228 10 5365 https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/d41167b38d02312b0e6886413931cb34.pdf 1f32cb34666baf07ebe08f70125d5f4d PDF Text Text DISPOSICIÓN N° 292/2003 Dirección de Agroquímicos, Productos Farmacológicos y Veterinarios Establecer requisitos y especificaciones en relación con el Sistema de Identificación de Ganado Bovino para Exportación. BUENOS AIRES, 18 de marzo de 2003 VISTO el expediente N° 3443/2003, las Resoluciones Nros. 496 de fecha 6 de noviembre de 2001, 2 de fecha 2 de enero de 2002, 15 de fecha 5 de febrero de 2003, todos del Registro del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, y CONSIDERANDO: Que mediante la Resolución N° 15/2003 se establece el Sistema de Identificación de Ganado Bovino para Exportación. Que se hace necesario establecer los requisitos y especificaciones mínimas para asegurar el sistema y, facilitar su funcionamiento. Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete, no encontrando reparos de orden legal que formular. Que el suscripto se encuentra facultado para el dictado del presente acto, conforme lo establecido por el Anexo II del Decreto N° 1585 del 19 de diciembre de 1996, y la Resolución N° 2162 del 29 de noviembre de 2000 del registro del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. Por ello, EL DIRECTOR DE AGROQUIMICOS PRODUCTOS FARMACOLOGICOS Y VETERINARIOS DISPONE: ARTÍCULO 1° — DE LAS CARACTERISTICAS, QUE DEBEN REUNIR LAS CARAVANAS: Las caravanas y botones a ser utilizadas en el Sistema de ldentificación de Ganado Bovino para Exportación deberán ajustarse a las características que se definen en el Anexo I que forma parte integrante de la presente Disposición. ARTÍCULO 2° — DE LA ASIGNACION DE LOS NUMEROS DE IDENTIFICACION: A efectos de lo dispuesto en el artículo 3° de la Resolución N° 15/2003 las personas físicas, jurídicas o sociedades de hecho interesadas, deberán inscribirse en el Registro de Fabricantes, Importadores e Impresores de Dispositivos de Identificación Animal. La Solicitud de Inscripción para este registro y el procedimiento para la obtención de rangos de numeración se regirá por lo dispuesto en los Anexos II y III que forman parte integrante de la presente disposición. La inscripción en el registro por parte de los interesados supone la aceptación plena de los requerimientos dispuestos en la presente Disposición, y la obligación de proveer caravanas ajustados a las características requeridas. La detección de la violación a estos compromisos determinará la anulación automática de la inscripción efectuada, independientemente de las sanciones administrativas que pudieran corresponder. ARTÍCULO 3° — Los Fabricantes, Importadores e Impresores de Dispositivos para la Identificación Animal, así como todas aquellas personas físicas, jurídicas o sociedades de hecho que intervengan en la comercialización de las caravanas, deberán llevar un registro donde asentarán en forma cronológica, los siguientes datos: a - Razón social o Nombre y Apellido del Comprador, b - cantidad total de caravanas caravanas entregadas; c - rango de numeración de las caravanas entregadas; d - número de REGISTRO NACIONAL SANITARIO DE PRODUCTORES AGROPECUARIOS (RENSPA) del adquirente. �ARTÍCULO 4° — DECLARACION DE SISTEMAS PREEXISTENTES: Atento a la existencia y uso de sistemas de identificación por parte de productores individuales, agrupamiento de productores o empresas de servicios, y con la finalidad de preservar las inversiones realizadas por los mismos, se habilita un plazo perentorio de cuarenta y cinco (45) días contados a partir de la vigencia de la presente Disposición para que los mismos sean declarados por sus propietarios. Esta declaración deberá realizarse ante la Dirección de Agroquímicos, Productos Farmacológicos y Veterinarios de este Servicio Nacional, de acuerdo al formulario que como Anexo IV forma parte integrante de la presente Disposición. Previa evaluación de la información que se reciba, se podrá otorgar una habilitación provisoria para la continuidad del sistema y se fijará un plazo límite para su adecuación. ARTÍCULO 5° — La presente Disposición entrará en vigencia a partir del día siguiente a su publicación en el Boletín Oficial. ARTÍCULO 6° — Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y archívese. — Eduardo A. Butler. ANEXO I CARACTERISTICAS IDENTIFICACION MINIMAS QUE DEBEN REUNIR LOS DISPOSITIVOS DE A. DE LAS CARAVANAS: Tipo de Sistema: Las caravanas a ser utilizadas para la identificación del ganado bovino deberán ser del tipo "tarjeta" y con dispositivo de fijación de tipo "inviolable", es decir no removible sin causar alteraciones visibles en la caravana que imposibiliten su reutilización. No serán aceptadas puntas abiertas, tipo "sacabocado", con salida o no del extremo del perno del aplicador. Materiales: se deberán utilizar materiales que garanticen la inalterabilidad de la caravana bajo las más severas condiciones climáticas, incluyendo las condiciones de visibilidad del número de identificación y del RENSPA, ya que las mismas deberán identificar al animal hasta su faena. Formato: el formato de la caravana es libre, debiendo el fabricante cuidar de que el mismo permita la impresión de la información requerida en posición horizontal, presente una superficie lisa y no presente ángulos pronunciados que pueda incidir sobre el índice de pérdidas de la misma. Colores: La elección del color de la caravana como de los números de identificación será libre, debiendo asegurar el responsable un adecuado contraste entre los mismos que permita cumplir con los requerimientos de visibilidad que establece el presente Anexo. Información impresa. Frente: Al frente de la caravana deberá figurar el número de identificación individual de nueve dígitos impreso en forma horizontal y descompuesto en dos bloques de las siguientes dimensiones: a. Primer bloque: primeros cuatro dígitos del número de identificación: - Dimensiones mínimas: 5 mm de alto; 4 mm de ancho, trazo de 0,8 mm; legible a simple vista a distancia de 1 metro. b. Segundo bloque: últimos cinco dígitos del número de identificación: - Dimensiones mínimas: 15 mm de alto; 7 mm de ancho, trazo de 1.5 mm; separación entre dígitos 2 mm.; legible a simple vista a distancia de 8 metros. Entre los dos bloques de numeración no se podrá insertar leyenda o figura alguna, debiendo existir entre ambos bloques una separación mínima de 3 mm. �Dejando una distancia mínima de 4 mm desde el borde de la numeración obligatoria, se podrá agregar en la caravana la información que el fabricante o el productor pretenda incorporar. Se recomienda dejar además una superficie mínima libre de 1,0 por 1,5 centímetros para incorporar eventuales marcas o perforaciones sobre la caravana para futuros controles por parte del SENASA. Dorso: Se deberá grabar el número de RENSPA del productor que registra el animal bajo el formato: 99.999.999999.99, con un tamaño mínimo de cada dígito de 4 mm, pudiendo ser impreso en dos líneas. Cuidados especiales: La caravana aplicada no deberá generar traumatismos locales, compresiones ni reacciones inflamatorias posteriores a su colocación. B. DE LOS BOTONES DE IDENTIFICACION - SIGLA "E.C.": Materiales: se deberán utilizar materiales que garanticen la inalterabilidad del botón bajo las más severas condiciones climáticas hasta la faena del animal, incluyendo el mantenimiento de las condiciones de visibilidad de las letras "E.C." Colores: La elección del color del botón como de las Ietras será libre, debiéndose presentar un buen contraste entre los mismos y una adecuada visibilidad a una distancia mínima de 8 metros. Información impresa: Frente: Se requiere que estén impresas las letras "E.C.", de una altura mínima de 15 mm y un trazo no inferior a los 2 mm. Dejando una distancia mínima de 2 mm desde el borde de las letras, se podrá agregar al botón la información que el fabricante o el productor pretenda incorporar. Cuidados especiales: El botón a aplicar no deberá generar traumatismos locales, compresiones ni reacciones inflamatorias posteriores a su colocación. ANEXO II �ANEXO III �ANEXO IV �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Disposición DAPFyV N° 0292/2003 Description An account of the resource Establece requisitos y especificaciones en relación con el Sistema de Identificación de Ganado Bovino