deben
ser provenientes de organismos reconocidos y programas de ensayos de aptitud. Se deben mantener documentados los resultados y, en caso de obtener
resultados no satisfactorios, implementar las acciones correctivas pertinentes para su seguimiento y cierre.
Del mismo modo podrán utilizarse otras herramientas a los fines de garantizar el desempeño adecuado y asegurar la calidad de los resultados de ensayo,
como la confección de gráficos de control2.
El control permanente de la calidad de los resultados junto con las buenas
prácticas de laboratorio que incluye la utilización de técnicas evaluadas, personal capacitado y operaciones estandarizadas, garantiza el resultado confiable del diagnóstico.
Control de calidad de insumos
Todos los insumos y reactivos que se utilizan en el laboratorio deben ser establecidos con fórmulas y procedimientos detallados en manuales disponibles
en el área de trabajo.
La composición, el tipo de envase, la identificación y el lugar de almacenamiento deben ser los indicados en los manuales. No introducir cambios que
no estén registrados y autorizados por el responsable del laboratorio.
Todos los insumos y materiales de referencia deben cumplir
con las especificaciones registradas.
2
Diagrama que sirve para examinar si un proceso se encuentra en una condición estable, o para asegurar que se mantenga en esa condición.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
11
�Los reactivos biológicos que se emplean en las técnicas de ensayo deben
utilizarse de acuerdo a las especificaciones del manual de procedimientos
operativos correspondiente, respetando las indicaciones para la conservación, almacenamiento y titulación.
Los reactivos para el diagnóstico de brucelosis que se comercializan en la
República Argentina, deben cumplir la normativa vigente del Senasa y aprobar el control de calidad de cada lote o serie indicado en la estampilla correspondiente. Se debe llevar un registro de cada lote de antígeno/kit que
se utiliza con la fecha de uso.
En los laboratorios se requiere usar agua con mínimo de impurezas. Los requisitos de calidad o pureza se encuentran establecidos sobre la base de diferentes normas o criterios, dependiendo de las instituciones u organismos
internacionales que establecen las referencias. Entre éstas se encuentran la
American Society for Testing and Materials (ASTM), British Standards Institution (BSI) y la International Organization for Standardization (ISO). Actualmente están definidos los diferentes niveles
de pureza del agua en función de los parámetros físico-químicos, tales como
conductividad eléctrica, resistividad, contenido de carbono, oxígeno o sílice.
Clasificación del agua de acuerdo a su característica fisicoquímica.
Especificaciones según ISO 3696
Parámetros Fisicoquímicos
Grado 1
Grado 2
Grado 3
Conductividad eléctrica valor máximo a 25 ºC, µS/cm
0,1
1
5
Resistividad, MΩ
10
1
0,25
Absorbancia (UA a 254 nm)
0,001
0,01
--
Sílice Total valos máximo mg/l
0,01
0,02
1
pH
--
--
5,0 a 7,5
Clasificación de los tipos de agua según NC-ISO 3696: 2004
Grado 1- Exenta básicamente de contaminantes constituidos por iones disueltos o coloidales y materias orgánicas. Es apropiada para los requisitos
de análisis más exigentes, incluyendo la cromatografía líquida de alta definición. Se puede preparar por un tratamiento adicional del agua de grado 2
(por ejemplo osmosis inversa o desionización seguida de filtrado a través de
una membrana con tamaño de poro de 0,2 µm para separar las partículas, o
por redestilación en un aparato de sílice fundido).
Grado 2- Con muy pocos contaminantes inorgánicos, orgánicos o coloidales. Es apropiada para análisis delicados, incluyendo la espectrometría de
absorción atómica (EAA) y la determinación de componentes en cantidades
mínimas. Se puede preparar por destilación múltiple o por desionización u
osmosis inversa seguida de destilación.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
12
�Grado 3- Apropiada para la mayoría de los trabajos de química en laboratorios por vía húmeda y la preparación de soluciones de reactivos. Se puede
preparar mediante una sola destilación, por desionización o por osmosis inversa. Salvo indicación en contrario, se puede utilizar para el trabajo normal
de análisis.
Equipos
El laboratorio debe tener inventario del equipamiento y un programa de control y mantenimiento de los equipos que emplea en el laboratorio.
El equipamiento que afecte la calidad de los resultados de ensayo, debe
mantenerse controlado, estipulando dentro de un programa los intervalos
de control, calibración /verificación y mantenimiento de los mismos.
Sobre la enfermedad3
Brucelosis es el nombre genérico que se aplica a las infecciones–humanas
o animales– causadas por distintas especies del género Brucella, principalmente Brucella abortus, B. melitensis y B. suis.
La infección del ganado ovino por B. ovis se describe por separado en el Capítulo 3.7.7 Epididimitis ovina (Brucella ovis) del manual de la OMSA.
Agente: Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis)
El género Brucella forma parte de la familia Brucellaceae, que a su vez forma parte
del orden Rhizobiales, en la clase alphaproteobacteria. Presenta una estrecha relación genética con ciertos agentes patógenos de las plantas y simbiontes de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como con agentes patógenos
de animales (Bartonella) y bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum).
La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del
género Brucella están estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en
cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes en
cuanto al tipo de hospedador y a la epidemiología, así como evidencias moleculares de variaciones genómicas, el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas, Subcomité de Taxonomía de Brucella, adoptó en 2005
una decisión firme sobre el retorno a las posiciones anteriores a 1986 en
lo relativo a la taxonomía de Brucella; la consecuencia de ese posicionamiento es la reaprobación de las seis especies de Brucella con sus biovariedades
reconocidas. Los nombres clásicos relacionados con las seis especies de
Brucella están publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias
de 1980, y las cepas típicas designadas aparecen asociadas a esos nombres
publicados y validados: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las
Fuente: Capítulo 3.1.4.- Manual Organización Mundial de Sanidad Animal -OMSA)- versión 2022.
3
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
13
�tres primeras se subdividen en biovariedades por sus características de
cultivo y serológicas. En la última década se han aislado cepas de Brucella de
mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las especies
ya reconocidas. Hay estudios en curso destinados a establecer su posición
en la taxonomía de este género y se ha propuesto que podrían clasificarse
en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis. Recientemente se ha aislado una
nueva cepa, denominada Brucella microti, en el topillo campesino (Microtus arvalis) y
en zorros y suelo de Europa Central (Scholz et al., 2008). También se han
descrito por primera vez ciertas cepas aisladas de infecciones humanas de
implantes mamarios y de pulmón, aunque todavía no está claro cuál es el
reservorio natural de las mismas. Si bien solo se han descrito dos cepas
de cada nuevo tipo, formalmente se han publicado como décima y onceava
especies de Brucella, B. inopinata y B. papionis, respectivamente (Scholz et al., 2010;
Whatmore et al., 2014). Por último, las cepas aisladas de roedores, zorros
y ranas se han caracterizado como cepas atípicas de Brucella claramente
diferenciables de las especies descritas actualmente, pero todavía no se
han aprobado como nuevas especies de Brucella.
Descripción de la enfermedad
Infección por Brucella en ganado bovino
La infección por Brucella en el ganado bovino suele estar causada por biovariedades (bv.) de Brucella abortus. En algunos países, sobre todo del sur de Europa, África y Asia occidental, en los que el ganado bovino se cría en estrecha
relación con ganado ovino o caprino, la infección también puede deberse
a B. melitensis (Verger, 1985). En ocasiones, B. suis puede causar una infección
crónica de la glándula mamaria del ganado bovino, pero no se ha observado que cause aborto ni que se transmita a otros animales. La infección por
Brucella en ganado bovino se transmite a nivel mundial, pero varios países del
norte y centro de Europa, así como Canadá, Japón, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres tanto de B. abortus como de B. melitensis. Esta enfermedad
suele ser asintomática en animales de corta edad y en hembras no gestantes. Tras la infección por B. abortus o B. melitensis, las hembras adultas gestantes
presentan placentitis, que suele dar lugar a aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto, en la placenta, los
líquidos fetales y las secreciones vaginales producen una profusa excreción
del microorganismo. La glándula mamaria y los ganglios linfáticos relacionados también pueden resultar infectados, y es posible que se excreten
microorganismos con la leche. Las siguientes gestaciones suelen llegar a
término, pero la infección uterina y mamaria reaparece, con cantidades bajas de microorganismos tanto en los productos del parto como en la leche.
En las infecciones agudas, el microorganismo se encuentra presente en la
mayoría de ganglios linfáticos principales del organismo. Los bovinos machos adultos pueden presentar orquitis/epididimitis y la brucelosis puede
ser una causa de infertilidad en ambos sexos. Los higromas, que suelen
afectar a las articulaciones de las extremidades, son un signo frecuente
en caso de brucelosis en algunos países tropicales y pueden ser el único
indicador manifiesto de infección; el líquido de los higromas suele estar
infectado por Brucella.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
14
�Infección por Brucella en ovejas y cabras
La infección por Brucella en ovejas y cabras (excepto la infección por B. ovis) está
causada principalmente por las biovariedades de B. melitensis. En ovejas y cabras se han observado infecciones esporádicas causadas por B. abortus o B. suis,
pero estos casos son extremadamente infrecuentes. La infección por Brucella
en ovejas y cabras es endémica en la región del Mediterráneo, pero se dan
casos en todo el mundo. América del Norte (excepto México) se considera
libre del agente, del mismo modo que el norte y el centro de Europa, el sudeste asiático, Australia y Nueva Zelanda.
Patológica y epidemiológicamente, la infección por B. melitensis en ovejas y cabras es muy similar a la infección por B. abortus en ganado bovino. En la mayoría
de los casos, las vías principales de transmisión de Brucella son la placenta, los
líquidos fetales y las secreciones vaginales expulsadas por las ovejas y cabras infectadas, ya sea al abortar o al parir a término. La expulsión de Brucella
también es frecuente en las secreciones de la ubre y en el semen, y puede
aislarse Brucella de distintos tejidos, como los ganglios linfáticos de la cabeza,
el bazo y los órganos asociados a la reproducción (útero, epidídimo y testículos), así como de lesiones artríticas (Alton et al., 1988).
Infección por Brucella en cerdos
La infección por Brucella en cerdos está causada principalmente por las biovariedades 1, 2 o 3 de B. suis. En cerdos también se han observado infecciones
esporádicas por B. abortus o B. melitensis, pero estos casos son muy infrecuentes.
La enfermedad tiene lugar en muchos países en los que se crían cerdos.
En general, la prevalencia es baja, pero en algunas regiones, como América
del Sur o el sudeste asiático, la prevalencia puede ser mucho más alta. En
algunos países, la brucelosis porcina puede ser un problema grave, aunque
actualmente no reconocido. Se ha observado infección por la bv 1 de Brucella
suis en jabalíes de algunos estados del sur de EE.UU., así como de Queensland (Australia) y de otros países de Oceanía. En estos países, se han documentado varias infecciones humanas en personas que practicaban la caza
y manipulaban material obtenido de jabalíes. En general, la enfermedad se
transmite por la ingesta de alimento contaminado por productos del parto o
de un aborto, o bien por secreciones uterinas. Los cerdos se comen de inmediato los fetos abortados y las membranas fetales. La transmisión durante la
cópula también es frecuente, y la excreción de B suis en el semen tiene implicaciones para el personal que lleva a cabo la inseminación artificial. En los
cerdos, como en los rumiantes, tras la bacteriemia inicial, B. suis coloniza las
células del tracto reproductor de ambos sexos. En las hembras, resultan invadidas la placenta y los fetos, mientras que en los machos la invasión tiene
lugar en uno o más de los siguientes tejidos: testículos, próstata, epidídimo,
vesículas seminales o glándulas bulbouretrales. En los machos, las lesiones, que suelen ser unilaterales, empiezan con una hiperplasia que puede
avanzar a absceso; la fase final se caracteriza por esclerosis y atrofia. Pueden aparecer artritis en varias articulaciones, y a veces tiene lugar una espondilitis. En las cerdas, el signo más frecuente de brucelosis es el aborto en
cualquier momento de la gestación, aunque es más habitual entre los días
50 y 110. La secreción vaginal no suele ser evidente y, en los rebaños infecMANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
15
�tados de forma crónica, el signo clínico más relevante es la infertilidad, no el
aborto. En los machos, la brucelosis tiene más probabilidades de ser persistente, y ocasiona lesiones en el tracto genital que a menudo dan lugar a una
interferencia con la actividad sexual, que puede ser temporal o irreversible. El
verraco puede excretar Brucella con el semen sin ninguna anomalía aparente en
los órganos sexuales ni interferencia con la actividad sexual. En ambos sexos
puede aparecer una tumefacción articular y de las vainas de los tendones,
cojera y, en ocasiones, parálisis posterior. Un porcentaje considerable tanto
de cerdos como de cerdas se recupera de la infección, a menudo en un plazo
máximo de 6 meses, pero muchos quedan infectados de por vida (Olsen et al.,
2012). La infección causada por la bv 2 de B. suis difiere de la causada por la bv
1 y la bv 3 en cuanto a la gama de hospedadores, la distribución y la patogenicidad. Históricamente, la distribución geográfica de la bv 2 de B. suis ha sido un
amplio territorio situado entre Escandinavia y los Balcanes. La prevalencia en
jabalíes parece ser alta en toda Europa continental (EFSA, 2009). En los brotes
de Europa, los jabalíes intervienen como fuente de transmisión de la bv 2 a
cerdos criados en el exterior, y se consideran el principal reservorio salvaje de
esta infección (EFSA, 2009). La bv 2 de Brucella suis causa lesiones miliares, sobre
todo en tejidos reproductivos, que a menudo se vuelven purulentas. Hasta la
fecha, la bv 2 se ha documentado en muy pocos casos como causa de brucelosis humana. No obstante, sí se han observado infecciones por la bv2 en
cazadores con inmunocompromiso que hayan estado excesivamente expuestos debido a prácticas como el destripado y despellejado de jabalíes o liebres.
Asimismo, en ganado bovino y ovino de Europa expuesto a jabalíes infectados,
se han observado casos, aunque muy infrecuentes, de infección por la bv 2 de
B. suis sin signos clínicos.
Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio o en libertad
Se ha observado infección por B. abortus y B. melitensis en el dromedario (Camelus dromedarius) y en el camello (C. bactrianus), así como en camélidos de América del Sur: la
llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guanicoe) y la vicuña (Vicugne
vicugne), y se ha relacionado con el contacto con rumiantes grandes y pequeños
infectados por B. abortus y B. melitensis. Asimismo, se ha observado brucelosis en el
búfalo doméstico (Bubalus bubalis), el bisonte americano y el europeo (Bison bison y B.
bonasus, respectivamente), el yak (Bos grunniens), el elk/wapiti (Cervus elaphus), el búfalo
africano (Syncerus caffer) y varias especies de antílopes de África. Los signos clínicos de brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en el
ganado bovino, ovino y caprino.
La infección por Brucella melitensis en rumiantes salvajes puede tener lugar cuando
estas especies se encuentran en estrecho contacto con ovejas y cabras de zonas enzoóticas. Los signos de la brucelosis en estos animales son similares a
los que se observan en bovinos, ovinos y caprinos, pero en varias especies de
rumiantes salvajes (como el rebeco [Rupicapra rupicapra], el íbex alpino [Capra ibex] y la
cabra ibérica [Capra pyrenaica] salvaje) se ha observado artritis purulenta o calcificada y orquitis, así como uveítis y problemas neurológicos. Estas especies se
consideran portadores terminales, que no pueden transmitir la enfermedad,
la cual suele desaparecer de forma natural en cuanto la infección por Brucella
se ha erradicado del ganado doméstico, a no ser que tengan lugar efectos
antropogénicos.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
16
�Existen dos tipos distintos de situación epidemiológica respecto a la infección
por B. suis en otras especies no porcinas. En el primer caso, la infección por
B. suis tiene lugar en animales que no son el hospedador natural de la infección
concreta mediante la ingesta de materiales contaminados o por cohabitación
con hospedadores naturales infectados. Por ejemplo, zorros y lobos del ártico
pueden contraer la bv 4 de B. suis del reno; los perros y los roedores, como ratas
o ratones, pueden contraer otras biovariedades de B. suis por cohabitación con
hospedadores infectados; y el ganado bovino y los caballos pueden resultar
infectados por cohabitación o interacción con porcinos infectados. Las bacterias infectantes pertenecen siempre a las biovariedades definidas de especies
hospedadoras naturales. En el segundo caso, los hospedadores naturales de
B. suis o microorganismos similares a B. suis son especies salvajes. Un ejemplo es
la denominada brucelosis murina de la Comunidad de Estados Independientes (CIS) y los países bálticos, donde pequeños roedores resultan infectados
por la bv 5 de B. suis. Una situación similar se ha observado en Australia, donde,
a partir de roedores, se han aislado cepas parecidas a B. suis pero con características distintas; finalmente se ha considerado que son distintas de B. suis en
función del perfil genético.