para Exportación Creator An entity primarily responsible for making the resource Dirección de Agroquímicos, Productos Farmacológicos y Veterinarios Source A related resource from which the described resource is derived <a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=83460">Disposición DAPFyV N° 0292/2003</a> Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource Martes 18 de Marzo de 2003 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Disposición Abstract A summary of the resource. Se establecen los requisitos y especificaciones mínimas para asegurar el Sistema de Identificación de Ganado Bovino para Exportación establecido por la Resolución Senasa N° 15/2003 y, facilitar su funcionamiento. Establece las características que deben reunir las caravanas y la asignación de los números de identificación. Is Replaced By A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource. <strong>Abrogada por el artículo 20 de la Resolución SENASA N° 201/2019</strong> https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/51bb3c0dd6480093bd19f31a7d02f9bc.pdf 54152217859f89d99a8a31106551208c PDF Text Text DISPOSICIÓN Nº 955/2004 Dirección de Agroquímicos, Productos Farmacológicos y Veterinarios Modifícase el Anexo I de la Disposición Nº 292/2003, referida a las características que deben reunir las caravanas que se utilicen para la identificación de bovinos destinados a faena para exportación. BUENOS AIRES., 22 de junio de 2004 VISTO el expediente Nº 3343/2003 la Resolución Nº 465 del 18 de octubre de 2001, ambos del registro del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, y la Disposición Nº 292 del 18 de marzo de 2003 de la Dirección de Agroquímicos, Productos Farmacológicos y Veterinarios del citado Servicio Nacional, y CONSIDERANDO: Que en la mencionada Disposición Nº 292/2003 se establecieron las características que deben reunir las caravanas que se utilicen para la identificación de bovinos destinados a faena para exportación, entre ellas el formato al que se debe ajustar el número de Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios (RENSPA) impreso en las mismas. Que corresponde modificar tal formato a los fines de que el mismo coincida con lo que al respecto establece el artículo 6º de la Resolución Nº 465/2001. Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete, no encontrando reparos de orden legal que formular. Que el suscripto se encuentra facultado para el dictado del presente acto, conforme lo establecido por el Anexo II del Decreto Nº 1585 del 19 de diciembre de 1996, y la Resolución Nº 2162 del 29 de noviembre de 2000 del registro del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. �Por ello, EL DIRECTOR DE AGROQUIMICOS, PRODUCTOS FARMACOLOGICOS Y VETERINARIOS DISPONE ARTÍCULO 1º — Modifíquese el Anexo I de la Disposición Nº 292 del 18 de marzo de 2003 de la Dirección de Agroquímicos, Productos Farmacológicos y Veterinarios del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, en lo que se refiere al formato del número de Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios (RENSPA), que las caravanas deben llevar impreso en su dorso, quedando redactado de la siguiente forma: "Dorso: Se deberá grabar el número de RENSPA del productor que registra el animal bajo el formato, 99.999.9.99999.99, con un tamaño mínimo de cada dígito de CUATRO MILIMETROS, (4 mm), pudiendo ser impreso en dos líneas. El primer y el segundo dígito corresponden al número de provincia, el tercero es un punto, desde el cuarto hasta el sexto corresponden al código de departamento, el séptimo es un punto, el octavo corresponde a la división de jurisdicciones de una oficina local, el noveno es un punto, desde el décimo hasta el decimocuarto corresponde al número que individualiza el predio y no se repite dentro de un mismo departamento o partido, el decimoquinto es un punto, y el decimosexto y decimoséptimo identifican los distintos productores que coexisten en él". Los códigos de provincia son los establecidos en la Resolución Nº 465 del 18 de octubre de 2001 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. ARTICULO 2º — La presente Disposición entrará en vigencia a partir del día siguiente a su publicación en el Boletín Oficial. �ARTICULO 3º — Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y archívese. Eduardo A. Butler. � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Disp. Protección Vegetal Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Disposición DAPFyV N° 0955/2004 Description An account of the resource Modifica el anexo I de la disposicon Nro 292/2003 Creator An entity primarily responsible for making the resource Dirección de Agroquímicos, Productos Farmacológicos y Veterinarios Source A related resource from which the described resource is derived <a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=96305">Disposición DAPFyV N° 0955/2004</a> Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource Martes 22 de Junio de 2004 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Disposición Abstract A summary of the resource. Modifica Disposición 292/2003, en lo que se refiere al formato del número de Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios (RENSPA), que las caravanas deben llevar impreso en su dorso https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/523f970a36523db0bfadae6a59e5cf29.pdf 551fa08a85942c1f088a982d9ea051b1 PDF Text Text DISPOSICION N° 405/88 BUENOS AIRES, 27 de mayo de 1988 VISTO el expediente N° 100.439/88 por el cual el SERVICIO DE LABORATORIOS propicia la fijación de normas relacionadas con los controles de series, uso y comercialización de vacunas contra la letospirosis, producidas por la actividad privada, y CONSIDERANDO: Que la leptospirosis es una enfermedad que afecta a los animales domésticos y silvestres, siendo de difícil erradicación. Que esta enfermedad es de diagnóstico complejo debido al polimorfismo clínico de su presentación. Que los daños económicos que provoca son difíciles de cuantificar por la imprecisión de sus indicadores. Que la vacunación es el medio válido de controlar esta zoonosis. Que el SERVICIO DE LABORATORIOS por su función fiscalizadora y de control debe garantizar mediante pruebas estandarizadas, la calidad del inmunógeno. Que el SERVICIO DE LABORATORIOS está en condiciones de efectuar íntegramente los controles de series de vacunas a distintos serovares de Leptospira interrogans producidas por la industria privada. Que el Anexo II del Decreto N° 182 del 11 de enero de 1973 acuerda facultades a este SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL para resolver sobre el particular. Por ello EL DIRECTOR GENERAL DEL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL DISPONE: ARTICULO 1°.- A partir de la fecha de publicación de la presente Disposición en el Boletín Oficial, todas las vacunas destinadas a prevenir la leptospirosis, deberán satisfacer los siguientes controles: esterilidad, inocuidad, inactivación, pH y potencia. I - CONTROL DE ESTERILIDAD a) medio de cultivo: a.1) Control de bacterias: medio semi-sólido de tioglicolato con el agregado de 0,5% de extracto de carne. La cantidad de medio de cultivo distribuida será la suficiente como para inhibir la actividad bactericida del producto. a.2) Control de hongos: medio Sabouraud o similar �b) Test: Se tomarán DIEZ (10) muestras que se sembrarán en DIEZ (10) tubos para control de bacterias y en DIEZ (10) tubos para control de hongos. El inóculo está en relación al volumen total de cada muestra. Si ésta es de DOS (2) mililitros o superior, el inóculo será de UN (1) mililitro. Si ella es inferior a DOS (2) mililitros el inóculo será de CINCO décimas (0,5) de mililitro. b.1) Incubación: Durante CATORCE (14) días; entre 30 a 35°C para control de bacterias y entre 20 a 25°C para control de hongos. b.2) Interpretación: No debe haber desarrollo a la observación directa ni a la observación microscópica. Si la siembre enturbia el medio, debe efectuarse un subcultivo entre los 7 a 11 días de incubación empleando no menos de UN (1) mililitro para 20 a 25 mililitros de medio de cultivo. Si no se observa desarrollo alguno, el test reúne las condiciones para su aprobación. Si se observa desarrollo en algún tubo, debe repetirse la prueba. Si nuevamente se observa desarrollo en algún tubo, el test será