Además del jabalí, la liebre común europea (Lepus europaeus) también se considera
reservorio de la bv 2 de B. suis y se ha observado que interviene como posible
fuente de transmisión al ganado doméstico. En la liebre común europea, la
enfermedad se caracteriza por la formación de nódulos de tamaños variables
comprendidos entre el de una semilla de mijo y el de una cereza o incluso
mayor; a menudo se vuelven purulentos. Estos nódulos pueden desarrollarse
en casi cualquier lugar, a veces en el tejido subcutáneo o intramuscular, en
el bazo, el hígado o los pulmones y en los órganos reproductivos de ambos
sexos. La condición corporal de la liebre puede quedar sorprendentemente
intacta. Otras especies también pueden resultar infectadas por cohabitación
con cerdos, jabalíes o liebres infectados por la bv 2 de B. suis. El destripado o
despellejado de jabalíes en explotaciones bovinas podría ser una vía de transmisión al ganado bovino. La bv 4 de Brucella suis causa una zoonosis grave en renos salvajes o domesticados (Rangifer tarandus y sus distintas subespecies) en toda
la región del Ártico, incluidos Siberia, Canadá y Alaska. Rangifer tarandus es muy
susceptible a la infección por B. suis, que causa fiebre, abatimiento y distintos
signos locales, como aborto, retención de placenta, metritis, a veces con secreciones sanguinolentas, mastitis, bursitis y orquitis. La transmisión al ser
humano puede tener lugar por contacto directo o por el consumo de leche
cruda u otros productos cocidos de manera insuficiente procedentes del reno,
especialmente la médula ósea.
Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad
Ciertas especies de Brucella, sobre todo B. melitensis, B. abortus, B. suis –y probablemente
en menor medida B. canis– son fácilmente transmisibles al ser humano, en el
que causan un proceso febril (fiebre ondulante) que puede avanzar a una forma más crónica y también producir complicaciones graves que afecten a los
sistemas músculo esquelético, cardiovascular y al sistema nervioso central.
Deben aplicarse medidas de precaución para prevenir la infección humana. La
infección se contrae básicamente por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero
la ingesta de productos lácteos crudos constituye el principal riesgo para el
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
17
�público general en los lugares en los que la enfermedad es endémica. Existe
un riesgo ocupacional en veterinarios, trabajadores de mataderos y ganaderos
que manipulen animales/canales infectados y fetos abortados o placentas. La
brucelosis también es una de las infecciones de laboratorio más fáciles de
contraer, y todas las manipulaciones de laboratorio relacionadas con cultivos
vivos o material que pueda estar infectado o contaminado deben realizarse a
un nivel de bioseguridad y contención adecuado, que se determinará a partir
de un análisis del riesgo biológico. Se han realizado recomendaciones específicas relativas a las precauciones en materia de bioseguridad que deben aplicarse con los materiales infectados por Brucella (se ofrece más información en
Alton et al., 1988; Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis, 1986; OMS,
1953; OMS, 2004).
Todos los abortos en el ganado deben considerarse como casos sospechosos
de brucelosis y deberían investigarse. El cuadro clínico no es patognomónico,
aunque la historia del rebaño puede servir de ayuda. El diagnóstico inequívoco
de infecciones por Brucella solo puede hacerse por aislamiento e identificación
de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el análisis bacteriológico, el diagnóstico puede basarse en métodos serológicos.
Técnicas de diagnóstico
Pruebas serológicas
No existe una prueba única que permita la identificación de Brucella. Normalmente
se necesita una combinación de los métodos serológicos y bacteriológicos.
Ninguna prueba serológica aislada es adecuada en todas y cada una de las
situaciones epidemiológicas, presentando limitaciones en el análisis de animales individuales. Se deben considerar todos los factores que influyen en la
relevancia del método de prueba y de sus resultados para una aplicación o
interpretación diagnóstica específica. Los métodos serológicos que se describen en este manual son métodos estandarizados y validados, con características de realización adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o
alternativas en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas
modificadas o similares o la utilización de reactivos diferentes. Sin embargo,
los métodos y reactivos descritos en esté manual suponen un estándar de
comparación respecto a la realización esperada del diagnóstico.
Debe resaltarse que la prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de fijación
de complemento (FCT) es más específica que la SAT para el diagnóstico y además posee un sistema estandarizado de unidades.
Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el
análisis las pruebas con antígeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba
con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinación tamponada en placa
(BPAT), así como el enzimoinmunoensayo (ELISA) y el ensayo de polarización
fluorescente (FPA). Las reacciones positivas deben volverse a analizar utilizando una estrategia confirmatoria adecuada.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
18
�En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), camellos (Camelus dromedarius, C.bactrianus) y camélidos sudamericanos, la infección por
Brucella sigue un curso similar al del ganado bovino. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serológicos, pero cada uno debe
ser validado en el animal estudiado.
Tabla 1
Métodos analíticos disponibles para el diagnóstico de infección por Brucella abortus,
melitensis o suis (Manual OMSA, 2022).
Propósito
Método
Demostrar
ausencia de
infección en
la población
Demostrar
ausencia
de infección
en animales
individualesa
Contribuir a
las políticas
de erradicaciónb
Confirmar
casos
clínicos sospechososc
Determinar
la prevalencia de la
infección –
vigilancia en
el rebaño /
manada
Determinar
el estado
inmunitario
en animales
individuales
o en poblaciones tras
la vacunación
-
-
Identificación del agente
Métodos de tinción
-
Cultivo
PCRd
-
-
+
+++
+/++
Detección de la respuesta inmune
BBAT (RBT o BPAT)
+++
++
++
+++
++
++
++
++
++
++
++
+
+
+++
+
+++
+++
+
+
+
+
++
++
++
+
+++
-
+++
++
+++
+++
++
++
+
-
Pruebas basadas
en el NH y proteínas
del citosole
-
-
+
++
-
-
Prueba en leche de
tanquef I- ELISA en
leche o prueba de
anillo en leche
+++
-
+++
+
+++
-
FPA
CFT
I-ELISA
C-ELISA
BST
SAT
Clave: +++ = método recomendado; ++ = método adecuado; + = puede utilizarse en ciertas situaciones, pero el costo, la fiabilidad u otros factores limitan su
aplicación; - = no adecuado para esta finalidad.
PCR = reacción en cadena de la polimerasa; BBAT = pruebas con antígeno
tamponado de Brucella (es decir, RBT [rosa de bengala] y BPAT [prueba de
aglutinación en placa tamponada]); CFT = fijación de complemento; I- o C-ELISA = enzimoinmunoanálisis indirecto de competición; FPA = prueba de polarización de la fluorescencia; BST = prueba de la brucelina; SAT = prueba de
aglutinación en suero; NH = hapteno nativo.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
19
�a Solo aplicable a rebaños / manadas, países o zonas libres de la infección por
Brucella.
b Para aumentar la eficiencia de las políticas de erradicación en rebaños/
manadas, se recomienda combinar pruebas para aumentar la sensibilidad en
cuanto al diagnóstico, es decir, al menos dos pruebas serológicas, como BBAT
o FPA y CFT o I- ELISA. La sensibilidad aumenta aún más si se aplica simultáneamente serológica y BST.
c En zonas de prevalencia baja o casi libres, el valor predictivo de los resultados positivos en las pruebas serológicas puede ser muy bajo. En tales situaciones, para confirmar casos clínicos suele ser necesario identificar el agente
causal.
En rebaños/manadas infectados, un resultado positivo en cualquier prueba
serológica puede considerarse una confirmación de un caso clínico. Todo animal que dé positivo en cualquier prueba debe considerarse infectado, incluso
en ausencia de signos clínicos.
En zonas de prevalencia baja o casi libres, los resultados positivos aislados
pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) o BST.
En países o zonas libres, los animales sospechosos son los que dan positivo
tanto en una prueba serológica de cribado como en una confirmativa (pruebas
en serie) y pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) y/o BST.
d Es posible que se obtenga falsos positivos.
e En las zonas en las que se practica la vacunación subcutánea con S19 o Rev.
1, esta prueba puede ayudar a diferenciar entre los anticuerpos generados a
partir de la vacunación y los generadores a partir de la infección.
f Solo ganado lechero.
Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de
brucelosis en el laboratorio de red
Registro de entrada de muestras
Todo laboratorio debe contar con un instructivo o procedimiento de recepción,
manejo y rechazo de muestras.
Es responsabilidad del veterinario acreditado que envía las muestras asegurarse la correcta identificación, embalaje y documentación que acompaña a
las mismas.
Los laboratorios deben contar con un registro de entrada de muestras (en papel o software con back- up), en el que figure como mínimo la siguiente información:
• Fecha de recepción de muestras.
• Cantidad de muestras.
• Especie.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
20
�• Fecha de extracción de muestras.
• Procedencia: establecimiento, número de Renspa.
• Localidad: departamento, partido, provincia.
• Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por
la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), Senasa.
• Motivo del envío:
• DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario).
• MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica para mantenimiento del estatus).
• SAN (Saneamiento de rodeo bajo plan), CSM (Certificado de seronegatividad para el Movimiento).
• Control interno (según requerimiento de veterinario acreditado).
• Remuestreo, otros.
Características y condiciones de las muestras
Condiciones de recepción de las muestras:
• Sangre entera o suero refrigerados
• Suero congelado
• Leche para PAL refrigerada (no congelada)
• Leche para IELISA refrigerada/congelada
• Tubos con identificación clara, de preferencia sobre cinta de papel o similar
adherida al tubo; otra opción es la marcación firme e indeleble en el cuerpo del
tubo
• Planillas/protocolo completas de toma de muestras (Anexo II, Resolución Senasa 67/2019)
Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las muestras:
• Falta de planillas/protocolo o planillas incompletas de toma de muestras
(Anexo II, Resolución Senasa 67/2019)
• Falta de la firma del veterinario acreditado en la planilla de extracción, responsable de la toma de muestra
• Sangre entera congelada
• Leche para PAL congelada, contaminada
• Sangre entera o suero, contaminados
• Sueros hemolizados
• Tubos no identificados
• Volumen insuficiente
Los laboratorios reconocidos y autorizados deben ser exigentes con la calidad
de las muestras a procesar, como así también con la planilla de toma de muestra firmada por el veterinario acreditado actuante que debe acompañar a las
muestras.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
21
�Informes de resultados
Los informes que elabore el laboratorio deben ser precisos para poder desarrollar
adecuadamente las acciones de saneamiento (Ver modelo Anexo I del presente
manual).
En el informe de resultados debe constar:
• Logo del laboratorio/Dirección/Tel./e-mail/ Número de identificación del laboratorio
• N.° de protocolo interno
• Fecha de extracción de muestras
• Fecha de recepción de muestras
• Fecha de informe o emisión de resultados
• Cantidad de muestras
• Especie
• Procedencia: establecimiento, número de Renspa
• Localidad: Departamento, partido, provincia
• Remitente: Veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado
por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), Senasa
• Motivo del envío: DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario),
MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica para mantenimiento del estatus), SAN (Saneamiento de rodeo bajo plan), CSM (Certificado de seronegatividad para el movimiento), control interno (según requerimiento de veterinario
acreditado), remuestreo
• Columnas con la información del tubo / caravanas / edad / fecha de vacunación / pruebas utilizadas / resultados con los valores obtenidos (SAT-2ME,
ELISA, FCT, FPA), valor de corte e interpretación cuando corresponda
• Información de los antígenos / kits utilizados
• Firma del director técnico del laboratorio
• Observaciones
• Paginación x de y
• Que conste en todas las páginas N.° del protocolo y N.° de Renspa
Animales para examinar: Hembras vacunadas mayores de 18 meses y animales no vacunados mayores de 6 meses.
Figura 1: Diagrama de diagnóstico serológico de brucelosis
en la República Argentina.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
22
�Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT)
para la detección de anticuerpos contra Brucella spp
Son pruebas tamiz de aglutinación en placa. Se fundamentan en la inhibición
de las aglutininas inespecíficas a bajo pH. Detectan anticuerpos IgG y algunos
IgM específicos.
Desarrollo
Materiales:
• Micropipetas de10-100 µl.
• Gradillas.
• Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45 cm de largo x 35
cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa, provista de una placa de vidrio
marcada con cuadrados de aproximadamente 4 cm de lado, que se apoya cerca
de la parte superior de la caja de manera que pueda quitarse y ponerse fácilmente.
• La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por
debajo (cubiertas parcialmente), de la mezcla de suero y antígeno. El interior
de la caja debe pintarse de negro opaco.
• Debe colocarse dentro del aglutinoscopio una pequeña cámara húmeda para
evitar la evaporación de las muestras.
• Mezcladores de acero o plástico.
Equipos:
• Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 º C).
• Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 ° C).
• Vórtex.
• Centrífuga.
• Timer.
Reactivos:
• Antígeno BPAT con volumen celular aprox. de 11%.
• Antígeno Rosa de Bengala, volumen celular aprox. de 8%.
• Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ± 3 ° C. No se debe congelar, lo cual
lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad.
• Suero control interno positivo.
• Suero control interno negativo.
• Cada laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos.
Ejecución del ensayo de BPAT
• Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex.
• Llevar las muestras de suero y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 º C)
como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo.
• Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (No usar vórtex).
• Colocar sobre el aglutinoscopio (con cámara húmeda), la placa de vidrio (limpia y seca), se recomienda pasar papel absorbente embebido en alcohol 70º de
ambos lados de la misma.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
23
�• Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 80
µl de suero, previo mezclado con vórtex. Utilizar un tip o punta de pipeta para
cada suero.
• Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota del suero, con
la precaución de no tocar el suero para no contaminar con el tip el frasco de
antígeno.
• Mezclar bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno
abarcando una superficie circular aproximada de 3 cm de diámetro.
• Se retira la placa de vidrio y se imprimen 3 movimientos en forma rotativa
hasta homogeneizar la mezcla.
• Se coloca la placa sobre el aglutinoscopio con cámara húmeda y se tapa,
permaneciendo la luz apagada.
• Se efectúa una nueva rotación, pasados 4 minutos.
A los 8 minutos, rotando de nuevo la placa y con la luz encendida, se procede
a la lectura.
Figura 2: Aglutinoscopio.
Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala
• Colocar la placa de vidrio sobre el aglutinoscopio, como se indicó en la prueba de BPAT.
• Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 30
µl de suero. Utilizar un tip para cada suero.
• Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota de suero.
• Se mezcla bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno,
abarcando una superficie circular de aproximadamente 2 cm de diámetro.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
24
�• Se retira la placa de vidrio y se imprimen movimientos en forma rotativa
durante 4 minutos a razón de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede
hacer en forma manual o con rotadores diseñados especialmente.
• Finalizados los 4 minutos y rotando la placa sobre la caja de lectura o aglutinoscopio con la luz encendida, se procede a la lectura sobre fondo blanco.
En el caso de muestras de sueros caprinos y ovinos, la OMSA recomienda
utilizar la prueba de Rosa de Bengala modificado (RBTm), el cual consiste en
mezclar 75 µl de suero y 25 µl de antígeno. Lectura a los 4 minutos, como se
detalla en la explicación anterior.
Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de
screening con antígeno tamponado en placa
Las reacciones se clasifican en:
POSITIVAS: Cuando se forman grumos, aun siendo finos (no confundir con
aglutinaciones inespecíficas producidos por impurezas, hemólisis, etc.). Estas
muestras deben someterse a las pruebas confirmatorias de SAT / 2-ME, FPA,
ELISA o FCT.
NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y
sin grumos. Estas muestras se informan como negativas y no se realizan las
pruebas complementarias.
+
-
+
Figura 3: Lectura BPAT/RBT
-
Informes de resultados
Se aceptan las siguientes expresiones de resultados en las planillas:
Positivo
Negativo
+
-
POS
NEG
P
N
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
25
�Criterios de aceptación del resultado
En paralelo a las muestras problema se dispensan los sueros controles internos negativos y positivos. Para aceptar los resultados, ambos controles
deben arrojar la lectura correspondiente. Si los controles no arrojan la lectura
esperada, se deben revisar las posibles causas, calidad de los sueros controles, antígeno, calibración de pipetas, etc.
Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME)
Las pruebas de seroaglutinación detectan la presencia de los anticuerpos IgM
e IgG. Los anticuerpos IgM aglutinan más intensamente que los IgG ya que, al
ser las moléculas pentavalentes, poseen un mayor número de sitios de unión.
El título de un suero se determina por la inversa de la dilución más alta que
causa un determinado grado de aglutinación y se expresa en unidades que
corresponden al recíproco de esa dilución.