considerado no satisfactorio y debe rechazarse. II - CONTROL DE INOCUIDAD Por inoculación de DOS (2) cobayos por vía intramuscular o subcutánea, con DOS (2) mililitros de vacuna previamente homogeneizada por agitación. Se observarán durante SIETE (7) días al cabo de los cuales no deben existir reacciones generales o locales importantes. Si se constatara una reacción atribuible al producto, el test será declarado no satisfactorio. Si se constatara reacción no atribuible al producto, el test será repetido. Si el test no se repitiera o si se produjeran las mismas lesiones, el producto será declarado no satisfactorio. III CONTROL DE INACTIVACION Por siembre de DIEZ (10) tubos con medio de cultivo apto para el desarrollo de cualquier serovar de Leptospira interrogans con UN (1) mililitro de vacuna debidamente homogeneizada por agitación. Incubación entre 28 a 30°C durante CATORCE (14) días al cabo de los cuales no deben apreciarse leptospiras vivas a la observación microscópica. IV CONTROL DE Ph Debe mantenerse dentro de los límites de pH 7 - 7.4 V CONTROL DE POTENCIA �Se emplearán no menos de VEINTE (20) y no más de VEINTICUATRO (24) hamsters del mismo sexo entre 50 a 90 gramos de peso, divididos en DOS (2) lotes: vacunados y testigos. La vacuna a examinar será diluida en solución fisiológica, de manera que la dosis hamster a inocular (VEINTICINCO centésimas (0,25) de mililitro) represente no más de 1//80 de la dosis para pequeños animales y 1/800 de la dosis para grandes animales. a) Vacunas para pequeños animales: a.1) Dilución de la vacuna: Ejemplo de metodología a seguir: a.1.1.) Agitar enérgicamente el envase a fin de homogeneizar el producto a testar a.1.2.) Tomar CINCO décimas (0,5) de mililitro de vacuna y diluirlo en NUEVE mililitros con CINCO décimas (9,5) de diluyente de manera de obtener una dilución 1/20. a.1.3.) De la dilución efectuada en a.1.2. se tomarán VEINTICINCO centésimas (0,25) de mililitro para inocular cada hamster, que es el equivalente de 1/80 de dosis UN (1) mililitro para pequeños animales. a.2.) Vacunación: se inmunizarán no menos de DIEZ (10) y no más de DOCE (12) hamsters por la vía que corresponda según las indicaciones de la vacuna, con VEINTICINCO centésimas (0,25) de mililitro de la vacuna convenientemente diluida. a.3.) Testigos: se utilizarán no menos de DIEZ (10) y no más de DOCE (12) hamsters de las mismas características que los vacunados que serán mantenidos sin vacunar y separados de los anteriores. b) Vacuna para grandes animales: b.1.) Dilución de la vacuna: Ejemplo de la metodología a seguir: b.1.1.) Agitar enérgicamente el envase conteniendo la vacuna, a fin de homogeneizar el producto a testar. b.1.2.) Tomar UN (1) mililitro de vacuna y diluirlo en NUEVE (9) mililitros de diluyente a fin de obtener una dilución 1/10. b.1.3.) De la dilución efectuada en b.1.2.) tomar UN (1) mililitro y diluirlo en TRES (3) mililitros de diluyente a fin de obtener una dilución 1/40 b.1.4.) De la dilución efectuada en b.1.3.) se tomarán VEINTICINCO centésimas (0,25) de mililitro para inocular a cada hamster, que es el equivalente de 1/800 dosis (CINCO (5) mililitros) para grandes animales. �b.1.5.) Si la dosis es diferente se debe efectuar el cálculo correspondiente. b.2.) Vacunación: Se inmunizarán no menos de DIEZ (10) y no más de DOCE (12) hamsters por la vía que corresponda según las indicaciones de la vacuna convenientemente diluida. b.3.) Testigos: Se utilizarán no menos de DIEZ (10) y no más de DOCE (12) hamsters de las mismas características que los anteriores. c) Test de potencia: CATORCE (14) a DIECIOCHO (18) días posteriores a la vacunación, se inoculan los lotes de hamsters vacunados (a.2.; b.2) y testigos (a.3.; b.3.) por vía intraperitoneal, con una suspensión de cepa virulenta de Leptospira interrogans del mismo serovar con que esté preparada la vacuna, usando una dosis de CINCO décimas (0,5) de mililitro, que represente de 10 a 10.000 dosis letales 50 hamsters determinada por titulación. c.1.) Titulación de cepa de Leptospira interrogans. c.1.1.) A partir de un cultivo bien desarrollado del serovar elegido de Leptospira interrogans de 7 a 10 días de edad, se efectúa un conteo directo por ejemplo en cámara de Petroff-Hauser. Se efectúan diluciones suficientes del cultivo, que permitan su conteo, en solución fisiológica o medio de cultivo para leptospiras. Se cuentan por lo menos 10 a 20 cuadrados y se aplica al cálculo siguiente: Total de bacterias contadas x Dilución x 20.000.000 --------------------------------------------------------------------------- = N° de cuadrados pequeños contados Se obtiene por ejemplo: 2 x 109 c.1.2.) Se efectúan distintas diluciones del cultivo en solución fisiológica: 10 -1, 10-2 , etc. c.1.3.) Por cada dilución se inoculan DIEZ (10) hamsters por vía intraperitoneal con CINCO décimas (0,5) de mililitro. c.1.4.) Aplicando el método de Reed y Muench para dosis letal (DL 50) se encuentra que ésta se ubica por ejemplo en 10 -5. En el recuento con cámara de Petroff-Hausser el resultado fue de DOS MIL MILLONES (2.000.000.000) de leptospiras por mililitro. N° de bacterias contadas -----------------------------------= número de bacterias por mililitro Dilución �2.000.000.000 En el ejemplo: --------------------------= 20.000 bacterias por mililitro 100.000 Como la dosis a inocular es de 5 décimas (0,5) de mililitro el número de bacterias en ese volumen es de 10.000 10.000 es equivalente a 1 dosis letal 50. c.1.5.) Se establece que para la prueba de potencia es necesario inocular de 10 a 10.000 dosis letales 50. Luego, si se inoculan por ejemplo 100.000 bacterias con CINCO décimas (0,5) de mililitro, se están inoculando 10 dosis letales 50. c.2.) Observación de los animales: Durante CATORCE (14) días registrándose la muerte de cada animal por lote. c.3.) Interpretación de resultados: el test es válido si mueren OCHO (8) o más testigos. Si mueren los animales vacunados, la evaluación se hará en base a la siguiente tabla: Etapa Número de Número Total acumulativo Vacunados acumulativo de muertos para test de vacunados. satisfactorio Total acumulativos muertos para test no satisfactorio 1 10 10 2 o menos 5 o más 2 10 20 5 o menos 6 o más Si mueren TRES (3) o CUATRO (4) animales vacunados, se efectúa el test de la segunda etapa. La evaluación final de la vacuna en control se hará en base a la segunda parte de la tabla y a los totales acumulados. ARTICULO 2°.- No existiendo una cepa de referencia nacional o internacional de cualquier serovar de Leptospira interrogans para ser empleada en la producción de inmunógenos, las cepas empleadas por la industria privada en la elaboración de los mismos deberán estar tipificadas por un organismo nacional o internacional reconocido (Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria o Centro Panamericano de Zoonosis). ARTICULO 3°.- Los laboratorios productores deberán presentar mensualmente una declaración jurada de las series de vacunas contra leptospirosis en la que conste: número de serie, número de dosis que la compone y controles a los que se las ha sometido. De cada serie el laboratorio productor conservará DIEZ (10) envases por el lapso de validez de la misma, los que podrán ser requeridos por el SERVICIO DE LABORATORIOS para realizar los controles que estime necesarios. �ARTICULO 4°.- Las partidas de vacunas contra leptospirosis deberán constar por lo menos de VEINTE MIL (20.000) dosis. ARTICULO 5°.- Para la realización de los controles, las muestras serán obtenidas cuando la totalidad de la serie haya sido envasada, rotulada, estampillada y presentada en las condiciones en que ha de ponerse en venta, con su estuche y prospecto correspondiente si los tuviere. ARTICULO 6°.- El SERVICIO DE LABORATORIOS realizará los controles citados de las series elaboradas por el sistema de muestreo aleatorio, de tal forma que cada laboratorio productor recibirá como mínimo UN (1) control anual. Si el laboratorio productor no aprobare el primer control realizado sobre una serie, el mismo será mantenido a lo largo de SEIS (6) series siguientes o los que se consideren necesarios para garantizar la calidad del producto. ARTICULO 7°.- El SERVICIO DE LABORATORIOS podría facilitar cepas de Leptospira interrogans cuando éstas sean solicitadas para los controles de potencia y toda vez que dicha solicitud esté debidamente justificada. ARTICULO 8°.