La prueba de 2-mercaptoethanol (2-ME) es una prueba selectiva que detecta
solamente la presencia de IgG, se basa en que los anticuerpos IgM, con configuración de pentámero, se degradan en cinco subunidades semejantes por la
reducción de enlaces disulfuro, debido a la acción de ciertos compuestos que
contienen el radical tiol, tales como el 2-mercaptoethanol. Estas subunidades conservan sus características de antigenicidad, pero pierden la actividad
de anticuerpo plurivalente y se comportan como univalentes. Aun cuando las
subunidades están integradas por dos cadenas pesadas y dos livianas, al combinarse con el antígeno no originan complejos suficientemente grandes como
para aglutinar, probablemente como consecuencia de algún impedimento estérico. Las moléculas de IgG, en cambio, no sufren un efecto obvio que altere
su actividad para dar reacciones objetivas como la aglutinación.
La prueba se usa, por lo tanto, como evidencia presuntiva de la presencia de
anticuerpos de la clase IgG.
Desarrollo
Materiales:
• Micropipetas de10-100 µl.
• Gradillas.
• Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45 cm de largo x 35
cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa. La caja debe estar iluminada
de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente).
El interior de la caja debe pintarse de negro opaco.
• Tubos de serología: tipo Wasserman de 13 por 100 mm o tubos de Khan de
vidrio.
• Probetas (100 ml y 1000 ml).
• Pipetas 1, 2, 5 y 10ml.
• Recipientes de vidrio de volúmenes variados.
• Propipetas.
• Dispensador automático o pipetas graduadas de 1-10 ml.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
26
�Equipos:
• Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC).
• Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 °C).
• Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC).
• Balanza.
• Vórtex.
• Centrífuga.
• Timer.
• Termómetro calibrado.
Reactivos:
1. Antígeno SAT, volumen celular aprox.4.5%.4
2. Suero control interno positivo.
3. Suero control interno negativo.
Cada laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo (determinar el título) y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos.
Drogas y soluciones5:
• Cloruro de sodio p.a.
• Fenol p.a.
• 2-mercaptoethanol p.a.
• Solución salina al 0,85 %.
• Solución salina fenolada al 0,5 %.
Ejecución del ensayo
Ambas pruebas (SAT y 2-ME) se realizan simultáneamente procediendo de la
siguiente manera:
• Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex.
• Llevar las muestras de suero y de antígeno a temperatura ambiente 22 ± 4
ºC al menos una hora antes de la ejecución del ensayo.
• Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos de 10 minutos (no usar vórtex).
• Por cada muestra de suero problema positivo a BPAT, colocar en una gradilla 1 hilera de 8 tubos de 13 x 100 mm o tubos de Khan. Identificar la gradilla
con el número de protocolo.
• Identificar el primer tubo de cada hilera con el número correspondiente al
suero problema. En los primeros 4 tubos se realiza la prueba de SAT; se deja
un espacio libre y en los 4 tubos siguientes de la misma hilera, se realiza la
prueba de 2-ME.
• Por cada muestra de suero debidamente identificada, se utilizan tubos en
los cuales se dispensa con micropipeta 80 µl de suero en el fondo del primer
tubo, 40 µl se distribuyen en el segundo tubo, 20 µl en el tercero y 10 µl en el
cuarto.
• Repetir el procedimiento descripto para depositar las mismas cantidades de
suero en los tubos de 2-ME.
4
Conservar el antígeno en la heladera a 5 ± 3 ° C. No se debe congelar porque esto lo inutiliza al modificar la sensibilidad.
5
Tener copia impresa de la hoja de seguridad de cada droga.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
27
�• Incluir un suero control interno positivo (título conocido) y negativo, además
de un control de soluciones y antígeno sin suero.
• Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de
solución de 2-ME (0,1 M) en cada tubo de este grupo y mezclar muy bien agitando la gradilla.
• Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de
solución salina fenolada al 0,5 % a cada uno de los tubos del grupo de SAT.
• Dejar las gradillas con las mezclas durante 45 a 60 minutos a temperatura
ambiente 22 ± 4 ºC y, posteriormente, dispensar a cada tubo 1 ml de antígeno
de SAT diluido al 2 % (0,09 % de brucelas) en solución salina 0,85 %.
• Mezclar bien agitando la gradilla y llevar a estufa.
Consideraciones generales:
• Las muestras que resulten positivas a BPAT o RBT deben confirmarse
por las técnicas de SAT y 2-mercaptoethanol, ELISA, FPA o FCT.
• La existencia de hemólisis excluye el empleo del método de tubo y placa. La presencia de hemólisis en las muestras de suero interfiere en la
prueba de aglutinación en tubo, no solo porque la coloración puede enmascarar la reacción de aglutinación, sino porque se forma un precipitado como resultado de la acción del fenol que contiene la solución de
antígeno sobre la hemoglobina libre. Es muy difícil distinguir esta falsa
reacción de la aglutinación específica de la unión antígeno-anticuerpo.
Incubación
La incubación se realiza a 37 ± 2 ºC durante 40-48 horas y tiene por objeto obtener en el tiempo más corto posible el máximo de aglutinación.
Se recomienda tomar y registrar las temperaturas máximas y mínimas de la
estufa durante el transcurso de las 40-48 horas de la incubación, para verificar
la estabilidad de la estufa.
Lectura e interpretación de resultados
Una vez finalizada la incubación de las muestras, se realiza la lectura de las
pruebas contra el fondo negro opaco de la caja de lectura o aglutinoscopio,
iluminada desde atrás con una fuerte luz que atraviese los tubos.
La aglutinación del complejo antígeno-anticuerpo bajo la forma de grumos y
su depósito en el fondo del tubo por gravedad determina la clarificación de la
columna de líquido en el tubo; después de una leve agitación del tubo, se mantienen los grumos firmes.
La aglutinación es el resultado directo de la unión específica de los anticuerpos presentes en el suero, con las Brucellas inactivadas contenidas en el antígeno. Las determinaciones se deben basar tanto en la claridad/turbidez de las
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
28
�mezclas como en el grado de aglutinación y la firmeza de los grumos al agitar
suavemente el tubo.
El título se determina por la inversa de la dilución más alta donde se observa
aglutinación en el tubo, en el que se presenta una disminución evidente de la
turbidez y los grumos firmes se mantienen a pesar de una agitación leve. Si
esto ocurre, por ejemplo, en los 3 primeros tubos solamente, el título del suero (recíproco de la dilución) es de 100 UI / ml de aglutinación en SAT o en 2-ME.
El grado de aglutinación en cada una de las distintas diluciones puede clasificarse como completo (+), incompleto (I) o negativo (-).
• Aglutinación completa es aquella en que el líquido de la mezcla suero-antígeno aparece límpido, translúcido y la agitación suave no rompe los
grumos.
• Aglutinación incompleta es la que muestra la mezcla suero-antígeno
parcialmente turbia y una suave agitación no rompe los grumos.
• Negativa es aquella en que la mezcla suero-antígeno no evidencia aglutinación, la columna líquida aparece turbia y una suave agitación no revela
grumos.
Fenómeno de zona
En ciertas ocasiones, puede ocurrir que se encuentre aglutinación en las
diluciones más altas, pero no en las diluciones más bajas. Esta inhibición de la aglutinación en las diluciones bajas es llamada “fenómeno de
zona” y está asociado a un exceso en la concentración de anticuerpos en
el suero en las diluciones más bajas, lo que provoca una aglutinación no
visible por estar fuera de la zona de equivalencia de la unión antígeno-anticuerpo.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
29
�Figura 4: Esquema Prueba simultánea de SAT y 2-ME.
Informes de resultados
Ejemplo:
Negativo
Neg
I 25
25
1/25
I: Incompleto
Tabla 2
Interpretación de los resultados para hembras bovinas mayores de 18 meses
de edad vacunadas con Brucella abortus cepa 19 entre los 3 a 8 meses de edad
BPAT
SAT
2-ME
INTERPRETACIÓN
-
NH *
NH
NEGATIVO
+
≤ 50
-
NEGATIVO
+
I 100
-
SOSPECHOSO
+
100
-
SOSPECHOSO
+
I 200
-
SOSPECHOSO
+
200
-
POSITIVO
+
25 a 50
I 25
NEGATIVO
+
≤ 25
≤ 25
NEGATIVO
+
≥ I 50
≥ I 50
POSITIVO
* NH: No se hace
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
30
�Tabla 3
Interpretación de los resultados para animales no vacunados (bovinos y otras
especies) mayores de 6 meses de edad
BPAT
SAT
2-ME
INTERPRETACIÓN
-
NH
NH
NEGATIVO
+
25
-
NEGATIVO
+
I 50
-
SOSPECHOSO
+
50
-
SOSPECHOSO
+
I 100
-
SOSPECHOSO
+
100
-
POSITIVO
+
200
-
POSITIVO
+
≥ 25
≥ 25
POSITIVO
Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME
Solución salina 0,14 m
• Cloruro de sodio 8,5 g
• Agua destilada 1000 ml
Solución salina fenolada
Solución salina 0,14 M con la adición de 0,5 % de fenol. Conservar a temperatura ambiente por un plazo de 30 días. Se recomienda preparar el volumen
necesario de trabajo diario o semanal.
Solución 2-ME 0,1 m
• 2-Mercaptoethanol 7,8 ml
• Solución salina 0,14 M. 992,2 ml
Importante: no utilizar solución salina fenolada
El 2-mercaptoethanol es sensible a la luz y al calor y se deteriora rápidamente
por exposición al aire. Se debe conservar en frasco color ámbar herméticamente cerrado a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC).
Leer detenidamente la hoja de seguridad. Evitar la inhalación, manipularlo en
lo posible con máscara de gases o en cabina de extracción. Nunca pipetear
con la boca.
La solución de 2-mercaptoethanol ya preparada se puede conservar por una
semana a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC). Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal.
• Solución de antígeno SAT (wright) al 2 %
• Solución salina 0,14 M (no utilizar solución salina fenolada) 98 ml
• Antígeno SAT (wright) (4,5 %) 2 ml
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
31
�La solución de antígeno al 2 % se puede conservar por una semana en heladera (5 ± 3 ºC). Descartar toda aquella solución que presente turbidez o signos
de contaminación.
Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos
La prueba se diseñó para detectar la presencia de anticuerpos en leche de
bovinos. Estos anticuerpos reaccionan con el antígeno coloreado con hematoxilina formando un complejo antígeno anticuerpo que queda adherido a la
superficie de los glóbulos grasos y asciende con ellos a la superficie, de esta
manera forma una capa o anillo de crema de color púrpura azulada, de intensidad variable según el grado de la reacción. Paralelamente, desaparece
parcial o totalmente la tinción de la columna de leche. Si la muestra no contiene anticuerpos específicos, el antígeno no se fijará a los glóbulos grasos
y permanecerá uniformemente distribuido, coloreando la columna de leche,
mientras que la capa de crema forma un anillo de color blanco natural.
Esta prueba se usa especialmente como diagnóstico presuntivo para detectar rebaños infectados. También se emplea en la vigilancia epidemiológica en
áreas de control de la brucelosis.
El porcentaje de grasa de la muestra influye en la prueba, ya que la formación
del anillo de crema en la superficie dependerá del tenor graso.
Los animales de rebaños positivos a la prueba de anillo en leche deben ser
examinados por las pruebas serológicas para identificar aquellos infectados.
Desarrollo
Materiales:
• Tubos de serología: tipo Wassermann de 13 mm por 100 mm, o tubos de
Khan de vidrio claro y completamente limpio.
• Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml.
• Micropipetas de 10 a 100 µl y 1 ml.
• Gradillas.
• Timer.
Equipos:
• Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC).
• Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC).
• Termómetro calibrado.
Reactivos:
• Antígeno PAL con volumen celular aprox.4 %.
• Conservar el antígeno en la heladera a 5 ± 3 °C. No se debe congelar, lo
cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad.
• Muestras de leche refrigerada (no congelada).
• Solución de formalina 1 %.
• Muestras de leche controles positivo y negativo.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
32
�Ejecución del ensayo
Las muestras de leche se deben mantener en refrigeración a una temperatura
de 5 ± 3 ºC hasta que hayan transcurrido no menos de 24 horas desde su recolección (preferiblemente, 48 a 72 horas). No deben haber sido congeladas,
calentadas, sometidas a agitación violenta ni conservadas durante más de 72
horas.
• Llevar las muestras de leche y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4
º C) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo.
Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente (tubo o frasco).
• Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por
inversión durante no menos 10 minutos (no usar vórtex).
• Colocar 1 ml de la muestra en un tubo de vidrio 13 x 100 mm o tubo de
Khan. La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mínimo
de 25 mm.
• Agregar 30 µl de antígeno a cada tubo. Mezclar bien invirtiendo el tubo
varias veces, sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno
sobre las paredes.
• Incubar en estufa a 37 ± 2 º C, durante una hora.
Lectura
- Anillo de crema, blanco; columna de leche, azul.
+ Anillo de crema y columna de crema, del mismo color, o casi igual.
++ Anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche.
+++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche tiene aún un poco de
color.
++++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche es blanca.
Cualquier grado de + debe interpretarse como positivo.
Observaciones
• El exceso o la escasez de crema dificultan la interpretación de la prueba. También, la agitación vigorosa dificulta su realización.
• El calentamiento de la leche interfiere con los resultados; por lo tanto,
la prueba no se puede efectuar con leches pasteurizadas.
• Cuando la prueba se efectúa el mismo día en que se ha recolectando la
leche, se pueden obtener algunos resultados falsos positivos o dudosos.
• La leche de calostro puede dar resultados falsos positivos.
• La leche de vacas con mastitis también puede dar falsos positivos o
impedir la interpretación de la prueba debido al descoloramiento del antígeno.
• La leche de vacas próximas a secarse puede dar resultados dudosos o
falsos positivos.
• Hay vacas infectadas con Brucella que no eliminan anticuerpos por la leche. Estas vacas son positivas en las pruebas de sangre y negativas en la
prueba del anillo.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
33
�Modificación de la prueba para tanques muy grandes
Para hacer más sensible la prueba, aumentar la cantidad de leche manteniendo constante la cantidad del antígeno (30 µl).
Cuando se ajusta la PAL para aplicarla a rebaños de gran tamaño (2 o 3 ml de
leche), se añaden 0,1 ml de una mezcla de crema negativa no pasteurizada
al tubo de ensayo y, a continuación, 30 µl del antígeno de la prueba del anillo. Después de mezclar, la prueba se incuba y se lee de la misma forma que
para la PAL no ajustada. La mezcla de crema negativa se recoge mediante la
separación de la leche compuesta por varias muestras y sin pasteurizar correspondiente a un rebaño de 25 o más vacas que sean negativas a brucelosis.
< 150 vacas
1 ml de leche
150 – 450 vacas
2 ml de leche
451- 700 vacas
3 ml de leche
Figura 5: Prueba de vigilancia
epidemiológica para muestras
de pool de leche.
Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche)
Se realiza siguiendo el protocolo de los kits comerciales validados y aprobados para el diagnóstico oficial de la brucelosis en la República Argentina con
el valor de corte establecido por el Senasa.
El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un método empleado habitualmente para
la detección o cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se
encuentran en concentraciones muy bajas. El método combina la especificidad de unión de los anticuerpos con la amplificación de “señal” que brindan
las reacciones catalizadas por enzimas. En la práctica clínica es la técnica
inmunológica más empleada. Se utiliza para cuantificar, entre otras cosas,
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
34
�hormonas, marcadores tumorales, para determinar la presencia de antígenos
microbianos y para la determinación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos
totales o frente a algún antígeno en particular.
Etapas
Previo al inicio de la ejecución del ensayo, equilibrar todos los componentes
del kit a temperatura del laboratorio.
1. Adición en cada pocillo de los controles y sueros/leche problemas en la dilución indicada en el protocolo, de tal forma que si hay presencia de anticuerpos,
estos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte.
2. Incubación.
3. Lavado para eliminar los anticuerpos que no se hayan pegado al antígeno o
uniones inespecíficas. Es importante que la placa no se seque, lo que podría
incrementar la actividad inespecífica del ensayo.
4. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima (generalmente anti
IgG de especie), los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos.
5. Incubación.
6. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados (conjugado) que no hayan reaccionado.
7. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
8. Adición de la solución de frenado.
9. Lectura colorimétrica de la placa.
Figura 6: Esquema ELISA indirecto.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
35
�Desarrollo
Materiales y equipamiento:
• Lector de placas automático con filtros (405 nm, 414 nm, 450 nm).
• Computadora.
• Agitador orbital de placas.
• Lavador manual o automático de placas.
• Heladera (5 ± 3 º C) y freezer (-20 ± 5 ºC).
• Estufa de incubación (37 ± 2 ºC).
• Vórtex.
• Sistema purificador de agua (mínima calidad de agua requerida: destilada
o desionizada).
• Micropipetas monocanal de volumen variable (0,5 –10 µl, 5 - 50 µl, 50 -200
µl, 200 - 1000 µl).
• Micropipetas multicanal de volumen variable (5 - 50 µl, 30 -300 µl).
• Propipetas.
• Dispensadores automáticos.
• Timer.
• Selladores de placas de acetato o parafilm.
• Cubetas plásticas para pipetas multicanales.
• Microtubos (para realizar las diluciones previas de los sueros), tubos o
placas fondo en U.
• Criotubos de polipropileno para el almacenamiento de los sueros.
• Gradillas.
• Material de vidrio (probetas, pipetas, erlenmeyers, etc., de distintos volúmenes).
• Toallas o papel absorbente.
Reactivos:
Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el Senasa y contienen:
• Buffer de lavado
• Buffer de dilución
• Conjugado
• Sustrato cromógeno
• Solución de frenado
• Sueros controles
• Placas o tiras de 8 pocillos con el Ag pegado
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
36
�Precauciones para tener en cuenta al ejecutar la técnica de Elisa:
• Seguir expresamente las instrucciones del kit para la preparación de
todos los reactivos.
• Ambientar los reactivos del kit a temperatura ambiente por lo menos
una hora antes de su utilización.
• No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes lotes o kits.
• Evitar cualquier contaminación de los reactivos.
• No utilizar los kits una vez superada la fecha de caducidad.
• Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra y reactivo.
• Utilizar agua desionizada o destilada para la preparación / dilución de
los reactivos que se empleen en el ensayo.
• Corroborar que el lector de placas posee el filtro con el cual se debe
leer la placa y seguir las instrucciones de uso del equipo.
• Se recomienda trabajar las muestras por duplicado, para verificar la
repetibilidad del operador.
• Incluir sistemáticamente un control positivo y un control negativo siempre que se utilice el kit.
• El sustrato es extremadamente sensible a la luz y a las contaminaciones, por lo que, se recomienda retirar del frasco únicamente el volumen
que se vaya a utilizar y nunca devolver el sustrato sobrante al frasco original.
• La solución de frenado es un ácido fuerte. En caso de contacto con la
piel lavar inmediatamente con abundante agua.
Figura 7: Placa de Elisa.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
37
�ELISA por competición / bloqueo
La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS-l)
de Brucella sobre una matriz sólida (microplaca de 96 pocillos). A continuación,
se añade la dilución de los sueros y el anticuerpo monoclonal, específico para
un epitope de la cadena O del LPS-l. Se mezclan los dos junto con el antígeno
adherido y se dejan incubar. Después de la incubación, se lava la microplaca
y a continuación se añade el conjugado de anticuerpo antimonocolonal conjugado con enzima. Es importante mencionar que el anticuerpo del conjugado
ha sido previamente adsorbido con suero normal (no infectado) de bovino,
equino y humano para reducir las reacciones inespecíficas entre especies.
La etapa final de la prueba es la adición de la solución substrato/cromógeno.
Después de un periodo de tiempo fijo, se frena la reacción y se mide fotométricamente. Entre cada uno de los pasos del ensayo la placa debe ser lavada
debidamente.
En la ausencia de anticuerpos anti Brucella en los sueros problemas (sueros
negativos), el anticuerpo monoclonal se liga con el epitope de la cadena O del
LPS-l, lo cual es indicado en la prueba por el desarrollo de color. En el caso
que el suero problema contenga anticuerpos anti Brucella (suero positivo), estos
compiten con el anticuerpo monoclonal por sitios del epitope e inhiben el enlace del anticuerpo monoclonal con la porción de cadena O del LPS-l, manifestándose por la ausencia de color en el ensayo. Los sueros con anticuerpos
posvacunales por B. abortus cepa 19 compiten en menor grado con el anticuerpo
monoclonal porque su afinidad, especificidad y concentración es baja, lo que
usualmente resulta en una reacción negativa (excepto los animales vacunados en los tres meses anteriores al sangrado).
Diversos CELISA/bloqueo comerciales se encuentran disponibles en el mercado. En el caso del Elisa de bloqueo, sobre las placas con el LPS de Brucella abortus pegado, se depositan las muestras de suero, las cuales en el caso de contener anticuerpos específicos se unirán al antígeno. Tras eliminar el material
no unido mediante lavados, se añade el anticuerpo monoclonal específico del
LPS (epítope C) conjugado con una enzima. En el caso de que las muestras
contengan anticuerpos frente a LPS, estos no permitirán la unión del conjugado, mientras que, si las muestras no contienen este tipo de anticuerpos, el
conjugado se unirá libremente al antígeno de la placa.
Tras sucesivos lavados para eliminar el material no unido, podremos revelar las reacciones acontecidas en la placa mediante la adición del sustrato
adecuado, el cual desarrollará una reacción colorimétrica en presencia de
la enzima (es decir en presencia del monoclonal conjugado con enzima). De
este modo la aparición de una reacción coloreada, indicará que la muestra
evaluada no contiene anticuerpos específicos del LPS de Brucella spp. y la ausencia de color indicará que la muestra es positiva y contiene dichos anticuerpos.
Desarrollo
Materiales y equipamiento, reactivos, cuidados y precauciones, manejo y conservación de las muestras: Idem Elisa indirecto.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
38
�Figura 8: CELISA.
Tabla 4
Guía de problemas y soluciones en la técnica de ELISA
Señal
Posible causa
Solución
1. Error de pipeteo
2. Falta de mezcla de reactivos
3. Falta de lavados
Práctica
Mejorar técnica
Precaución
1. Se omitió el substrato
2. Concentración substrato errónea
Revisar
Revisar
3. Conjugado muy diluido
4. Se omitió el conjugado
Revisar
Revisar
Color parejo en toda la placa
1. Conjugado muy concentrado
2. Falla en el lavado
3. Substrato contaminado
Controlar
Mejorar técnica
Revisar
Elevado color de fondo
“background”
1. Reacción inespecífica
2. Material de vidrio sucio
3. Agua de mala calidad
Cambiar solución de lavado
Mejorar lavado
Controlar calidad
Desarrollo de color muy rápido
1. Substrato muy concentrado
2. Conjugado muy concentrado
Revisar
Controlar dilución
Desarrollo de color muy lento
1. Substrato muy diluido
2. Conjugado muy diluido
3. Concentración cromógeno errónea
Revisar
Revisar dilución
Revisar
Efecto borde
1. Incubación despareja
2. Resecación por aire
3. Tampón de lavado residual
Utilizar estufa
Mantener la placa cubierta
Eliminarlo
Color irregular
No hay color
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
39
�Figura 9: Modelo de protocolo de Trabajo ELISA.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
40
�Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos contra brucella en suero
El ensayo de polarización fluorescente (FPA) para la detección de anticuerpos
contra Brucella tiene la capacidad de ser una prueba multiespecies, lo que permite el diagnóstico presuntivo en bovinos, porcinos, caprinos, ovinos, ciervos y
bisontes.
Este ensayo, validado para bovinos, tiene la capacidad de distinguir animales
infectados con Brucella de los animales vacunados con B. abortus cepa 19 a partir de
los 3 meses posvacunación aproximadamente, y de los animales con reacción
cruzada con bacterias gramnegativas en más del 90% de los casos.
A diferencia de los enzimoinimunoensayos, el FPA es un ensayo homogéneo
que no requiere la necesidad de varias etapas de lavado. Los reactivos son
agregados secuencialmente en solución y el tiempo total de la prueba no excede los 5 minutos para cada muestra. En resumen, la prueba involucra la adición
de una determinada cantidad de suero a una solución tampón de dilución en un
tubo de vidrio. A continuación, la muestra es equilibrada por aproximadamente
cinco minutos, posteriormente se realiza una primera lectura en el analizador
fluorescente para obtener una lectura blanco de referencia (autofluorescente).
A continuación, el antígeno conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC)
es agregado a la solución y luego la muestra es equilibrada nuevamente por
un mínimo de dos minutos para permitir que el antígeno y el anticuerpo interactúen. La muestra es leída nuevamente en el polarizador. Si anticuerpos
específicos contra Brucella están presente (suero positivo), el resultado será un
valor alto de unidades de mili polarización (mP). En ausencia de anticuerpos
anti Brucella (suero negativo), el resultado es un valor bajo en mP.
El valor de corte para distintas especies animales para la República Argentina
se ha determinado en:
Bovinos:
• Animales negativos: < 94 mP.
• Animales sospechosos: Los valores entre 94 mP y 104 mP.
• Animales positivos: valores igual o mayor a 105 mP.
Caprinos y porcinos:
• Animales negativos: < 85 mP.
• Animales positivos: valores igual o mayor a 85 mP.
Ovinos (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis):
• Animales negativos: < 80 mP.
• Animales sospechosos: Los valores entre 80 mP y 90 mP.
• Animales positivos: valores igual o mayor a 91 mP.
Se modifica el valor de corte en la especie ovina (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis)
con una sensibilidad del 97 % y una especificidad del 95 %. Programa GraphPad Prism.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
41
�Desarrollo
Materiales y equipamiento:
• Lector de polarización fluorescente.
• Vórtex.
• Micropipetas monocanal de volumen variable (0,1– 10 µl, 20 –200 µl, 200–
1000 µl).
• Heladera (5 ± 3 º C) y freezer (-20 ± 5 º C).
• Tubos de vidrio: Tubos de borisilicato de 10 x 75 mm.
• Material de vidrio.
• Termómetro de temperatura ambiental.
• Computadora e impresora.
Reactivos:
Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el Senasa e incluyen:
• Buffer de dilución.
• Sueros controles positivo y negativo.
• Antígeno marcado con isotiocionato de fluoresceína.
Ejecución del ensayo
Preparación de los reactivos
Se deben seguir las instrucciones del prospecto que acompaña al kit comercial.
Preparación del equipamiento/instrumentos
El usuario debe leer el manual de instrucciones y familiarizarse con los controles de los instrumentos, calibración y la solución de los problemas de todos
los equipos previos a la ejecución del ensayo.
Preparación de la prueba
En el día de la prueba preparar y analizar los sueros controles, siguiendo con
lo especificado en los puntos indicados a continuación. Si el valor de mP de los
sueros controles no se ajusta dentro de los límites especificados, el ensayo
debe ser rechazado.
Dejar a temperatura ambiente los reactivos, sueros controles y problemas por
lo menos dos (2) horas antes de su uso. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo.
Encender el equipo y seguir las instrucciones de uso:
• Para bovinos dispensar 990 µl de la solución tampón de dilución de sueros
en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm).
• Dispensar 10 µl de suero bovino (dilución 1/100) a analizar dentro de los
tubos y mezclar bien con vórtex evitando la formación de espuma.
• Para porcinos y caprinos dispensar 960 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm).
• Dispensar 40 µl de suero porcino o caprino (dilución 1/25) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex.
• Para ovinos (B. melitensis) dispensar 975 µl de la solución tampón de dilución de sueros.
• Dispensar 25 µl de suero ovino (dilución 1/40).
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
42
�• Esperar como mínimo cinco minutos a que la solución suero-Buffer se
estabilice.
• Continuado el período de equilibración, realizar la lectura blanco de las
muestras.
• Dispensar 10 µl de antígeno conjugado con FITC determinado en cada
tubo y mezclar bien con vórtex.
Es importante evitar la formación de espuma en la muestra.
En caso de que el suero se vea contaminado con partículas en suspensión, dejar el suero equilibrarse por lo menos 10 minutos para asegurarse que estas
partículas hayan sedimentado o centrifugar el mismo. Las partículas inespecíficas pueden interferir con la lectura de la muestra dado que la misma se basa
en el peso molecular de las partículas en suspensión.
• Dejar que la muestra y el antígeno se equilibren por lo menos por dos
minutos.
• Leer las muestras exactamente en el mismo orden que fueron blanqueadas.
Figura 10: Esquema ensayo
de polarización fluorescente.
Lectura e interpretación
Los sueros controles del ensayo deben estar dentro de los límites especificados por el fabricante del kit utilizado según el control de calidad desarrollados
durante la estandarización, optimización e implementación del ensayo.
Los resultados de los sueros controles y problemas son expresados en unidades de mili polarización (mP) de la actividad del suero contra el antígeno.
Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente
al momento del ensayo.
Aceptación de los controles
Si los valores de mP de los sueros controles están fuera de los límites especificados, la prueba será rechazada y los controles y las muestras deben ser
repetidas.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
43
�Fijación de complemento
La fijación del complemento (FCT) es la prueba de referencia internacional
para el diagnóstico serológico de la brucelosis bovina, ovina y caprina.
La prueba permite la detección y cuantificación relativa de los anticuerpos específicos antibrucélicos “capaces de fijar” el complemento (IgG1 y algunas IgM específica), cuya presencia en determinados niveles posee una gran correlación
con el estado de “Animal infectado”.
La FCT es una prueba confirmatoria ampliamente usada y aceptada pese a la
complejidad de su realización y a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y mantener los reactivos adecuadamente.
La técnica se desarrolla en dos etapas: en la primera, el antígeno y el suero
problema (cuyo complemento se destruyó previamente por calentamiento a
baño maría) se incuba en presencia de complemento de cobayo. Después de
dejar reaccionar la mezcla de reactivos, se mide en la segunda etapa la cantidad de complemento libre (que indica la ausencia o presencia de anticuerpos
antibrucelares en suero y su cantidad) mediante la incorporación de un “sistema indicador” o “sistema hemolítico” formado por eritrocitos de carneros recubiertos de anticuerpos de conejo (hemolisina) como complejo antígeno-anticuerpo alternativo.
La presencia de anticuerpos en el suero problema induce la formación de inmunocomplejos en la primera etapa de la reacción que determina la activación del sistema complemento y el agotamiento de sus factores. En la segunda
etapa de la reacción no existe complemento libre que pueda activarse ante la
presencia del “sistema hemolítico”. El resultado es la ausencia de hemólisis
(resultado positivo). Alternativamente, la lisis de los eritrocitos (hemólisis) es
indicadora de la existencia de complemento libre en la segunda etapa de la
reacción, que no se agotó en la primera por no haberse formado inmunocomplejos ante la ausencia de anticuerpos antibrucelares (resultado negativo).
Se han propuesto varios métodos para FCT que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (GR) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al 2 %, 2,5 % o al 3 %). Los GR están sensibilizados
con un volumen igual de suero anti-GR de conejo diluido (hemolisina) hasta
contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentración mínima necesaria para producir un 100 % de lisis de los GR en presencia de soluciones titulada de complemento de cobayo.
Desarrollo
Materiales:
• Tubos de ensayo.
• Material de vidrio de volúmenes varios.
• Gradillas.
• Film para cubrir placas.
• Puntas de pipetas (tips).
• Placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U.
• Cubetas o reservorios de plástico para reactivos.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
44
�Equipos:
• Pipetas monocanales con rangos de 2 µl a 20 µl, 20 µl a 200 µl y 500 µl a
5000 µl.
• Pipetas multicanales de rango 20 µl a 200 µl.
• Centrífuga.
• Centrífuga de placas.
• Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC).
• Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 °C).
• Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 °C).
• Agitador de microplacas.
• Vórtex.
• Baño térmico.
• Espectrofotómetro.
Reactivos:
• Solución buffer: Ver Anexo FCT I Solución GR 2%: ver Anexo FCT II Titulación Hemolisina: Ver Anexo FCT III Sistema hemolítico Anexo FCT IV
• Titulación Complemento: Ver Anexo FCT V Titulación Antígeno: Ver Anexo
FCT VI
Sueros controles:
• Suero control positivo bovino.
• Suero control negativo bovino.
Manejo y conservación de las muestras
• Conservar los sueros en heladera (5 ± 3 º C) no más de dos días, para
períodos mayores, conservarlos a –20 ± 5 º C.
• Evitar repetidos ciclos de congelamiento/ descongelamiento.
• No usar sueros contaminados, que presenten precipitados o intensa
hemólisis.
• Homogeneizar con el uso de vórtex los sueros antes de usarlos.
Inactivación de los sueros
Los sueros controles y las muestras de suero se inactivan 30 minutos en baño
termostático a 58 ± 2 ºC para eliminar el complemento natural contenido en
las mismas. La temperatura del baño termostático se controla mediante la introducción de un termómetro certificado en el agua durante todo el tiempo de
exposición de las muestras.
- Los sueros ovinos se inactivan por 30 minutos en baño termostático entre
60 - 63 °C (en caso de que los sueros sean anticomplementarios, se recomienda realizar otro ciclo de inactivación de 30 minutos).
- Las muestras podrán ser sumergidas en el baño termostático en tubos
de ensayo tapados herméticamente, contenidos en gradillas, debidamente
identificados. Volumen de suero sugerido para inactivar: 200 µl.
- La inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del análisis. En este caso, una vez retiradas del baño termostático se dejan a tem-
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
45
�peratura ambiente durante al menos 30 minutos para luego conservar en
heladera. Si el análisis se realiza después de las 24 horas, las muestras ya
inactivadas se conservan a -20 ± 5 ºC.