- Cuando se comprobare infracción a las normas establecidas o las vacunas elaboradas no aprobaren los controles correspondientes, la partida en control deberá ser decomisada; dicha acción se realizará sobre el envase primario del producto y deberá producir su destrucción total. El laboratorio productor tendrá un plazo de CINCO (5) días hábiles para solicitar el análisis de contraverificación. ARTICULO 9°.- Los laboratorios productores de vacunas contra leptospirosis tendrán un plazo de DOCE (12) meses a partir de la puesta en vigencia de la presente reglamentación para ajustarse a las normas prescriptas. ARTÍCULO 10.- Comuníquese a las firmas titulares de permisos de uso y comercialización de vacunas contra leptospirosis. ARTICULO 11.- Regístrese y archívese. DISPOSICION N° 405 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Disp. Laboratorios Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Disposición SENASA N° 0405/1988 Description An account of the resource Controles de series, uso y comercializacion de vacunas contra Leptospirosis, producidas por la actividad privada. Creator An entity primarily responsible for making the resource Servicio Nacional de Sanidad Animal Source A related resource from which the described resource is derived <a href="http://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=153042">Disposición SENASA N° 0405/1988</a> Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource Viernes 27 de Mayo de 1988 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Disposición Abstract A summary of the resource. Se establece que todas las vacunas destinadas a prevenir la leptospirosis deberán satisfacer los controles de esterilidad, inocuidad, inactivavión, pH y potencia. Requisitos para los laboratorios. Is Replaced By A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource. <strong>Abrogada por Art. 7 de la <a href="https://digesto.senasa.gob.ar/items/show/id/913">Disposicion N° 1/2025 de la Direccion General de Laboratorios y Control Tecnico</a></strong> https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/0e11340a637b06c3ae1f958a0f7cecd4.pdf 4f6f5b8500a167e9d91b10c236c244cb PDF Text Text TESIS PARA ACCEDER AL TÍTULO DE MAGISTER EN INVESTIGACION EN CIENCIAS DE LA SALUD _________________________________________________________________________ Título: ANALISIS PARASITOLOGICO DE IMPORTANCIA SANITARIA EN LOS CARACOLES GIGANTES AFRICANOS (Lissachatina Fulica) EN MISIONES Autor: M.V. Emiliano Reinante Directora de tesis: Dra. TEIBLER, Pamela Co-Directores: M.V. ALVAREZ, Darío; Mgter. VIZCAYCHIPI, Katherina A. Año: 2019 �Dedico esta tesis a Victoria y Alma AGRADECIMIENTOS: Al Director de la Regional COR-MIS (Corrientes Misiones), del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA): Ing. Agr. Pedro Méndez; al Coordinador de Protección Vegetal (P.V.): Ing. Agr. Carlos Benzo; al Ing. Agr. Enrique Giménez, de la Oficina Local de P.V. de la localidad de Puerto Iguazú, Misiones. Al Coordinador de Inocuidad y Calidad Agroalimentaria: Dr. Marcelo Gorgo. Al personal SENASA destacado en los Puestos de barreras zoofitosanitarias de la provincia de Misiones. A la Facultad de Ciencias Veterinaria de la “Universidad Nacional del Nordeste” (UNNE). Ciudad de Corrientes. A la Facultad de Veterinaria de la “Universidad del Salvador” (USAL), Campus “S.R.G.S.C.” Gdor. Ing. V. Virasoro, Corrientes. 2 �COMO RESULTADO DE ESTE TRABAJO SE REALIZARON LAS SIGUIENTES PRESENTACIONES A CONGRESOS Y PUBLICACIONES:  Sesión Científica, poster en: XVIII Sesiones de Comunicaciones Técnicas y Científicas Estudiantiles - Facultad de Ciencias Veterinarias, UNNE (17 de octubre de 2019, Corrientes, Argentina). Titulo: Caracol gigante africano (Lissachatina fúlica) de Misiones, identificación morfológica y análisis de materia fecal. Autores: Saldivar S; Buyatti M; Acosta F; Reinante E; Álvarez D.  Sesión Científica, ponencia oral y poster en: I Congreso de Ciencias de La Salud (22 al 23 de noviembre de 2019, Universidad Autónoma de Encarnación (UNAE), Encarnación, Paraguay). Titulo: Caracol gigante africano – Lissachatina fúlica – Identificación morfológica y Análisis parasitológico. Misiones, Argentina. Autores: Reinante E; Álvarez D; Teibler P; Vizcaychipi K. (Ver ANEXO I a y b). 3 �RESUMEN El caracol Gigante Africano, Lissachatina fulica, está incluido en la lista de las 100 especies exóticas invasoras más dañinas del mundo, fue reportado por primera vez en Argentina en la ciudad de Puerto Iguazú, provincia de Misiones, Argentina (2010), más tarde, en la ciudad de Corrientes Capital (2013) y en el año 2019 fue detectado en dos localidades más de la provincia de Misiones (Wanda y Eldorado). Esta especie de caracol siendo hermafrodita, crece y se reproduce a gran velocidad, presentando una alta resistencia a variables ambientales, adaptabilidad a diferentes regiones, dieta polífaga y la ausencia o desconocimiento de depredadores naturales contribuyen a su dispersión, pudiendo producir daños importantes en cultivos agrícolas, hortícolas y ecosistemas nativos, como también, actuar de transmisor de parásitos que puedan afectar a la Salud Pública. El siguiente trabajo se realizó en los períodos comprendidos entre los meses de diciembre de 2018 y diciembre de 2019, donde se procedió a la identificación morfológica y recolección de las conchillas de moluscos de la especie Lissachatina fúlica y su materia fecal, para su posterior análisis parasitológico. Todos los moluscos fueron recolectados de la localidad de Puerto Iguazú, con el objetivo de detectar parásitos de implicancia sanitaria (médica y veterinaria). De un total de 201 moluscos se identificaron por género y especie tres grupos: Grupo 1 (G1): Lissachatina fulica n=199; Grupo 2: Helix aspera n:1 y Grupo 3: Bulimus sp. n:1. A todos los individuos del G1 se los clasifico según categorías de tamaños definidas como: Clase 1: individuos recién eclosionados (hasta 10 mm) n= 6; Clase 2: juveniles (10 a 40mm) n=149; Clase 3: adultos jóvenes (40 a 70 mm) n=35 y Clase 4: adultos (> 70 mm) n= 9. Del análisis parasitológico efectuado a los pooles de materia fecal de L. fulica, se encontraron taxones parasitarios predominando larvas del orden Strongylida y larvas de vida libre sin especificar, como también se observaron huevos de nematodes del genero Ancylostoma spp.. Se observaron protozoos correspondientes a quistes de Ameba 4 �spp.; Giardia spp. y ooquistes de Cystoisospora spp. Por su parte en el análisis de baba de 9 ejemplares adultos de L. fulicas se encontraron taxones parasitarios del Orden Strongylidamy del Orden Ascaridea Familia Toxocaridae compatibles con el genero Toxocara spp. En muestras de baba se observaron también cristales de oxalato de calcio. Por otra parte, en 11 (once) localidades fronterizas de la provincia Misiones, se realizaron 92 encuestas, con el fin de evaluar el grado de conocimiento de la población, donde se constató un desconocimiento de la problemática en un 67,4% de los casos encuestados. Teniendo en cuanto que los factores antrópicos son la principal causa de los saltos de dispersión de esta especie, es fundamental realizar trabajos de educación sanitaria para concientizar y prevenir futuras invasiones que conlleven a perjuicios sanitarios, al ecosistema y a la agricultura. En ese contexto, a cada encuestado se entregó material informativo y las recomendaciones brindadas por el parte del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria de Argentina. Palabras claves: Caracol Gigante Africano – Morfología – Parasitología – Prevención – Vigilancia. 5 �SUMMARY The African Giant snail, Lissachatina fulica, is included in the list of the 100 most harmful invasive exotic species in the world, it was first reported in Argentina in the city of Puerto Iguazú, Misiones province, Argentina (2010), later, in the city of Corrientes Capital (2013) and in 2019 it was detected in two more locations in the province of Misiones (Wanda and Eldorado). This species of snail, being hermaphrodite, grows and reproduces at high speed, presenting high resistance to environmental variables, adaptability to different regions, polyphagous diet, and the absence or lack of knowledge of natural predators that contribute to its dispersion, potentially causing significant damage to agricultural crops, horticultural and native ecosystems, as well as acting as a transmitter of parasites that may affect Public Health. The following work was carried out in the periods between the months of December 2018 and December 2019, where the morphological identification and collection of the mollusk shells of the Lissachatina fulica species and their fecal matter were carried out, for subsequent parasitological analysis. All the molluscs were collected from the town of Puerto Iguazú, with the aim of detecting parasites of sanitary implication (medical and veterinary). From a total of 201 mollusks, three groups were identified by genus and species: Group 1 (G1): Lissachatina fulica n = 199; Group 2: Helix aspera n: 1 and Group 3: Bulimus sp. n: 1. All G1 individuals were classified according to size categories defined as: Class 1: newly hatched individuals (up to 10 mm) n = 6; Class 2: juveniles (10 to 40mm) n = 149; Class 3: young adults (40 to 70 mm) n = 35 and Class 4: adults (> 70 mm) n = 9. From the parasitological analysis carried out on the L. fulica stool poles, parasitic taxa were found, predominantly larvae of the Strongylida order and unspecified free-living larvae, as well as eggs of nematodes of the genus Ancylostoma spp. were observed. Protozoa corresponding to Ameba spp cysts were observed; Giardia spp. and oocysts of Cystoisospora spp. On the other hand, in the analysis of slime of 9 adult specimens of L. fulicas, parasitic taxa of the 6 �Order Strongylidamy of the Order Ascaridea Family Toxocaridae compatible with the genus Toxocara spp. Calcium oxalate crystals were also observed in slime samples. On the other hand, in 11 (eleven) border towns of the Misiones province, 92 surveys were conducted, in order to assess the degree of knowledge of the population, where a lack of knowledge of the problem was found in 67.4% of the surveyed cases. Considering that anthropogenic factors are the main cause of the dispersal jumps of this species, it is essential to carry out health education work to raise awareness and prevent future invasions that lead to health damage, to the ecosystem and to agriculture. In this context, informative material and the recommendations provided by the National Service of Agrifood Health and Quality of Argentina were delivered to each respondent. Keywords: African Giant Snail - Morphology - Parasitology - Prevention - Surveillance. 7 �ÍNDICE GENERAL 1. INTRODUCCIÓN 9 1.1. Presentación. Especies Exóticas Invasoras 9 1.2. Caracol Gigante Africano. Presentación 11 1.2.1. Biología y distribución geográfica 11 1.2.2. Aspecto ambiental/biodiversidad 14 1.2.3. Aspecto socioeconómico 16 1.2.4. Aspectos sanitarios. (Médico y veterinario) 17 2. JUSTIFICACIÓN 21 2.1 Implicancias de Caracol Gigante Africano 21 2.2 Planteamiento del Problema 22 2.3 Preguntas de Investigación 22 3. OBJETIVOS (Gral. y específicos) 23 3.1 Alcance e Hipótesis 23 4. ESTADO ACTUAL DEL TEMA 24 5. MARCO METODOLÓGICO 28 6. RESULTADOS 38 6.1 Estudio de situación, Provincia de Misiones 38 6.2 Análisis morfológico de los moluscos 41 6.3 Estudios parasitológicos 41 6.4 Evaluaciones cualitativas. Conocimiento del Caracol Gigante Africano (L. fulica) por parte de la población de Misiones 43 7. DISCUSION Y CONCLUSIONES 46 8. COMENTARIO FINAL 49 9. BIBLIOGRAFÍA (Citada y consultada) 50 10. ANEXOS 58 8 �1. INTRODUCCIÓN 1.1. Presentación. Especies Exóticas Invasoras Las especies exóticas invasoras (EEI) son animales, plantas o microorganismos transportados más allá de sus áreas de distribución natural que, una vez introducidos, consiguen establecer en el nuevo ambiente poblaciones autosostenibles y avanzar sin ayuda humana directa sobre ambientes con distinto grado de transformación, incluyendo con frecuencia áreas de alto valor para la conservación y la producción. A nivel global son reconocidas como la segunda causa más importante de pérdida de diversidad biológica, sólo precedida por la destrucción de los ambientes naturales. Muchas de ellas son responsables, asimismo, de daños económicos significativos, comportándose como plagas de cultivos, patógenos y parásitos de animales domésticos o competidores de especies de alto valor forrajero. Su introducción con frecuencia resulta también en efectos negativos directos o indirectos sobre la salud Pública. En Argentina los ejemplos de EEI con impactos severos sobre valores ambientales y socio económicos incluyen especies tan diversas como el castor que amenaza los bosques de Tierra del Fuego, los tamariscos que reducen el agua freática en regiones áridas del país, el alga didymo que afecta el valor turístico de los ríos patagónicos y el mosquito transmisor del dengue que amenaza la salud de miles de personas. Las actuales tendencias de globalización del comercio internacional y las consecuencias del cambio climático permiten prever que el problema de las invasiones biológicas aumente (Fisher et al., 2010). Según datos del Sistema Nacional de Información sobre Especies Exóticas Invasoras, existen en el país un total de 654 EEI de plantas, animales, vertebrados, invertebrados, algas y hongos. Organización de las Naciones Unidas para la alimentación y la agricultura (FAO). Recuperado de: www.argentina.gob.ar/ambiente/biodiversidad/exoticasinvasoras (2019). De esta manera, Achatina (Lissachatina) fúlica, (Bodwich, 1822), un gasterópodo terrestre originario del África oriental, en adelante el “Caracol Gigante Africano” (CGA), es 9 �considerado como una de las plagas más perjudiciales (Floyd et al., 2005), formando parte de las 100 EEI más importantes del mundo según la Unión Internacional para la conservación de la Naturaleza. Según Fisher et. al. (2010), el CGA fue introducido a la República Federativa del Brasil de manera intencional y con fines comerciales en el año 1988, a una feria agropecuaria realizada en Curitiba, estado de Paraná y con el objetivo de remplazar al escargot verdadero (Helix aspersa), al no prosperar la producción por falta de mercado, los moluscos fueron abandonados y liberados en distintos ambientes para que luego y gracias a sus características biológicas, el CGA logre en poco tiempo colonizar exitosamente los ecosistemas urbanos y rurales, con un relativo impacto negativo en la flora y fauna nativas y a nivel socioeconómico a menor escala (Virgillito et al., 2015). Uno de los principales intereses en Lissachatina fulica es su implicancia en la salud (Acha & Szyfres, 2003), ya que puede actuar como un hospedador intermediario de Metastrongylidae, nematodos de importancia médica y veterinaria. En la actualidad, el CGA se encuentra oficialmente en cuatro localidades Argentinas, tres de la Provincia de Misiones y la cuarta en la ciudad capital de la provincia de Corrientes. Según el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria de Argentina, de aquí en adelante: SENASA, a través de su Dirección de Vigilancia y Monitoreo de Plagas, dependiente de Dirección Nacional de Protección Vegetal, de aquí en adelante: DNPV, y de la Coordinación de Protección Vegetal (CRPV) -Regional COR-MIS. (Ver Planteamiento del Problema). 