Condiciones del ensayo
El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37 ± 2 º C) y
se utilizan los siguientes reactivos en volúmenes de 25 µl:
a. Diluciones en base 2, a partir de 1/2 de los sueros problemas en SB.
b. Solución de complemento de cobayo en SB que contenga 2 UC (100 %).
c. Solución de antígeno en SB a la dilución de trabajo.
d. Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales, de una
solución de suero hemolítico en SB que contenga 2UH (100 %) y de una suspensión de glóbulo rojos de carnero en SB al 2 %.
Ejecución
Dependiendo del número de muestras que se realizarán, se podrán incluir los controles en la misma placa o utilizar una placa para los sueros y otra para los controles.
Dilución de las muestras de suero
El procedimiento de dilución se realiza de forma general en placa fondo en U,
mediante la utilización de volúmenes de 25 μl.
La secuencia de operaciones se detalla en la tabla 1. La homogeneización de
los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta.
Tabla 1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
Suero
25 µl
25 µl
de la
dilución
1/2
25 µl
de la
dilución
1/4
25 µl
de la
dilución
1/8
25 µl
de la
dilución
1/16
25 µl
de la
dilución
1/32
25 µl
de la
dilución
1/64
25 µl
de la
dilución
1/128
SB
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25µl
Sueros controles
Control positivo: El procedimiento de dilución se realiza mediante la utilización
de volúmenes de 25 μl, siguiendo la secuencia de operaciones que se detalla
en la tabla 2. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se
realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta.
Tabla 2
1/12,5 1/25
Suero
positivo
01/05
25 µl
SB
-
25 µl
25 µl
1/50
1/100
1/200 1/400
1/800 1/1600
25 µl
de la
dilución
1/25
25 µl
de la
dilución
1/50
25 µl
de la
dilución
1/100
25 µl
de la
dilución
1/200
25 µl
de la
dilución
1/400
25 µl
de la
dilución
1/800
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25µl
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
46
�Control negativo: El suero control negativo se diluye siguiendo el mismo protocolo de los sueros problema (1/2, 1/4, 1/8 etc.).
Controles del ensayo
a. Control de la ausencia de poder anticomplementario del antígeno: Se dispensa por duplicado en la placa 25 μl/pocillo de SB, 25 μl/pocillo de C y 25
μl/pocillo de antígeno.
b. Control sistema hemolítico con complemento: Se dispensa por duplicado
en la placa 50 μl/pocillo de SB y 25 μl/pocillo de C.
c. Control sistema hemolítico sin complemento: Se dispensa por duplicado
en la placa 75 μl/pocillo de SB.
Disposición de los sueros en la placa
Los controles y muestras diluidas deben quedar dispuestas en la placa fondo
en U (25 µl/pocillo) según indica la tabla 3.
Tabla 3
1
Control
positivo
2
Control
negativo
3
muestra
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
1/12,5 1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
B
1/25
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
C
1/50
1/8
1/8
1/8
1/8
1/8
1/8
1/8
1/8
1/8
1/8
1/8
D
1/100
1/16
1/16
1/16
1/16
1/16
1/16
1/16
1/16
1/16
1/16
1/16
E
1/200
1/32
1/32
1/32
1/32
1/32
1/32
1/32
1/32
1/32
1/32
1/32
F
1/400
1/64
1/64
1/64
1/64
1/64
1/64
1/64
1/64
1/64
1/64
1/64
G
1/800
1/128
1/128
1/128
1/128
1/128
1/128
1/128
1/128
1/128
1/128
1/128
H
1/1600 1/256
1/256
1/256
1/256
1/256
1/256
1/256
1/256
1/256
1/256
1/256
Preparación y dispensado de las soluciones de antígeno y complemento
• Preparar la solución de C según la dilución de trabajo establecida como
óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todas las muestras.
• Preparar la solución de antígeno según la dilución de trabajo establecida
como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todos los pocillos salvo en la dilución 1/2 (muestras y control negativo) y 1/12,5 (control
positivo) Fila A, las cuales actuarán como controles de poder anticomplementario (PAC) de cada suero.
Primera incubación en caliente
• Tapar y agitar la placa en agitador de placas durante 2-4 minutos.
• Incubar a 37 ± 2 ºC durante 30 minutos.
Dispensado del sistema hemolítico
• Quince (15) minutos antes de finalizar la primera incubación, preparar e
incubar a 37 ± 2 ºC durante 15 minutos el sistema hemolítico según el Anexo
FCT IV.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
47
�• Finalizada la primera incubación, dispensar 25 μl/ pocillo del sistema hemolítico en todos los pocillos de las placas incluida la placa de los controles.
Segunda incubación en caliente
• Tapar y agitar las placas en agitador de placas durante 2-4 minutos.
• Incubar a 37 ± 2 ºC durante 30 minutos.
Centrifugación de la placa
Finalizada la incubación, centrifugar la placa a una fuerza de 1000 RPM
durante 3 minutos o bien dejarla en reposo en heladera durante una hora
antes de su lectura.
Lectura de resultados
El grado de fijación del complemento se manifiesta por la presencia (negativos) o ausencia (positivos) de hemólisis del sistema hemolítico. La reacción
positiva se cuantificará mediante la determinación del título y su grado de
hemólisis.
Reacción positiva
• Sedimento en grado variable de los glóbulos rojos en el fondo del pocillo.
• El sobrenadante estará afectado por un cierto tinte rojizo en función de la
hemólisis que se haya producido. Este grado de hemólisis debe cuantificarse y consignarse mediante un sistema de cruces.
Figura 11: Placa fijación
de complemento.
++++
Sobrenadante translúcido, en el fondo botó de
depósito de GR
0 % de hemólisis
+++
Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad,
en el fondo un deposito claro de GR
25 % de hemólisis
++
Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad,
en el fondo un deposito tenue de GR
50 % de hemólisis
+
Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad,
en el fondo un deposito muy tenue de GR
75 % de hemólisis
Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de
depósito de GR
100 % de hemólisis
Negativo
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
48
�Determinación del título del suero
Será la inversa de la dilución más alta que siga dando algún grado de sedimentación de los GR. Este grado de fijación será informado mediante el sistema de
cruces descripto y convertido a UIFCT.
- En el caso de los bovinos vacunados con Brucella abortus S19, para el diagnóstico de las Brucellas lisas (B. abortus), se considera un resultado positivo cualquier
valor ≥ 40 UIFCT (1/8 ++).
- Para animales no vacunados (bovinos, caprinos, ovinos y porcinos) se considera positivo cualquier valor ≥ 20 UIFCT (1/4 ++).
Expresión de los resultados en unidades internacionales de fijación del complemento
El sistema de expresión de los resultados en UIFCT, ajustados al suero patrón
internacional OIEISS (en el caso de las Brucellas lisas), usado a continuación, se
basa en el “Procedimiento IZS TE B2. 1.6 SOP 004 del Centro Internacional de
Referencia OIE para Brucelosis” (Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Teramo. Italia) y el “Manual de Procedimiento del Laboratorio Agroalimentario” (Gobierno de Aragón. España. Tabla 4).
Tabla 4
Interpretación en UIFCT
Dilución
% de Fijación del
Complemento
1000 UIFCT (1/200)
+
++
+++
++++
16,6
20
23,2
26,6
1:8
+
++
+++
++++
33,2
40
46,4
53,2
1:16
+
++
+++
++++
66,4
80
92,8
106,4
+
++
+++
++++
132, 8
160
185,6
212,8
1:64
+
++
+++
++++
265,6
320
371,2
425,6
1:128
+
++
+++
++++
531,2
640
742,4
851,2
+
++
+++
++++
1062,4
1280
1484,8
1702,4
1:4
1:32
1:256
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
49
�Controles del ensayo
La aprobación del ensayo debe realizarse si los controles han dado los resultados esperados:
Controles
Resultado esperado
Suero control positivo
50 % de fijación (++)
en la dilución 1:200 que corresponde
a 1000 UIFCT (Brucellas lisas)
Suero control negativo
100 % de hemólisis
en todos las diluciones, ausencia de
fijación de complemento
Control de poder anticomplementario
de los sueros
100 % de hemólisis
ausencia de fijación del complemento
en la dilución 1:2 (sin antígeno)
Control de ausencia de poder
anticomplementario del antígeno
100 % hemólisis
Control del sistema hemolítico sin C
0 % de hemólisis
Control del sistema hemolítico con C
100 % de hemólisis
Criterio de aceptación del análisis:
El ensayo se debe considerar APROBADO/NO APROBADO
a) APROBADO:
• Los controles de antígeno, sistema hemolítico con y sin complemento
dan los resultados pre-establecidos.
• El control de suero positivo da el resultado pre-establecidos (1:200) con
una variación máxima de (± 2 ++).
• El control negativo da un resultado Negativo.
b) NO APROBADO: si uno de los controles no da el resultado esperado, se
repite el ensayo.
La presencia de, al menos, un 25 % de sedimento de eritrocitos (+) de la fila A
(dilución ½) indica poder anticomplementario en la muestra. En este caso, se
informa el resultado de PAC, lo que implica la solicitud de una nueva extracción
de la toma de muestra.
Para facilitar la lectura e interpretación de los resultados se puede preparar
una escala visual del siguiente modo:
• En un tubo se coloca 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2 % + 900
µl de SB 1X.
• En otro tubo colocar 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2 % + 700
µl de agua destilada, agitar para provocar la completa hemólisis de los GR
(solución de hemoglobina), y agregarle 200 µl de SB 5X para mantener la
presión osmótica.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
50
�Estos dos tubos mantienen la misma relación de GR. intactos en el primer caso
y de glóbulos lisados en el segundo, que el que el 0 % de hemólisis y el 100 %
de hemólisis en la prueba.
De esta manera mezclándolas en distintas proporciones podremos obtener la
imagen que corresponde a los distintos grados de hemólisis, luego de centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm.
PORCENTAJE DE HEMÓLISIS
Reactivos en µl
0%
Solución
hemolisada
Suspensión de
glóbulos rojos
0
100
10 %
10
90
20 %
20
80
30 %
40 %
50 %
60 %
70 %
80 %
90 %
30
40
50
60
70
80
90
100
60
50
40
30
20
10
0
70
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
100 %
51
�Anexos
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
52
�Anexo FCT
I: Solución Buffer (SB)
Realizar una solución de stock de calcio/magnesio como indica la tabla 1,
luego conservar en refrigeración durante 6 meses o eliminar si hay turbidez
producto de contaminación.
Solución de stock calcio 0,3 M y magnesio 1 M
Ca Cl2. Mg
3,7g
Cl2.
9,5 g
Agua destilada
100 ml
• Añadir 1ml de solución stock a 1 litro de solución salina 0,85 % (NaCl2
8,5 g/agua destilada 1 litro).
• La solución de trabajo debe tener un pH de 7,3 - 7,4.
• Luego de su uso, conservar en refrigeración por 7 días.
II: Preparación de la suspensión de GR 2 %
a) Lavado de los GR
1. Homogeneizar cuidadosamente el frasco que contiene los eritrocitos.
2. En un tubo cónico resuspender los eritrocitos en una proporción de 1 volumen de GR + 5 volúmenes de SB, luego homogeneizar cuidadosamente.
3. Centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 5 minutos y luego
eliminar el sobrenadante con una pipeta.
4. Repetir la resuspensión de los GR en SB, centrifugar de la misma manera anteriormente descripta y luego eliminar el sobrenadante con una
pipeta.
5. Realizar la última resuspensión de los GR en SB y centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 10 minutos.
6. Luego de la última centrifugación descartar el sobrenadante, el cual
debe estar libre de hemólisis.
7. El método para la estandarización de la suspensión de glóbulos rojos 2
% se podrá realizar por medio de dos técnicas.
• Método espectrofotométrico.
• Método en cámara de Neubauer.
Método espectrofotométrico:
1. Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB
(2 %).
2. Realizar un blanco de lectura en el espectrofotómetro dispensando 2,5
ml agua destilada en la celda o tubo del espectrofotómetro.
3. Determinar la lisis 100 % de los GR realizando una dilución 1/15 con
agua destilada, agregando en un tubo que contiene 2,8 ml de agua destilada 0,2 ml de glóbulos rojos al 2 %.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
53
�4. Una vez lisados los eritrocitos, leer la densidad óptica (DO) a 545 nm.
5. La DO esperada debe ser de 0.330 ± 0.05. El laboratorio debe determinar
según el modelo de espectrofotómetro cual es la DO optima que indique la
concentración de GR al 2 %.
Método en cámara de Neubauer:
1. Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlos en 9,8 ml de SB
(2 %).
2. Realizar una dilución 1/200 y hacer el recuento de glóbulos rojos en la
cámara.
3. La suspensión deberá tener 5,4 (± 0,2) X 108 GR / ml.
III: Titulación Hemolisina
Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina
Se prepararán 15 diluciones de hemolisina (tabla 1). En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de hemolisina. La solución se homogeniza mediante agitación en vórtex.
Tabla 1: Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina
N.° de tubo
Dilución
SB (ml)
Hemolisina
1
1/50
4,9
100 µl
2
1/100
2
2 ml T1
3
1/150
7,45
50 µl
4
1/200
1
1 ml T2
5
1/250
12,5
50 µl
6
1/500
1
1 ml T5
7
1/1000
6
2 ml T5
8
1/2000
1
1 ml T7
9
1/3000
2
1 ml T7
10
1/4000
3
1 ml T7
11
1/5000
4
1 ml T7
12
1/6000
5
1 ml T7
13
1/7000
3
0,5 ml T7
14
1/8000
3,5
0,5 ml T7
15
1/9000
4
0.5 ml T7
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
54
�Preparación de las soluciones “hijas” de hemolisina
• En la filas B, C, D, G y H de una placa fondo en U dispensar 25 µl/pocillo
de SB excepto de las columnas 10, 11 y 12 de las filas A, B, C y D (tabla 2).
• En la filas A (excepto las columnas 10, 11 y 12) y F de la placa dispensar
50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de hemolisina preparadas en la
batería de tubos de ensayo, según protocolo de la tabla 1.
• Con una pipeta multicanal recoger 25 µl por pocillo de la fila A y pasar a
la fila B. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se
realiza mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensado de la pipeta. Recoger 25 µl / pocillo de la fila B y pasar a la fila.
• Volver a homogenizar. Recoger 25 µl / pocillo de la fila C y pasar a la D.
Homogeneizar y recoger 25 µl / pocillo y descartar.
• De la misma forma, haga diluciones de la fila F sobre las filas G y H.
• Las diluciones finales obtenidas se detallan en la tabla 3.
Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones ‘’madres’’ de hemolisina y SB
1
A
B
C
D
2
3
4
5
6
7
8
9
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
550 µl
50 µl
50 µl
de T1
de T1
de T1
de T2
de T2
de T3
de T3
de T4
de T4
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
10
11
12
E
F
G
H
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
de T5
de T5
de T6
de T7
de T8
de T9
de T10
de T11
de T12
de T13
de T14
de T15
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de
SB
SB
SB
SB
SB
SB
SB
SB
SB
SB
SB
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
SB
55
�Tabla 3. Diluciones finales de hemolisina
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
1/50
1/50
1/50
1/100
1/100
1/150
1/150
1/200
1/200
B
1/100
1/100
1/100
1/200
1/200
1/300
1/300
1/400
1/400
C
1/200
1/200
1/200
1/400
1/400
1/600
1/600
1/800
1/800
D
1/400
1/400
1/400
1/800
1/800
1/1200
1/1200
1/1600
1/1600
F
1/250
1/250
1/500
1/1000
1/2000
1/3000
1/4000
1/5000
1/6000
1/7000
1/8000
1/9000
G
1/500
1/500
1/1000
1/2000
1/4000
1/6000
1/8000 1/10000 1/12000 1/14000 1/16000 1/18000
H
1/1000
1/1000
1/2000
1/4000
1/8000 1/12000 1/16000 1/20000 1/24000 1/28000 1/32000 1/36000
E
Preparación y dispensado de la suspensión de glóbulos rojos
Se prepara una suspensión de GR al 2 % según lo indicado anteriormente. En
este ensayo se prepara una suspensión de 5 ml.
1. Dispensar la suspensión (25 µl/pocillo) en los pocillos de la microplaca.
2. Cubrir y agitar la microplaca en un agitador de placas durante 30 minutos
a bajas revoluciones. Esto proporciona la sensibilización de los GR (unión
con los anticuerpos presentes en las diluciones de hemolisina).
3. Dispense 25 µl/pocillo de SB en las filas A, B, C, D, F, G y H. En los pocillos de la columna 1 se dispensan adicionalmente otros 25 µl (esta columna
actúa como control del poder hemolítico de la hemolisina).
Preparación y dispensado de una solución de complemento
El objeto es preparar una solución de complemento a una concentración tal que
siempre haya reactivo disponible para detectar una posible unión de Ag (GR) Ac (hemolisina diluida).