10 �1.2. CARACOL GIGANTE AFRICANO. PRESENTACIÓN 1.2.1 Biología y distribución geográfica El gasterópodo terrestre Lissachatina fulica perteneciente al Phylum Mollusca presenta la siguiente clasificación taxonómica: Clasificación Taxonómica: Phylum: Mollusca Clase: Gastropoda Subclase: Pulmonata Orden: Stylommatophora Familia: Achatinidae Género: Achatina Especie: Lissachatina Fulica Nombres comunes: Español: caracol gigante africano. Ingles: giant African snail, giant African land snail, kalutara snail. El CGA en su aspecto morfológico posee una conchilla cónico ovalada pudiendo medir unos 7,5 a 12cm y en casos excepcionales hasta 20cm de largo, con un diámetro de 6cm, pudiendo pesar hasta 600 gramos. Los adultos tienen color castaño claro, con bandas longitudinales anchas castaño oscuras. Los juveniles recién eclosionados y hasta los 4cm poseen una conchilla más clara y solo la mitad de la última vuelta tiene bandas longitudinales más oscuras, aunque más finas que en los adultos. Su abertura, tanto de juveniles como adultos, no es continua y se ve interrumpida por un pliegue o truncamiento de su eje interno o base de la columela (columna) (Fisher et. al., 2010) (Ver ANEXO II). Siendo hermafrodita simultáneo: cada individuo puede producir tanto esperma como óvulos, lo que posibilita la fecundación recíproca pero no puede auto fecundarse, 11 �hacen su puesta de 400 a 500 huevos cada dos meses, pudiendo llegar hasta los 1800 huevos al año, con una viabilidad del 85 a 95% (prácticamente todos eclosionan). Sus huevos miden unos 0,5cm son de color blanco y los entierra hasta 15cm bajo la superficie o los deposita entre las rocas, eclosionando en unas pocas horas hasta los 17 días Dependiendo de las condiciones climáticas, puede alcanzar la madurez sexual alrededor de 5 a 15 meses. Viven hasta 9 años, con 5 o 6 de promedio (Raut & Barker, 2002). Figura 1: Ciclo de vida de Lissachatina fúlica. (Adaptado de www.agrocalidad.gob.ec) 12 �Aunque son especies de zonas cálidas y algo áridas de clima tropical y subtropical, puede adaptarse a cualquier tipo de hábitat, desde las zonas intervenidas hasta los pantanos y zonas urbanas, donde exista vegetación, También, prefiere los ambientes que son ricos en carbonato de calcio, tales como piedra caliza, áreas con cemento u hormigón, incluso tienen el habito de ramonear paredes o conchillas de otros caracoles para obtener calcio (Gutiérrez Gregoric, 2011). Son omnívoros – Polífagos (herbívoros, necrófagos y carnívoro) pero se alimentan sobre todo de materia vegetal y pueden desarrollar la coprofagia (Salomón et. al., 2013), de gran voracidad y presentando hábitos de alimentación nocturna. Ésta especie prefiere sitios no expuestos directamente a la luz solar, con alta humedad ambiental (70%) y temperatura entre los 18 y 20°C. Sobreviven a condiciones adversas enterrándose y cubriendo el caparazón con una membrana o tapón mucoso semipermeable denominado epifragma, que disminuye la pérdida de agua permitiendo superar los períodos de sequía mediante un proceso de estivación, durante el que el animal permanece en el interior de la concha con metabolismo ralentizado e impidiendo el ingreso de posibles depredadores. Características biológicas que en conjunto, contribuyen a que el CGA sea una especie invasora exitosa. Estos caracoles son originarios de la costa africana oriental, en particular SubSahara (Raut & Barker, 2002). En países del continente africano se lo conoce bajo el nombre de “lambí”. La dispersión del CGA alrededor del mundo comenzó a principios del siglo XIX expandiéndose hacia la Costa Este de África, posteriormente a Madagascar, Mauritius y Seychelles. Este molusco ingresó a la India en 1847, expandiéndose luego a casi todo el continente asiático, llegando a Taiwán, Malasia, Japón, Sumatra y Filipinas a fines de 1930 (Valente, 2017). La introducción del CGA en el continente americano se inició en Hawai, en 1939, por una pobladora que provenía de Japón. Expandiéndose luego al continente americano, registrado en Florida (EEUU), a inicios de la década del 70 (Virgillito et. al 2015). 13 �A fines de 1988 se estableció en la Isla Martinica, para luego introducirse en Barbados y Santa Lucia (islas del Caribe). En Sudamérica, existen antecedentes de su presencia en Ecuador (Correoso Rodríguez, 2006), Colombia (De La Ossa-Lacayo et al., 2012), Venezuela, Paraguay (Secretaria del Ambiente Paraguay, S/F), el Perú (Borrero et al., 2009), en la República Federativa del Brasil se encuentra ampliamente distribuido, estando extendido en al menos 24 de los 26 estados brasileños (Maldonado Junior et al., 2010). 1.2.2 Aspecto ambiental/biodiversidad Los costos para el medio ambiente pueden incluir herbivoría; cambios físicos/químicos en agua y suelo por alteración en el ciclo de nutrientes asociado con grandes volúmenes de material vegetal que pasan a través del intestino de L. Fulica (Raut & Barker, 2002), como también por sus cuerpos en descomposición y por el carbonato de calcio de sus conchas que neutraliza los suelos ácidos, alterando las propiedades del mismo y los tipos de plantas que pueden crecer en el suelo (Mead, 1961). Otro punto importante es por desplazamiento de poblaciones de moluscos nativos por competencia (Correoso, 2006). Los caracoles gigantes africanos son competidores de hábitat y alimento, contribuyendo a una disminución en la biodiversidad y a un desequilibrio en el ecosistema (Beltramino et al., 2015). Su comportamiento voraz, gran capacidad reproductiva, el crecimiento acelerado y su resistencia a las condiciones ambientales desfavorables, les otorgan ventajas respecto a los caracoles indígenas. Aunque L. fulica es principalmente vegetariana, hay evidencia de que también puede actuar como un depredador de otros caracoles (Meyer et al., 2008). Es probable que, debido a los altos requerimiento de calcio en la dieta del CGA, éste se alimente del caparazón de otros caracoles. También pueden ocurrir efectos adversos indirectos sobre los gasterópodos autóctonos que pueden surgir a través del control del caracol (por ejemplo: uso indebido de 14 �molusquicidas) o a la destrucción de especies nativas como el Megalobulimus por desconocimiento. Figura 2: Conchilla de ejemplares adultos de Megalobulimus sp. (izquierda) y del CGA. Extraído de Gutiérrez G. & col. “Un gigante africano invade la Argentina” Artículo Vol. 22 número 129. p42. Facultad de Ciencias Naturales y Museo (UNLP). El CGA ha causado la extinción o declinación de especies de caracoles terrestres endémicos en islas (Cowie 1968; Holland et al., 2012). Aunque, es importante resaltar que muchas de las invasiones que han causado los mayores impactos tanto económicos como medioambientales fueron intencionales y planificadas. […]El caracol depredador de América Central, Euglandina rosea, por ejemplo, liberado en muchas islas del Pacífico para 15 �controlar al CGA ha causado la extinción de al menos treinta especies y subespecies endémicas de caracol en esas islas” (Wittenberg & Cock 2001). 1.2.3 Aspecto socioeconómico En la agricultura tropical el costo causado por el CGA es cuatro veces mayor. Primero está la pérdida del rendimiento del cultivo causada por la herbivoría la cual no sucede a gran escala. En varios países éste molusco es considerado una plaga de importancia agrícola, ya que posee una dieta polífaga (Albuquerque et al., 2008). Al no presentar preferencia sobre ningún cultivo en particular es capaz de alimentarse de más de doscientas especies vegetales, varias de éstas cultivables. (Raut & Barker, 2002), aunque si se conocen las plantas con mayor probabilidad de daño, que son las cucurbitáceas y las leguminosas (Mead, 1961). Nuestro país tiene una gran diversidad de especies cultivables y muchas de ellas son citadas en las bibliografías internacionales como hospedadores de ésta plaga, por ejemplo: el maíz (Zea mays), los cítricos (Citrus spp.), la soja (Glycine max) y numerosas hortícolas cómo la lechuga (Lactuca sativa), acelga (Beta vulgaris), entre otras (Virgillito, 2015). En segundo lugar, el daño puede ser causado por la propagación de enfermedades de plantas. L. fulica puede distribuir en sus heces esporas del hongo oomiceto Phytophthora palmivora (Raut & Barker, 2002). En tercer lugar, está el costo asociado con el control de la plaga. La erradicación de estos organismos es costosa (Mead 1961; Raut & Barker, 2002), los cuales pueden variar desde USD 60.000 dólares para un procedimiento de 7 meses, hasta más de USD 700.000 a un millón de dólares, utilizados para la erradicación en el estado de Florida. Simberloff 1996 en, Impacts of Introduced Species in the United States, Consequences 2(2), 13-23, 1996 / (Cap. V, p. 184) “Especies exóticas Invasoras: Una guía sobre las mejores prácticas de prevención y gestión”, estimo que en el mismo estado que de no ser controlado, el caracol gigante africano habría causado una pérdida anual de USD 11 millones en 1969 (USD 1982). 16 �En India alcanzó un grave estado de plaga, particularmente en 1946/1947, cuando apareció en proporciones epidémicas en Orissa y causó graves daños a los cultivos de hortalizas y arrozales (Pallewatta et al., 2002). Finalmente, hay oportunidades perdidas con los cambios forzosos en la práctica agrícola, como limitar los cultivos en una región a aquellos resistentes a la infestación de caracoles (Raut & Barker, 2002), como también, costos por traslado de tierra o arena provenientes de zonas seguras, como sucedió recientemente en el Parque Nacional de Iguazú, provincia de Misiones, donde las autoridades solicitaron la certificación de la arena que ingresaría para obras de cableado subterráneo a realizarse dentro de la Reserva Natural, la cual fue enviada desde 240 Km al Sur de Puerto Iguazú (Localidad de San Ignacio, Misiones), siendo la carga precintada y certificada en origen como libre del molusco, por funcionarios de la Dirección Nacional de Protección vegetal de la Regional COR-MIS, dependiente del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Ver ANEXO III). El caracol gigante africano en busca de fuentes de calcio ramonea paredes de yeso, piedras calizas por lo que se considera que impacta negativamente en la infraestructura (de la Ossa-Lacayo et al., 2012). 1.2.4. Aspectos sanitarios. (Médico y veterinario) El siguiente punto trata de las distintas implicancias sanitarias de L. fúlica, el cual puede actuar como hospedador intermediario en el ciclo de vida de dos nematodos perjudiciales para la salud humana: Angyostrongylus cantonensis (Chen, 1935,) y Angyostrongylus costaricensis (Morera & Céspedes, 1971). El primero es causante de la meningoencefalitis eosinofílica, y el segundo, agente causal de angiostrongilosis abdominal, una enfermedad que se extiende desde el sur de Estados Unidos hasta el norte de Argentina. (Oliveira et al., 2010). 17 �La familia Metastrongyloidea, en su mayoría, son parásitos pulmonares de mamíferos (hospedadores definitivos) y los gasterópodos son sus hospedadores intermediarios con muy pocas excepciones. Los adultos de Angyostrongylus cantonensis se localiza generalmente en las arterias pulmonares de las ratas (Rattus rattus y Rattus norvegicus), que actúan como hospederos definitivos y es la causa más frecuente de meningoencefalitis eosinofílica en el hombre (Alicata, 1991). Los adultos de Angyostrongylus costaricensis se localizan generalmente en las arterias mesentéricas. Las hembras eliminan huevos que eclosionan y producen juveniles de primer estadio (J1) en las ramas terminales de las arterias pulmonares, migran a la faringe, son deglutidas y eliminadas en las heces. En el exterior, los (J1) invaden un hospedador intermediario (caracoles o babosas) en el cual, en un período aproximado de dos semanas, sufren dos mudas hasta convertirse en juveniles de tercer estadio (J3) que resultan infectivos para los hospederos definitivos (mamíferos). Cuando los hospedadores definitivos ingieren el molusco o sus secreciones infectantes, los juveniles (J3) migran al cerebro donde sufren dos mudas larvarias más hasta llegar a convertirse en juveniles de quinto estadio (J5) o adultos jóvenes, lo que ocurre aproximadamente en cuatro semanas. Estos adultos jóvenes regresan al sistema venoso para llegar a las arterias pulmonares, donde, después de otras dos semanas, alcanzan la madurez sexual y pueden empezar a depositar huevos (Anderson, 2000) (Ver ANEXO IV). Según Dorta-Contreras et al. (2007) existen varias especies de animales que pueden actuar como hospedadores paraténicos o de transporte (ranas, camarones de agua dulce, cangrejos), ya que al ingerir caracoles o babosas infectados transportan los J3. Luego estos hospedadores paraténicos pueden ser ingeridos por un hospedador definitivo cerrando el ciclo del parásito. Los humanos, al igual que otros mamíferos, pueden comportarse como hospedadores definitivos accidentales al adquirir la infestación por la ingestión de caracoles o babosas crudas, con las secreciones de moluscos u otros animales (hospedadores paratenicos). Las 18 �personas generalmente se infectan al comer alimentos crudos o poco cocidos, contaminados con las larvas de A. cantonensis y A. costaricensis, o cuando manipulan huéspedes intermedios para la pesca (Ping-Wang et al., 2008; Romero-Alegría et al., 2014). La migración parasitaria en humanos se detiene en el cerebro y más raramente en los pulmones, donde los nematodes mueren, por lo cual el ciclo nunca termina de completarse. Los síntomas de éstas enfermedades pueden ser confundidos con una meningitis en el caso de Angyostrongylus cantonensis, causando Meningitis de tipo eosinofílica, (inducida por la respuesta de los eosinofios hacia los J3), cursando con fiebre, parestesia, vómitos, cefaleas, convulsiones, rigidez de nuca, aumento de la presión intracraneal y parálisis facial. También se conoce una forma Pulmonar y Ocular. Según Salomón et. al (2013): La dispersión global de A. cantonensis se encuentra asociada a la rápida propagación de L. fúlica. Varios casos clínicos de meningoencefalitis eosinofílica causada por éste nematodo fueron registrados en América del Norte, Centroamérica y América del Sur, muchos de los cuales llegaron a causar la Muerte. En el caso del Angyostrongylus costaricensis podrían confundirse con una peritonitis con dolor localizado en la fosa ilíaca y/o flanco derecho, cursando con vómitos, anorexia, diarreas y sangrado intestinal, pudiendo existir tanto perforación intestinal como oclusión, entre otros. (Acha & Szyfres, 2003). Por lo que, la capacidad del CGA de proliferar en ambientes urbanos (sinantropismo) y sus características polifágicas como la coprofagia, nos alerta frente al posible potencial epidemiológico como dispersor biológico o H.I. de nematodos de interés médico y veterinario. Por otro lado, las helmintiosis forman parte de las enfermedades tropicales desatendidas (Neglected tropical diseases-NTDs) y su casuística también se ven afectadas por el incremento en los indicadores bioclimáticos. Se han realizado estudios donde se comprueba la capacidad del CGA como portador y dispersor importante de protozoos, 19 �geohelmintos y bacterias de interés sanitario (médico y veterinario) (A. Morocoima, et al., 2014). Según Matinella et al., (2009): Lissachatina fulica ha sido mencionado como transportador mecánico de diferentes estados de dispersión de helmintos de importancia sanitaria como Schistosoma mansoni, Trichuris spp., Strongyloids spp., e Hymenolepis spp., las cuales se encuentran en heces y secreciones mucosas del hospedero definitivo”. Por lo tanto, la presencia de éste molusco en un área determinada puede ser utilizada como indicadora de riesgo de importancia sanitaria. Por otra parte (Valente et al., 2017) expresa que […] La presencia del caracol africano gigante A. fúlica en Puerto Iguazú se considera alarmante, no sólo por su efecto negativo en poblaciones de moluscos nativos, sino también, por su papel como huésped intermedio de parásitos de Importancia médica y veterinaria. Este estudio constituye el primer registro de un nematodo Metastrongyloidea en A. fúlica en Argentina y también destaca la susceptibilidad de este molusco como intermedio anfitrión de otros helmintos de importancia para la salud. Con respecto a la salud Animal, Angiostrongylus vasorum (Baillet, 1866) y Aelurostrongylus abstrusus (Railliet, 1898), son de importancia veterinaria, Angiostrongylus vasorum, produce infestación a nivel de la arteria pulmonar y el ventrículo derecho de los cánidos salvajes y domésticos. (Franco-Acuña et al., 2009; Maldonado Jr. et al., 2010). El Aelurostrongylus abstrusus causa la aelurostrongilosis’, también conocida como estrongiloidosis felina, con sintomatología variada como: Tos, estornudos, sibilancias, disnea, secreción ocular-nasal y pérdida de peso progresiva. Los gusanos adultos viven en los bronquiolos y conductos alveolares produciendo pulmonía granulomatosa subclínica en gatos (Headley, 2005), dependiendo de la carga parasitaria, edad y sistema inmune del animal. Aelurostrongylus abstrusus tiene una amplia distribución geográfica. (Bjork et al., 2000; Traversa et al., 2008; Barutzki & Schaper, 2013). 20 �En Argentina, se han reportado adultos de esta especie en gatos domésticos en Buenos Aires, Corrientes y Santa Fe (Idiart et al., 1986; Schiaffi et al., 1995). Varios gasterópodos han sido reportados como hospedadores intermediarios de A. abstrusus: Subulina sp; Arion sp; Cernuella virgata; Achatina fúlica; Helix aspersa y Rumina decollata (Hobmaier y Hobmaier, 1935; Thiengo et al., 2008; Ohlweiler et al., 2010; Di Cesare et al., 2013; Cardillo et al., 2014). L. fulica también fue reportada cómo hospedador intermediario de nematodos del género Strongyluris (Heterakidae) (Franco-Acuña et al.,2009), los cuales no tienen impacto sobre la salud humana y son parásitos principalmente de reptiles como ser: Strongyluris oscari Travassos y Tropidurus spinulosus en el noreste de Argentina. (Sutton et. al. 1998). 