Para complementos (comerciales) que den un título (unidad de complemento)
superior a 1/90, debe prepararse una solución de 1/30. Para complementos que
den títulos inferiores, la solución que se deberá preparar será de 1/10 - 1/20
(tabla 4).
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
56
�Tabla 4: Dilución del complemento
TV
Complemento
Solución de complemento 1/20
5,7 ml
0,3 ml
Solución de complemento 1/30
5,8 ml
0,2 ml
1. Dispensar 25 µl/pocillo de la solución de complemento en las filas A, B, C,
D, F, G y H, excepto en los pocillos de la columna 1.
2. Cubrir y agitar la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas.
Incubación
Incubar a 37 ± 2 ° C, durante 30 minutos.
Cálculos y expresión de resultados
El resultado de la relación de cada pocillo se evalúa por el grado de hemólisis
presente en el mismo y se consigna mediante un sistema de cruces (tabla 5).
Tabla 5: Expresión de resultados
++++
Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de
depósito de GR
0 % de hemólisis
+++
Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad,
en el fondo un deposito claro de GR
25 % de hemólisis
++
Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad,
en el fondo un deposito tenue de GR
50 % de hemólisis
+
Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad,
en el fondo un deposito muy tenue de GR
75 % de hemólisis
Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR
100 % de hemólisis
Negativo
Los resultados de la lectura se emiten en la hoja de laboratorio correspondiente.
Cálculos de los resultados
• Se define la unidad de hemólisis (UH) como la dilución más alta que permita la lisis del 100 % de los eritrocitos en el pocillo.
• Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis,
constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de hemólisis
presentan un grado de hemólisis similar.
• Se elige la UH de la dilución en la que se obtenga 100 % de hemólisis. Si
existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (mayor
concentración de hemolisina).
• La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UH, es decir
2 UH 100 %.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
57
�Ejemplo: Si la UH se ha establecido en 1/1000 DT= 2 x 1/1000= 1/500
• Los cálculos y las proporciones finales de reactivos se registran en hojas
de trabajo.
• Se podrá realizar una dilución 1/50 o 1/100 de la hemolisina en SB conservando a -20 ± 5 º C para luego diluirla al título de trabajo. Se registra el lote,
fecha y cantidad de hemolisina diluida.
IV: Sistema hemolítico
• Para la preparación del sistema hemolítico, el volumen total del sistema
depende del número de placas que se deberán utilizar (1 placa= 96 pocillos
fondo en U).
Ejemplo para dos placas:
2 placas x 2,4 ml = 4.8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional
en previsión de perdidas)
• Dispensar en un frasco 2,5 ml de GR 2 % y luego 2,5 ml de hemolisina al
título de uso agitando suavemente para homogenizar las dos suspensiones
e incubar a 37 ± 2° C, durante 15 minutos.
V: Titulación complemento
Se llama complemento al suero de cobayo completo, que contiene el sistema
enzimático denominado ‘’sistema complemento’’, cuya función en la técnica de
fijación del complemento es la de detectar uniones especificas antígeno-anticuerpo. En el caso que en dichas uniones una de las partes sean glóbulos rojos,
es capaz de lisarla, como en el caso del sistema hemolítico que se utiliza en la
reacción de fijación del complemento, donde los hematíes de carnero hacen el
papel de antígeno y el suero de conejo (hemolisina) de anticuerpos.
El complemento que sea objeto de titulación debe descongelarse dejándolo
llevar a temperatura de laboratorio. Una vez reconstituido o descongelado se
mantendrá en refrigeración y solo se sacará de la heladera en el momento de
su utilización. Si se prevé que se va a utilizar más de un vial, se juntarán todos
en uno y se titulará el conjunto.
Preparación de las soluciones “madres” del complemento
1. Realizar 6 diluciones “madres’’ del complemento, empleando para ello
tubos de ensayo. Tabla 1 de este anexo.
2. En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de complemento. La solución se homogeneiza perfectamente mediante un agitador.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
58
�Tabla 1. Diluciones “madre” del complemento
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
SB µl
725
850
975
1100
1225
1350
C µl
25
25
25
25
25
25
Preparación de las soluciones “hijas” en placas de ensayo y dispensado del SB
1. En la filas B, C y D de una placa fondo en U, dispense 25 µl/pocillo de SB
(tabla 2).
2. En la filas A de la placa, dispense 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’
de complemento por duplicado según protocolo descripto en tabla 1.
3. Con una pipeta multicanal, recoja 25 µl/pocillo de la fila A y trasváselos a
la fila B. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se
propiciará mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensación de la
pipeta. Recoja 25 µl/pocillo de la fila B y páselo a la fila.
4. Vuelva a homogenizar. Recoja 25 µl/pocillo de la fila C y páselo al D. Homogenice y recoja 25 µl/pocillo y descártelos (las diluciones que han quedado preparadas en la placa se detallan en la tabla 3).
5. Dispense a continuación 50 µl/pocillo de SB en todas las filas de la placa.
6. Agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas.
Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones “madres’’ de complemento y SB
1
A
B
C
D
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
de T1
de T2
de T4
de T2
de T5
de T6
de T1
de T2
de T4
de T2
de T5
de T6
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
25 µl
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
de SB
E
F
G
H
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
59
�Tabla 3. Diluciones finales del complemento
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
1/30
1/35
1/40
1/45
1/50
1/55
1/30
1/35
1/40
1/45
1/50
1/55
B
1/60
1/70
1/80
1/90
1/100
1/110
1/60
1/70
1/80
1/90
1/100
1/110
C
1/120
1/140
1/160
1/180
1/200
1/220
1/120
1/140
1/160
1/180
1/200
1/220
D
1/240
1/280
1/320
1/360
1/400
1/440
1/240
1/280
1/320
1/360
1/400
1/440
E
F
G
H
Cubra la placa para evitar evaporación excesiva e incube en estufa a 37 ± 2 °C durante 15 minutos.
Dispensado del sistema hemolítico
El sistema hemolítico habrá sido preparado según procedimiento descripto
anteriormente.
1. Finalizada la incubación de la placa, dispense 25 µl / pocillo del SH en
todos los pocillos de la placa.
2. Cubra y agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas.
3. Incube en estufa a 37 ± 2 °C durante 30 minutos.
Centrifugación de la placa
Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
60
�Expresión de resultados
El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces:
Tabla 4
++++
Sobrenadante translúcido, en el fondo botón
de depósito de GR
0 % de hemólisis
+++
Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad,
en el fondo un deposito claro de GR
25 % de hemólisis
++
Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad,
en el fondo un deposito tenue de GR
50 % de hemólisis
+
Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad,
en el fondo un deposito muy tenue de GR
75 % de hemólisis
Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de
depósito de GR
100 % de hemólisis
Negativo
Cálculos de los resultados
1. Se define la unidad de complemento (UC) o unidad hemolítica como la dilución más alta que permita la lisis del 100 % de los eritrocitos en el pocillo.
2. Sobre la hoja del laboratorio se comprobará la respetabilidad del análisis,
constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de complemento presentan un grado de hemólisis similar.
3. Se elige la UC con la dilución más alta que de 100 % de hemólisis.
4. La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UC.
Ejemplo: supongamos que se necesite preparar una solución de complemento para utilizar en el análisis de 2 placas según el procedimiento
descripto. Ello supone un volumen total de solución de complemento de
2 placas x 2,4ml / placa = 4,8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional
en previsión de pérdidas).
a. Supongamos que UC = 1/100
DT= 2 x UC= 2 x 1/100 = 1/50
Si en 50 ml de SB se dispensa 1 ml de C puro:
En 5 ml de SB se dispensan x. x= 5/50= 0,1 ml
b. Por tanto las proporciones serán: 0,1 ml de complemento y 4,9 ml
de SB.
Tubo 1
(2 unidades)
Tubo 2
(1,5 unidades)
Tubo 3
(1 unidades)
Tubo 4 (0,75
unidades)
Tubo 5 (0,5
unidades)
C: 2 unidades (µl)
400
300
200
150
100
SB (µl)
0
100
200
250
300
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
61
�Control de dos unidades de complemento (2 UC)
Una vez obtenida la dilución de trabajo, se realizarán diluciones del complemento que contengan 2 unidades; 1,5 unidades; 1 unidad; 0,75 unidades y 0,5
unidades. Para ello trabajaremos según la siguiente secuencia (tabla 5).
Tabla 5. Diluciones del complemento
Tubo 1
(2 unidades)
Tubo 2
(1,5 unidades)
Tubo 3
(1 unidades)
Tubo 4 (0,75
unidades)
Tubo 5 (0,5
unidades)
C: 2 unidades (µl)
400
300
200
150
100
SB (µl)
0
100
200
250
300
Se dispensarán por duplicado 25 µl/pocillo de cada una de las diluciones en
los correspondientes pocillos de una placa y luego se completan con 50 µl de
SB (tabla 6).
Tabla 6. Unidades del complemento en la placa
1
2
3
4
5
A
2U
1, 5U
1U
0,75 U
0,5 U
B
2U
1, 5U
1U
0,75 U
0,5 U
6
7
8
9
10
11
12
C
D
E
F
G
H
1. Cubra la placa para evitar evaporación excesiva, agite 2-4 minutos e
incube en estufa a 37 ± 2 ° C durante 15 minutos.
2. Luego repita lo descripto agregando el SH
Lectura del análisis:
• Pocillo con 2 unidades: 100 % de hemólisis
• Pocillo con 1,5 unidades: 100 % de hemólisis
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
62
�• Pocillo con 1 unidades: 100 % de hemólisis o traza de GR en suspensión
• Pocillo con 0,75 unidades: 0 % a 75 % de hemólisis
• Pocillo con 0,5 unidades: 0 % a 50 % de hemólisis
Control de calidad
El ensayo debe ser repetible: pocillos con diluciones iguales deben tener un
grado de reacción similar. En caso contrario se repetirá el análisis.
Debe observarse cada gama de reacciones posibles desde diluciones con el
100 % (N) de hemólisis (las más bajas), hasta diluciones con el 0 % (++++) de
hemólisis (las más alta). En caso contrario se repetirá el análisis.
En el control de 2 unidades de complemento deben dar los resultados preestablecidos.
El análisis debe informarse como APROBADO / NO APROBADO en el apartado
de observaciones de la planilla de titulación del complemento. En caso de no
aprobado, se repite el proceso.
VI: Titulación antígeno
Se utiliza el antígeno de seroaglutinación en tubo (SAT) volumen celular aproximado de 4,5 %.
Se trata de determinar lo que se denomina UA (unidad antigénica) que corresponde para cada lote de antígeno y será la dilución óptima de uso para garantizar la unión con los anticuerpos presentes en los sueros problema, en la
cantidad suficiente para fijar el complemento.
El antígeno formará el complejo antígeno-anticuerpo con los anticuerpos presentes de los sueros problema y que serán capaces de fijar el complemento.
Esta reacción requiere un título mínimo para que se lleve a cabo, es decir, se
debe garantizar una concentración mínima de antígeno que reaccione con los
anticuerpos y sea capaz de fijar el complemento.
Preparación de diluciones “madre” de antígeno
Se preparan tres diluciones previas en tubos, luego se dispensarán:
• en un tubo 500 µl de SB y 10 µl de antígeno;
• en un segundo tubo 750 µl de SB y 10 µl de antígeno;
• en un tercer tubo 1250 µl de SB y 10 µl de antígeno.
Esto da una dilución de 1/50, 1/75 y 1/125, respectivamente.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
63
�Preparación de las diluciones “hijas” de antígeno
En una placa de fondo en U se dispensan 25 µl de SB en todos los pocillos salvo
en la columna 1 y los pocillos A10, A11, A12. La fila C y F no se utilizarán hasta la
columna 9 (tabla 1). En la columna 1 se pondrán 50 µl de las soluciones madres
del antígeno por duplicado y en los pocillos A10, A11, A12 de forma simple (tabla
1). Se diluye pasando 25 µl sucesivamente de estos pocillos a los siguientes
consiguiendo diluciones al duplo del antígeno. Las diluciones se realizan de la
columna 1 a la columna 9 y de los pocillos A10, A11, A12 hasta los pocillos H10,
H11 y H12. Es decir, se pasan 25 µl de la columna 1 a la 2, se homogeniza y se
pasan otros 25 µl a la columna 3 y así sucesivamente, y se eliminan los 25 µl que
sobran en la columna 9 y lo mismo en vertical en las columna 10, 11 y 12.
Tabla 1. Diluciones ‘’hijas’’ del antígeno
1
2
3
4
5
6
7
A
1/50
1/100
1/200
1/400
1/800
1/1600
1/3200
B
1/50
1/100
1/200
1/400
1/800
1/1600
1/3200
8
9
10
11
12
1/6400 1/12800
1/50
1/75
1/125
1/6400 1/12800
1/100
1/150
1/250
1/200
1/300
1/500
C
D
1/75
1/150
1/300
1/600
1/1200
1/2400
1/4800
1/9600 1/19200
1/400
1/600
1/1000
E
1/75
1/150
1/300
1/600
1/1200
1/2400
1/4800
1/9600 1/19200
1/800
1/1200
1/2000
1/1600
1/2400
1/4000
1/8000
F
G
H
1/125
1/250
1/500
1/1000
1/2000
1/4000
1/8000
1/16000 1/32000 1/3200
1/4800
1/125
1/250
1/500
1/1000
1/2000
1/4000
1/8000
1/16000 1/32000 1/6400
1/9600 1/16000
Dispensado de sueros controles positivo y negativo
Seguidamente se dispensan 25 µl de suero control positivo en los pocillos de la
fila A, B, D, E, G y H salvo en las columnas 10, 11, 12 donde se dispensan 25 µl
de suero control negativo y servirá como control de hemolisis.
El suero control positivo debe ir a una dilución igual al título conocido (1/200) en
la reacción de fijación del complemento.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
64
�Dispensado de una solución de complemento
Posteriormente se dispensan 25 µl de complemento a todos los pocillos según
el título obtenido previamente. Se agita la placa 2-4 minutos y se incuba durante 30 minutos a 37 ± 2°C.
Dispensado del sistema hemolítico
Tras la incubación de la placa se procede a dispensar 25 µl de sistema hemolítico a todos los pocillos. Luego se agita la placa 2-4 minutos e incubará durante
otros 30 minutos a 37 ± 2°C.
Centrifugación de la placa
Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos.
Expresión de resultados
El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces.
Tabla 2
++++
Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de
depósito de GR
0 % de hemólisis
+++
Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad,
en el fondo un depósito claro de GR
25 % de hemólisis
++
Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad,
en el fondo un depósito tenue de GR
50 % de hemólisis
+
Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad,
en el fondo un depósito muy tenue de GR
75 % de hemólisis
Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR
100 % de hemólisis
Negativo
Los resultados de la lectura se registran en la hoja de laboratorio correspondiente
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
65
�Cálculos de los resultados
1. Se define la unidad de antígeno (UA) como la dilución más alta que permita una fijación completa (0 % de hemolisis).
2. Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis,
constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de antígeno
presentan un grado de hemólisis similar.
3. Se elige la UA a dilución en la que se obtenga el 0 % de hemólisis. Si
existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (de mayor
concentración de antígeno).
4. La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UA.
Ejemplo: supongamos que la UA se ha establecido 1/800:
DT= 2 x UA= 2 x 1/800 = 1/400
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
66
�Anexo I
Modelo de planilla de emisión de resultados
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
67
�Bibliografía
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
68
�Normativa vigente
Ley 24.696 de año. Por la cual se declara de interés nacional el control y erradicación de la enfermedad reconocida como Brucelosis (Brucella abortus) en
las especies bovina, suina, caprina y otras en todo el Territorio Nacional. 26 de
septiembre de 1996. B.O. N.º 28.492.
Norma Organización Internacional de Normalización [ISO/IEC 17025]. 2017
(España).
Resolución 957 de 2024 [Senasa]. Por la cual se aprueba el uso de los inmunógenos RB51 y Delta PGM. 15 de agosto de 2024.
Resolución 276 de 2023 [Senasa]. Por la cual se adopta el sistema de diagnóstico serológico para el Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis
Bovina en la República Argentina. 14 de abril de 2023.
Resolución 77 de 2021 [Senasa]. Por la cual se sustituye el articulo 9° y 10 de
la Resolución N.° 67/19 y otras modificaciones. 19 de febrero de 2021.
Resolución 67 de 2019 [Senasa]. Por la cual se aprueba el Plan Nacional De
Control y Erradicación De Brucelosis Bovina en la República Argentina, de
aplicación obligatoria en todo el territorio nacional, excepto en la provincia de
Tierra Del Fuego, Antártida e islas del Atlántico Sur. 1.° de febrero de 2019.
Resolución 857-E de 2017 [Senasa]. Por la cual se declara como zona libre de
brucelosis ovina y caprina a Brucella melitensis, a la región patagónica y se
establece el Programa De Vigilancia y Prevención. 27 de diciembre de 2017.
Resolución 372-E de 2017 [Senasa]. Por la cual se aprueba el Plan Nacional de
Control de Brucelosis Caprina en la República Argentina y se establecen las
estrategias sanitarias básicas que deben ser aplicadas en cada zona o provincia. 14 de junio de 2017.
Resolución 98 de 2016 [Senasa]. Por la cual se resuelve la comercialización de
antígenos/kits para diagnóstico de brucelosis.18 de marzo de 2016.
Resolución 63 de 2013 [Senasa]. Por la cual se crea el Registro Nacional de
Establecimientos Oficialmente Libres de Brucelosis Porcina. 28 de febrero de
2013.
Resolución 246 de 2007 [Senasa]. Por la cual se aprueban los requisitos de bioseguridad para los laboratorios que se dediquen a la elaboración de productos
destinados al diagnóstico y a la prevención de la Brucelosis Animal y la Tuberculosis Animal. 04 de mayo de 2007.
Resolución 438 de 2006 [Senasa]. Por la cual de adopta el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis. 4
de agosto de 2006.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
69
�Resolución 736 de 2006 [Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos]. Por la cual se crea la Red Nacional de Laboratorios de Ensayo y Diagnóstico. 17 de noviembre de 2006.
Resolución 79 de 2003 [Senasa]. Por la cual se aprueba el procedimiento para
la supervisión de la aplicación de los tratamientos de fumigación oficial. 26 de
enero de 2003.
Resolución 1484 de 1993 [Senasa]. Por la cual se establecen las normas para
la elaboración, fraccionamiento, distribución, expendedor para los reactivos
destinados en el diagnóstico y prevención de la Brucelosis Animal. 28 de diciembre de 1993.
Bibliografía consultada
Alton, G.G., Jones, L.M., Angus, R.D. and Verger, J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis Laboratory. INRA, Paris.
Angus, R.D. & Barton, C.E. (1984). The production and evaluation of a buffered plate antigen for use in a
presumptive test for brucellosis. Dev. Biol. Stand. (56,349-356).
Centro Panamericano de Zoonosis (1968). Técnicas e interpretación de sero-aglutinación para el
diagnóstico de la brucelosis bovina. Nota Técnica Nº2. Ramos Mejía.
Ciocchini A.E., Rey Serantes D. A., Melli L.J., Iwashkiw J.A., Elena S., Franco C.,
Nicola A.M., Feldman M.F., Comerci D.J., Ugalde J.E. (2014) A bacterial engineered glycoprotein as a novel antigenic target for diagnosis of bovine brucellosis. Vet Microbiol. 172 (3-4):455-65.
Cortina M.E., Balzano R.E., Rey Serantes D.A., Caillava A.J., Elena S., Ferreira
A.C., Nicola A.M., Ugalde J.E., Comerci D.J., Ciocchini A.E (2016). A bacterial glycoengineered antigen for improved serodiagnosis of porcine brucellosis. Journal of Clinical Microbiology.
54(6), 1448-1455.
Gall D., Nielsen K., Forbes L., Cook W., Leclair D., Balsevicius S., Kelly L.,Smith
P. & Mallory M. (2001). Evaluation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological
assays for detection of brucellosis in cervids. J. Wildl. Dis., 37,110-118.
Gall D.,Nielsen K.,Forbes L.,Davis D.,Elzer P.,Olsen S.,Balsevicius S.,Kelly L.,
Smith P., Tan S. & Joly D. (2000). Validation of the fluorescence polarization assay and comparison to other
serological tests for detection of serum antibody to Brucella abortus in bison. J. Wildl. Dis., 36, 469-476.
Bagnat, Moras, Vibot, Samartino, T. De Echaide, Walsh, Diprodesa, Di Lorenzo,
Nicola (2006). Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis.
Macmillan A.P., Greiser-Wilke I., Moennig V. & Mathias L.A. (1990). A competition
enzyme immunoassay for brucellosis diagnosis. DtschTierarztl. Wochenschr. (97, 83-85).
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
70
�Lucero, N., Escobar, G., Ayala, S., Hasan, D. (2008). Manual de Procedimientos Técnicas para el
Diagnóstico de Brucelosis Humana. Servicio de Brucelosis Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”, Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur, Buenos Aires.
Nielsen K. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Vet. Microbiol. (90,447-459).
Nielsen K., Gall D., Jolley M., Leishman G., Balsevicius S., Smith P., Nicoletti P.
& Thomas F. (1996). A homogenous fluorescence polarization assay for detection of antibody to Brucella abortus.
J. Immunol. Methods (195,161-168).
Nielsen K., Kelly L., Gall D., Balsevicius S., Bosse J., Nicoletti P. & Kelly W.
(1996). Comparison of enzymeimmunoassays for the diagnosis of bovine brucellosis. Prev. Vet. Med. (26,
17–32).
Nielsen K., Kelly L., Gall D., Nicoletti P. & Kelly W. (1995). Improved competitive enzyme
immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis. Vet.Immunol.Immunopathol. (46,285-291).
Organización Mundial de la Salud (2009). Manual técnico de referencia para la higiene de las manos.
Senasa (2019). Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. Martínez, Buenos Aires.
Senasa (2009). Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. Martínez, Buenos Aires.
Senasa (1998). Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. Martínez, Buenos Aires.
Silva Paulo, P.; Vigliocco, A.M., Ramondino, R., Marticorena, D., Bici, E., Briones, G., Gorchs, C., Gall, D., Nielsen, K. (2000). Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in Argentina. Clin. Diag. Lab. Immunol. (7, 828-831).
Stack J.A., Perrett L.L., Brew S.D., Macmillan A.P. (1999). C-ELISA for bovine brucellosis
suitable for testing poor quality samples. Vet. Record (145, 735-736).
Szyfres, B. (1983). El Diagnóstico de la brucelosis bovina en el contexto de un
programa de lucha. Boletín Técnico Nº2. IICA/SENASA.
Vanzini, V., Aguirre, N., Lugaresi, C.I., de Echaide, S., de Canavesio, V.G., Guglielmone, A., Marchesino, M., Nielsen, K. (1998). Evaluation of an Indirect ELISA for the
diagnosis of bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina. Preventive Vet. Med.
(36, 211-217).
Vanzini, V., Echaide, S., (1998). Brucelosis Enzimoinmunoensayo Indirecto para detectar anticuerpos
anti-Brucella abortus en bovinos. Versión traducida y actualizada con datos obtenidos en la
EEA Rafaela.
World Health Organization (2005). Laboratory Biosafety Manual. Second Edition. Geneva.
World Health Organization (1986). Joint Food And Agriculture Organization Of The United Nations/World
Health Organization Expert Committee On Brucellosis. Technical Report Series 740, Sixth Report.
Geneva.
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
71
�World Organisation for Animal Health (2022). Manual of standards for diagnostic test & vaccines.
Brucellosis (infection with Brucella abortus, B. melitensis and B. suis).
Wright P.F., Nilsson E., Van Rooij E.M.A., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1993). Standardisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease
diagnosis. Rev.sci.tech., (12, 435-450).
Wright P.F., Tounkara K., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1997). International reference Standards:
antibody standards for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci. Tech. (3, 824-832).
MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS
72
��
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Publicaciones SENASA
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Manual de procedimiento. Diagnóstico serológico de brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis)
Publisher
An entity responsible for making the resource available
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Date
A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource
2025
Contributor
An entity responsible for making contributions to the resource
Coordinación de Bacteriología
Dirección de Laboratorio Animal
Dirección General de Laboratorios y Control Técnico
Coordinación General de Comunicación Institucional
Language
A language of the resource
Es
Type
The nature or genre of the resource
Manual
Identifier
An unambiguous reference to the resource within a given context
B.S.0177
Abstract
A summary of the resource.
El presente manual está dirigido a profesionales que se desempeñan en la Red de Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab) respecto a las técnicas relacionadas con el diagnóstico serológico de brucelosis. Técnicas reconocidas y recomendadas por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) y el Senasa. Incluye nociones sobre medidas de bioseguridad y controles de calidad a aplicarse en los procedimientos técnicos de laboratorio.
Table Of Contents
A list of subunits of the resource.
Introducción
Objetivos
Abreviaturas y definiciones
Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio
Principios de bioseguridad
Prácticas operativas seguras y hábitos personales
Limpieza y desinfección del laboratorio
Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos)
Aseguramiento de la calidad en el laboratorio
Control de calidad de insumos
Equipos
Sobre la enfermedad
Descripción de la enfermedad
Infección por Brucella en ganado bovino
Infección por Brucella en ovejas y cabras
Infección por Brucella en cerdos
Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio o en libertad
Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad
Técnicas de diagnóstico
Pruebas serológicas
Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red
Registro de entrada de muestras
Características y condiciones de las muestras
Condiciones de recepción de las muestras
Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las muestras
Informes de resultados
Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) para la detección de anticuerpos contra Brucella spp
Desarrollo
Ejecución del ensayo de BPAT
Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala
Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa
Informes de resultados
Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME)
Desarrollo
Ejecución del ensayo
Incubación
Lectura e interpretación de resultados
Informes de resultados
Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME
Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos
Desarrollo
Toma de la muestra
Ejecución del ensayo
Lectura
Modificación de la prueba para tanques muy grandes
Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche)
Etapas
Desarrollo
ELISA por competición / bloqueo
Desarrollo
Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos
contra brucella en suero
Desarrollo
Ejecución del ensayo
Lectura e interpretación
Fijación de complemento
Desarrollo
Manejo y conservación de las muestras
Condiciones del ensayo
Ejecución
Lectura de resultados
Anexos
Bibliografía
Brucelosis
Laboratorios
-
https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/7e33afd4dc0b6553d1590d4dd6e76f30.pdf
adef44b7e31f136ce84ed8142f62ca40
PDF Text
Text
República Argentina - Poder Ejecutivo Nacional
AÑO DE LA RECONSTRUCCIÓN DE LA NACIÓN ARGENTINA
Resolución
Número: RESOL-2025-214-APN-PRES#SENASA
CIUDAD DE BUENOS AIRES
Martes 1 de Abril de 2025
Referencia: EX-2025-33846938- -APN-DGTYA#SENASA - APRUEBA MANUAL TÉCNICO
VISTO el Expediente N° EX-2025-33846938- -APN-DGTYA#SENASA; la Ley de Fiscalización de Fertilizantes
y Enmiendas N° 20.466 y la Ley N° 27.233; el Decreto Reglamentario N° DECTO-2025-101-APN-PTE del 14
de febrero de 2025; los Decretos Nros. 434 del 1 de marzo de 2016, DECTO-2016-1063-APN-PTE del 4 de
octubre de 2016 y DECTO-2017-891-APN-PTE del 1 de noviembre de 2017; la Resolución Conjunta N° RESFC2019-1-APN-SECCYMA#SGP del 7 de enero de 2019 de la ex-SECRETARÍA DE CONTROL Y MONITOREO
AMBIENTAL de la entonces SECRETARÍA DE GOBIERNO DE AMBIENTE Y DESARROLLO
SUSTENTABLE y del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA; las
Resoluciones Nros. RESOL-2019-19-APN-SGAYDS#SGP del 22 de enero de 2019 de la referida ex-Secretaría
de Gobierno, 816 del 4 de octubre de 2002, RESOL-2019-75-APN-PRES#SENASA del 29 de enero de 2019,
RESOL-2022-802-APN-PRES#SENASA del 9 de diciembre de 2022, RESOL-2023-1004-APN-PRES#SENASA
del 12 de octubre de 2023, RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA del 24 de abril de 2024 y RESOL-2024657-APN-PRES#SENASA del 19 de junio de 2024, todas del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y
CALIDAD AGROALIMENTARIA, y
CONSIDERANDO:
Que la Ley de Fiscalización de Fertilizantes y Enmiendas N° 20.466 establece el régimen jurídico aplicable al
control de la elaboración, importación, exportación, tenencia, fraccionamiento, distribución y venta de
fertilizantes y enmiendas en el Territorio Nacional, con el propósito de garantizar la calidad y la seguridad de
estos insumos.
Que el Decreto Reglamentario N° DECTO-2025-101-APN-PTE del 14 de febrero de 2025 reglamenta la citada
ley y actualiza el marco normativo vigente, adecuándolo a las necesidades actuales del sector y a los principios de
modernización de la Administración Pública Nacional.
Que, el mencionado decreto designa a la SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA del
MINISTERIO DE ECONOMÍA como Autoridad de Aplicación de la referida Ley N° 20.466, y establece que las
�funciones operativas y de implementación de los registros y controles previstos en la norma serán ejercidas por el
SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA (SENASA).
Que, por su parte, el Artículo 6° del mentado Decreto N° 101/25 establece un régimen diferencial para la
importación de fertilizantes y enmiendas, en función de las certificaciones emitidas por autoridades competentes
de determinados países, a fin de agilizar el comercio exterior sin desatender los resguardos sanitarios y
productivos.
Que el Artículo 8° del mismo texto normativo dispone que la inscripción de productos y personas humanas o
jurídicas en el registro respectivo estará exenta de aranceles y tendrá vigencia plena sin límite de tiempo, y
determina también causales de cancelación del registro ante modificaciones en la composición del producto.
Que, asimismo, el Artículo 9° del referido decreto establece obligaciones específicas en materia de
comercialización y transporte de fertilizantes que contengan nitrato de amonio a granel, con el objetivo de
fortalecer la trazabilidad y garantizar el resguardo de la seguridad pública y ambiental.
Que mediante el Artículo 10 del aludido decreto se otorga a la SECRETARÍA DE AGRICULTURA,
GANADERÍA Y PESCA, por intermedio de su servicio especializado, facultades expresas para limitar, prohibir o
excluir del registro productos que considere inapropiados para determinadas regiones o cultivos, en resguardo de
la producción agropecuaria y del medio ambiente.
Que la Ley N° 27.233 declara de interés nacional la sanidad de los animales y los vegetales, así como la
prevención, el control y la erradicación de las enfermedades y de las plagas que afecten la producción
silvoagropecuaria nacional, la flora y la fauna, la calidad de las materias primas producto de las actividades silvoagrícolas, ganaderas y de la pesca, así como también la producción, inocuidad y calidad de los agroalimentos, los
insumos agropecuarios específicos y el control de los residuos químicos y contaminantes químicos y
microbiológicos en los alimentos y el comercio nacional e internacional de dichos productos y subproductos,
siendo el SENASA la autoridad de aplicación y el encargado de planificar, ejecutar y controlar el desarrollo de las
acciones previstas en la mencionada ley.
Que, asimismo, establece la responsabilidad primaria e ineludible de toda persona física o jurídica vinculada a la
producción, obtención o industrialización de productos, subproductos y derivados de origen silvo-agropecuario,
cuya actividad se encuentre sujeta al contralor del SENASA, el velar y responder por la sanidad, inocuidad,
higiene y calidad de su producción, de conformidad con la normativa vigente y la que en el futuro se establezca.
Que por el Decreto N° 434 del 1 de marzo de 2016 se aprueba el Plan de Modernización del Estado, orientado a
la transformación de la Administración Pública mediante la simplificación de trámites, la reducción de plazos y
costos administrativos y la incorporación de tecnologías de gestión.
Que a través del Decreto N° DECTO-2016-1063-APN-PTE del 4 de octubre de 2016 se aprueba el Sistema de
Gestión Documental Electrónica (GDE) y se regula la Plataforma de Trámites a Distancia (TAD), estableciendo
su carácter obligatorio para los trámites ante la Administración Pública Nacional.
Que el Decreto N° DECTO-2017-891-APN-PTE del 1 de noviembre de 2017 establece las Buenas Prácticas en
Materia de Simplificación, imponiendo a los organismos nacionales la obligación de sustentar los procedimientos
administrativos en los principios de celeridad, eficacia, digitalización e interoperabilidad.
Que mediante la Resolución N° RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA del 24 de abril de 2024 y su
�modificatoria, Resolución N° RESOL-2024-657-APN-PRES#SENASA del 19 de junio de 2024, ambas del
SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA (SENASA) se aprueba el
procedimiento para el registro de productos en el Registro Nacional de Fertilizantes, Enmiendas,
Acondicionadores, Sustratos, Protectores y Materias Primas, instituido por la Ley N° 20.466.
Que, por su parte, la Resolución N° RESOL-2023-1004-APN-PRES#SENASA del 12 de octubre de 2023 del
mencionado Servicio Nacional aprueba el procedimiento para el registro de bioinsumos en los Registros
Nacionales de Terapéutica Vegetal, creado por el Decreto N° 5.769 del 12 de mayo de 1959, y de Fertilizantes,
Enmiendas, Sustratos, Acondicionadores, Protectores y Materias Primas, instituido por la citada Ley N° 20.466,
para quienes se encuentren interesados en elaborar, importar, exportar, tener, fraccionar, distribuir y/o vender
bioinsumos.
Que, a su vez, la Resolución N° RESOL-2019-75-APN-PRES#SENASA del 29 de enero de 2019 del mentado
Servicio Nacional establece, complementariamente, un régimen de importación y exportación de fertilizantes y
enmiendas.
Que la precitada resolución fue posteriormente prorrogada por el término de CUATRO (4) años mediante la
Resolución N° RESOL-2022-802-APN-PRES#SENASA del 9 de diciembre de 2022 del referido Servicio
Nacional.
Que, atento el nuevo marco establecido por el Decreto N° 101/2025, corresponde adoptar un nuevo ordenamiento
reglamentario que garantice la coherencia normativa, la seguridad jurídica y la efectiva implementación de los
preceptos determinados por el citado Decreto N° 101/25.
Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete.
Que el suscripto es competente para dictar el presente acto en virtud de lo dispuesto por los Artículos 4° y 8°,
inciso f), del Decreto N° 1.585 del 19 de diciembre de 1996 y sus modificatorios.
Por ello,
EL PRESIDENTE DEL SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA
RESUELVE:
INSCRIPCIONES VINCULADAS AL REGISTRO NACIONAL DE FERTILIZANTE, ESTIMULANTE,
ENMIENDA, SUSTRATO, INOCULANTE, ACONDICIONADOR, PROTECTOR Y MATERIA PRIMA EN
LA REPÚBLICA ARGENTINA
ARTÍCULO 1°.- Registro de personas, establecimientos y plantas. Se aprueba el procedimiento simplificado de
inscripción por autogestión y emisión inmediata de registro para personas humanas y jurídicas que intervengan en
la elaboración, el fraccionamiento, la distribución, la importación o la exportación de productos fertilizantes,
estimulantes, enmiendas, sustratos, inoculantes, acondicionadores, protectores y materias primas, así como de las
plantas en las que se desarrollen dichas actividades, conforme a lo dispuesto en el Capítulo I del Manual Técnico
obrante como Anexo de la presente resolución.
�Inciso a) Las personas humanas y jurídicas deben completar, con carácter de Declaración Jurada, el formulario de
inscripción a través de la plataforma de Trámites a Distancia (TAD) o la que se informe o la reemplace en el
futuro.
Inciso b) La presentación de la Declaración Jurada habilitará automáticamente a las firmas registrantes a
comercializar los productos registrados, quedando estas sujetas a fiscalización posterior por parte del SERVICIO
NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA (SENASA).
Inciso c) La detección de información falsa, incompleta o adulterada será motivo suficiente para suspender o
cancelar automáticamente el registro otorgado, independientemente del resto de las medidas y sanciones
administrativas que correspondan. Sin perjuicio de lo dispuesto precedentemente, el SENASA podrá formular los
pedidos de subsanación que estime corresponder.
ARTÍCULO 2°.- Registro de productos. Se aprueban las modalidades y los procedimientos de inscripción para el
registro de productos fertilizantes, estimulantes, enmiendas, sustratos, inoculantes, acondicionadores, protectores
o materias primas, incluidos los bioinsumos, conforme a lo dispuesto en el Capítulo I del citado Manual Técnico.
Inciso a) Las personas humanas y jurídicas deben completar, con carácter de Declaración Jurada, el formulario de
solicitud de inscripción del producto a través de la plataforma de Trámites a Distancia (TAD) o la que se informe
o la reemplace en el futuro.
Inciso b) El SENASA verificará la documentación presentada en un plazo no superior a DIEZ (10) días hábiles.
En caso de no expedirse en dicho plazo, se considerará aprobado el registro del producto. Una vez obtenido el
registro, el producto quedará en condiciones de ser comercializado.
Los productos inscriptos contarán con su correspondiente “Certificado de registro de producto” y quedarán
sujetos a fiscalización y control posterior por parte del SENASA.
Inciso c) La detección de información falsa, incompleta o adulterada en la Declaración Jurada presentada, o
cualquier modificación o alteración del producto comercializado y de su correcta identificación, será motivo
suficiente para suspender o cancelar automáticamente el registro otorgado, independientemente de la aplicación
del resto de las medidas y sanciones administrativas que correspondan. Sin perjuicio de lo dispuesto
precedentemente, el SENASA podrá formular los pedidos de subsanación que estime corresponder.
ARTÍCULO 3°.- Requisitos de importación y exportación. A los fines de la importación y exportación de
productos, se establece que:
Inciso a) Los productos que cuenten con certificaciones de inscripción o registro emitidas por las autoridades
competentes de los países contemplados en el Anexo I del Decreto N° DECTO-2025-101-APN-PTE del 14 de
febrero de 2025, podrán ingresar mediante el procedimiento simplificado de autogestión y emisión inmediata de
la constancia de registro y Aviso de Importación, conforme a lo dispuesto en el Capítulo II del Manual Técnico
obrante como Anexo de la presente resolución.
Inciso b) Para el resto de los productos importados no alcanzados por el Anexo I del precitado decreto y para el
caso de productos con carácter biológico sin antecedentes de registro en el país, la Autorización de Importación se
debe gestionar conforme a lo establecido en el Capítulo II del referido Manual Técnico.
Estas gestiones se tramitarán mediante Declaración Jurada a través de la plataforma de Trámites a Distancia
�(TAD), o la que la se informe o la reemplace en el futuro.
El SENASA resolverá la solicitud de “Certificado de Autorización de Importación” en un plazo máximo de
CINCO (5) días hábiles.
Inciso c) En caso de exportación, los productos deberán cumplir únicamente con los requisitos exigidos por el
país de destino, si es que lo requiere.
La detección de información falsa, incompleta o adulterada será motivo suficiente para suspender o cancelar
automáticamente el registro otorgado, independientemente del resto de las medidas y sanciones administrativas
que corresponda aplicar a la firma, al representante legal y al asesor técnico.
ARTÍCULO 4°.- Régimen de Ventanilla Única de Comercio Exterior. El SENASA arbitrará los medios para
acordar con la DIRECCIÓN GENERAL DE ADUANAS de la AGENCIA DE RECAUDACIÓN Y CONTROL
ADUANERO (ARCA), dependiente del MINISTERIO DE ECONOMÍA, que mediante el Régimen de Ventanilla
Única de Comercio Exterior Argentino (VUCEA) se remitan los “Avisos de Importación” y “Autorización de
Importación” mencionados en el marco del “Servicio de Recepción de LPCO” para la admisión de Licencias,
Permisos, Certificados y Otros documentos, a fin de que su validación sea automática en el SISTEMA
INFORMÁTICO MALVINA (S.I.M.), la que deberá ser declarada al momento de la oficialización de las
solicitudes de importación.
Inciso a) En el caso de exportaciones, bastará con la presentación del “Certificado de registro de producto”
emitido por el SENASA, como documento válido para efectuar la exportación, o una “Nota de autorización
especial de exportación” de dicho Organismo para el caso de muestras, conforme al procedimiento dispuesto en el
Capítulo II del Manual Técnico obrante como Anexo de la presente resolución.
ENVÍOS A GRANEL DE FERTILIZANTES QUE CONTENGAN NITRATO DE AMONIO
ARTÍCULO 5°.- Nitrato de amonio. La comercialización de envíos a granel de más de CINCUENTA
TONELADAS (50 t) de fertilizantes que contengan nitrato de amonio debe ser comunicada al SENASA con
antelación a su despacho, mediante la plataforma de Trámites a Distancia (TAD), o la que se informe o la
reemplace en el futuro, declarando:
Inciso a) Datos del declarante.
Inciso b) Datos de la firma comercializadora de la partida.
Inciso c) Identificación del producto.
Inciso d) Composición del producto.
Inciso e) Lugar de origen del despacho de la mercadería.
Inciso f) Lugar de arribo final de la mercadería despachada.
Inciso g) Circuito a recorrer.
Inciso h) Volumen a trasladar en toneladas (t).
�Inciso i) Fecha de envío.
ARTÍCULO 6°.- Gastos de muestreo. El SENASA podrá efectuar la extracción de muestras de productos en el
marco de las actividades de fiscalización y control del registro de productos fertilizantes, estimulantes,
enmiendas, sustratos, inoculantes, acondicionadores, protectores y materias primas para su fiscalización. Los
costos que demande el envío de muestras y las determinaciones o ensayos de laboratorio estarán a cargo de la
firma titular del registro.
DISPOSICIONES FINALES
ARTÍCULO 7°.- Manual Técnico. Anexo. Aprobación. Se aprueba el Manual Técnico que, como Anexo (IF2025-34012252-APN-PRES#SENASA), forma parte integrante de la presente resolución.
ARTÍCULO 8°.- Resolución N° RESOL-2019-75-APN-PRES#SENASA del 29 de enero de 2019 del SERVICIO
NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. Sustitución. Se sustituye el Artículo 1° de la
Resolución N° RESOL-2019-75-APN-PRES#SENASA del 29 de enero de 2019 del SERVICIO NACIONAL DE
SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, el que quedará redactado de la siguiente manera:
“ARTÍCULO 1°.- Solicitud de Autorización de Exportación y/o Importación. Trámite a través de la Ventanilla
Única de Comercio Exterior (VUCE ARGENTINA) o de la plataforma de Trámites a Distancia (TAD). A fin de
solicitar el Certificado de Autorización de Exportación y/o el Certificado de Autorización de Importación, el
exportador y/o importador de principios activos, productos agroquímicos y biológicos utilizados en la producción
y comercialización de productos fitosanitarios, debe ingresar a la Ventanilla Única de Comercio Exterior (VUCE
ARGENTINA), a la plataforma de Trámites a Distancia (TAD) o a cualquier otra que en el futuro las reemplace,
y completar los campos de las solicitudes que se aprueban en los Artículos 3° y 5° de la presente resolución,
según corresponda.”.
ARTÍCULO 9°.- Resolución N° RESOL-2023-1004-APN-PRES#SENASA del 12 de octubre de 2023 del
SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. Sustitución. Se sustituye el
Artículo 1° de la Resolución N° 1004 del 12 de octubre de 2023 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y
CALIDAD AGROALIMENTARIA, el que quedará redactado de la siguiente forma:
“ARTÍCULO 1°.- Procedimiento de registro de bioinsumos. Se aprueba el procedimiento para el registro de
bioinsumos en el Registro Nacional de Terapéutica Vegetal, creado por el Decreto N° 5.769 del 12 de mayo de
1959, para quienes se encuentren interesados en elaborar, importar, exportar, tener, fraccionar, distribuir y/o
vender bioinsumos para tratamiento fitosanitario, conforme lo establecido en la presente resolución.”.
ARTÍCULO 10.- Resolución N° 1004/23. Sustitución. Se sustituye el Artículo 2° de la citada Resolución N°
1004/23, el que quedará redactado de la siguiente forma:
“ARTÍCULO 2°.- Alcance. Se encuentran sujetas a registro las siguientes categorías de bioinsumos destinados a
la protección vegetal:
Inciso a) invertebrados como agentes de control biológico,
Inciso b) semioquímicos de origen biológico,
Inciso c) a base de extractos de origen vegetal, animal o microbiológico,
�Inciso d) agentes de control microbiano.”.
ARTÍCULO 11.- Resolución N° 1004/23. Sustitución. Se sustituye el Artículo 3° de la mencionada Resolución
N° 1004/23, el que quedará redactado de la siguiente forma:
“ARTÍCULO 3°.- Definiciones. A los efectos de la interpretación y aplicación de la presente resolución, se
establecen las siguientes definiciones:
Inciso a) Agente de control biológico microbiano: agente microbiano de ocurrencia natural, o introducido en el
ambiente, para la prevención y/o el control de poblaciones o actividades biológicas de organismos considerados
plaga de la agricultura.
Inciso b) Bioinsumo: producto que consista o haya sido producido por microorganismos o macroorganismos de
origen animal o vegetal, extractos o compuestos bioactivos obtenidos a partir de ellos, y que estén destinados a
ser aplicados como insumos en la producción agrícola con fines nutricionales, estimulación vegetal, enmiendas,
sustratos, protectores biológicos o para la protección del cultivo. Entiéndase por tales a aquellos productos que
durante su formulación solo hayan sufrido procesos físicos de deshidratación, molienda, congelación, mezcla,
separación, concentración o procesos químicos de extracción en agua o en soluciones ácidas y/o alcalinas.
Cuando los bioinsumos sean obtenidos por extracción con ácidos y bases fuertes, se evaluará la posible inclusión
en esta categoría.
Inciso c) Fitorregulador biológico: producto fitosanitario de origen biológico que tiene acción sobre los órganos
vegetativos o de reproducción de las plantas, provocando efectos tales como la inhibición, el retardo o la
aceleración del crecimiento, la maduración, la inducción, el raleo, la fijación y el cambio de los caracteres
organolépticos de frutas y hortalizas.
Inciso d) Invertebrados como agentes de control biológico: se consideran agentes de control biológico a los
invertebrados introducidos en el ambiente para controlar una población o actividades biológicas de poblaciones
de organismos plaga de la agricultura.
Inciso e) Organismo Genéticamente Modificado (OGM): cualquier entidad biológica capaz de transferir o replicar
material genético que posea una combinación nueva de material genético que se haya obtenido mediante la
aplicación de la biotecnología moderna.
Inciso f) Plaga: cualquier especie, raza o biotipo vegetal o animal, agente patógeno dañino para las plantas o
productos vegetales (FAO 1990; revisado FAO, 1995; CIPF, 1997).
Inciso g) Semioquímicos de origen biológico: se entiende por productos semioquímicos a aquellos constituidos
por sustancias bioquímicas obtenidas sin que se involucre reacción química alguna, que provocan respuestas
conductuales o fisiológicas en los organismos receptores y que se utilizan con fines de monitoreo, modificación
etológica y control de una población de artrópodos plaga, pudiendo clasificarse, según el tipo de acción que
provocan, como feromonas (comunicación intraespecífica) y aleloquímicos (comunicación interespecífica).”.
ARTÍCULO 12.- Resolución N° 1004/23. Sustitución. Se sustituye el Artículo 6° de la mentada Resolución N°
1004/23, el que quedará redactado de la siguiente forma:
“ARTÍCULO 6°.- Bioinsumos con más de UNA (1) aptitud. Los bioinsumos con más de UNA (1) aptitud deben
cumplir los requisitos establecidos para cada una de las aptitudes en que se inscriban.”.
�ARTÍCULO 13.- Derogaciones. Se derogan los Artículos 5° y 10 de la Resolución N° RESOL-2023-1004-APNPRES#SENASA del 12 de octubre de 2023 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD
AGROALIMENTARIA.
ARTÍCULO 14.- Abrogaciones. Se abrogan las Resoluciones Nros. RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA del
24 de abril de 2024 y RESOL-2024-657-APN-PRES#SENASA del 19 de junio de 2024, ambas del SERVICIO
NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA.
ARTÍCULO 15.- Incumplimiento. Sanciones. El incumplimiento o la transgresión a la presente norma serán
pasibles de las sanciones establecidas en el Capítulo V de la ley N° 27.233 y su Decreto Reglamentario N°
DECTO-2019-776-APN-PTE del 19 de noviembre de 2019, sin perjuicio de las acciones preventivas que
pudieran adoptarse en virtud de lo dispuesto en la Resolución N° 38 del 3 de febrero de 2012 del entonces
MINISTERIO DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA y su modificatoria, o la que en el futuro la
reemplace.
ARTÍCULO 16.- Vigencia. La presente resolución entra en vigencia a los SESENTA (60) días corridos
posteriores a su publicación en el Boletín Oficial.
ARTÍCULO 17.- Comuníquese, publíquese, dese a la DIRECCIÓN NACIONAL DEL REGISTRO OFICIAL y
archívese.
Digitally signed by CORTESE Pablo Luis
Date: 2025.04.01 18:58:42 ART
Location: Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Pablo Cortese
Presidente
Presidencia
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Digitally signed by GESTION DOCUMENTAL
ELECTRONICA - GDE
Date: 2025.04.01 18:58:53 -03:00
�
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resoluciones SENASA
Dublin Core
The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/.
Title
A name given to the resource
Resolución SENASA N° 0214/2025
Description
An account of the resource
Introduce modificaciones a las reglamentaciones referidas a la fiscalización de Fertilizantes y Enmiendas
Creator
An entity primarily responsible for making the resource
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
Source
A related resource from which the described resource is derived
<a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=411236">Resolución SENASA N° 0214/2025</a>
Date
A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource
Martes 1 de Abril de 2025
Language
A language of the resource
Es
Type
The nature or genre of the resource
Resolución
Abstract
A summary of the resource.
Se aprueba el procedimiento simplificado de inscripción por autogestión y emisión inmediata de registro para personas humanas y jurídicas que intervengan en la elaboración, el fraccionamiento, la distribución, la importación o la exportación de productos fertilizantes, estimulantes, enmiendas, sustratos, inoculantes, acondicionadores, protectores y materias primas
Has Part
A related resource that is included either physically or logically in the described resource.
Incluye Anexos