2. JUSTIFICACIÓN _______________________________________________________________ 2.1. Implicancias del Caracol Gigante Africano A nivel mundial las implicancias sobre la salud humana, animal, ambiental y la economía de las poblaciones afectadas por esta plaga invasora, estimularon la instalación de acciones de control en los países que exhiben esta problemática. En Argentina al día de hoy, por su rápida dispersión y riesgos que implica, se lo mantiene en la agenda de los Sistemas Sanitarios y ambientales como un problema que demanda vigilancia y control. En ese sentido y por lo reflejado en encuestas realizadas, aún se requiere de esfuerzos conjuntos entre organismos nacionales, provinciales y municipales para su mayor conocimiento, vigilancia y control, como también, en la difusión y concientización de la problemática. En este sentido se hace necesario aumentar el conocimiento científico sobre la biología de esta especie invasora y desarrollar estrategias de 21 �acción que lleguen a la comunidad y su conjunto, que permitan realizar las medidas preventivas para alcanzar de manera eficaz la protección de la salud en toda la población. 2.2. Planteamiento del problema En la Argentina, el caracol gigante africano fue detectado oficialmente en junio de 2010 en la provincia de Misiones (Gutiérrez Gregoric et al., 2011) y posteriormente en la ciudad de Corriente (Gutiérrez Gregoric et al., 2011). En abril de 2019, fue detectado en un barrio de la localidad de Wanda, Misiones (50 Km al sur de Puerto Iguazú) y en el mes de mayo del mismo año, en la Localidad de Eldorado (51 Km al sur de Wanda), por el SENASA – DNPV y Centro Regional NEA. La expansión del CGA actualmente en la ciudad de Puerto Iguazú se encuentra prácticamente en toda la localidad, afectando diferente puntos geográficos como ser: Ribera del Paraná y zonas del puerto, villa nueva, Santa Rosa, villa alta, villa 14, barrio las orquídeas, barrio alto de Iguazú, entre otros. A diferencia de Corrientes capital, en la cual el foco de infestación continúa acotado a una zona reducida, motivo por el cual, en éstos lugares se tienen que redoblar esfuerzos para su control y erradicación, como también, en la difusión y concientización de la problemática. 2.3. Preguntas de investigación ¿Cuál es el estado actual de dispersión del CGA? ¿Puede actuar el CGA como amplificador y hospedador intermediario de parásitos?, ¿Las muestras de materia fecal y moco de CGA, presentan protozoos y helmintos de importancia sanitaria? ¿La población de la Provincia de Misiones conoce los riesgos del CGA? ¿Puede diferenciarlo de un caracol nativo? 22 �3. OBJETIVOS ______________________________________________________________ Con el fin de conocer y contribuir al estado actual del caracol gigante africano, Lissachatina fúlica, en el transcurso de la presente tesis se plantearon los siguientes objetivos generales y específicos. 3.1. Objetivo general Evaluar la epidemiologia actual del caracol gigante africano y sus implicancias en la salud pública y ambiental de la provincia de Misiones, Argentina. 3.2. Objetivos específicos 1. Realizar un relevamiento de situación del caracol gigante africano en la provincia de Misiones, Argentina. 2. Colectar y realizar la identificación morfológica de tallas de las conchillas de caracoles gigantes africanos de Puerto Iguazú, Misiones, Argentina. 3. Buscar e identificar la presencia de parásitos de interés sanitario en secreciones y material de desecho de caracoles gigantes africanos. 4. Evaluar el grado de conocimiento y riesgos potenciales de la población de Misiones respecto al caracol Gigante Africano. 3.3 Alcance En la localidad de Puerto Iguazú, provincia de Misiones, Argentina el objetivo fue analizar morfológicamente y parasitológicamente los Caracoles Gigantes Africanos en el período de Diciembre 2018/Diciembre2019. Realizando además en el año 2019, una encuesta Epidemiológica en un total de once localidades de la provincia de Misiones. 23 �3.4. Hipótesis La presente tesis por optar por un diseño descriptivo- exploratorio carece de hipótesis inicial. No obstante al tener una connotación pronostica se plantea las siguientes hipótesis predictivas: 1). Con el conocimiento documentado, de que poblaciones humanas y animales de Misiones presentan parásitos zoonóticos de importancia sanitaria y por los hábitos de alimentación del Caracol Gigante Africano, nos planteamos si en Puerto Iguazú el respectivo molusco, Lissachatina Fulica, podría actuar como transportador mecánico de especies parasitas (con énfasis en helmintos) de interés sanitario. 2). El grado de conocimiento de la población inciden en la dispersión. 4. ESTADO ACTUAL DEL TEMA Valente (2017) en su Tesis Doctoral, evaluó la distribución, dispersión y parasitofauna del CGA, Lissachatina fulica en la ciudad de Puerto Iguazú, Misiones, y de las babosas nativas Phyllocaulis variegatus y Latipes erinaceus (Veronicellidae), con el fin de determinar su rol en la transmisión de helmintos parásitos, con especial énfasis en los nematodes Metastrongylidae. Realizando el muestreo principalmente en el área urbana durante los años 2013 – 2015. Concluyendo que la distribución espacial de L. fúlica en la ciudad de Puerto Iguazú, desde su introducción (2010) hasta la culminación de su estudio se incrementó, encontrándose durante este estudio nuevas áreas de focos, distantes 3 km del área foco inicial. Atribuyendo la dispersión entre otras causas a la influencia antrópica. Por análisis de mapas predictivos de distribución de nicho ecológico, Valente (2017) predice que L. fúlica en el 2050 se localizará por debajo de la línea del Ecuador, dispersándose a nuevas áreas que en la actualidad no poseen las características ambientales para su desarrollo. En relación a los parásitos, hallaron tres especies de helmintos parásitos en los hospedadores 24 �analizados: Brachylaima sp. (Digenea: Brachylaimidae), Strongyluris sp. (Nematoda: Heterakidae) y Aleurostrongylus abstrusus (Nematoda: Angiostrongylidae). En este trabajo, Valente sugiere que se continúe con el monitoreo del CGA y su parasitofauna, teniendo en cuenta la cercanía a zonas fronterizas con registros de Angiostrongyliasis. En otros trabajos desprendidos de su Tesis Doctoral, Valente y col., (2016, 2017) manifiestan que el tamaño de la concha se correlaciona con la prevalencia parasitaria, la intensidad media y abundancia media, indicando la existencia de una infestación constante en lugar de una accidental. Por otro lado, la ausencia de infección en el tamaño de concha más pequeño sugiere un umbral de tamaño a ser infectado. Todos los caracoles infectados pertenecían a la ciudad de Puerto Iguazú. Teniendo en cuenta las características morfológicas de las larvas encontradas en los citados estudios, Valente y col., concluyen que teniendo en cuenta que existen registros de CGA infectados por nematodos de importancia médica y veterinaria como Angiostrongylus y Aelurostrongylus en algunos Estados brasileños cercanos a Puerto Iguazú, enfatizan nuevamente en la necesidad de vigilancia epidemiológica de los caracoles gigantes africanos. En otra publicación Valente y col., (2018) integran y muestran la distribución actual de las especies de Angiostrongylus spp. En las Américas versus informes de enfermedades”. En el mismo concluyen que en Argentina, A. costaricensis se registró solo en una especie de roedor (A. montensis) en la provincia de Misiones, mientras que se notificó un caso humano único de enfermedad en la provincia de Tucumán (Demo & Pessat, 1986). Las características de los ambientes y las condiciones climáticas de ambos sitios geográficos son muy diferentes y la distancia cronológica entre estos informes es de 30 años. Este tiempo excede los períodos observados en el resto de los registros de esta especie (0-24 años). La falta de informes sobre anfitriones accidentales y definitivos en Argentina es paradójica, especialmente considerando que no hay datos precisos sobre la procedencia del paciente en el único caso humano registrado. Sin embargo, varios casos humanos registrados en Brasil desde 1990 se encuentran a 500 km de la provincia de Misiones. Por lo tanto, el 25 �riesgo potencial aumenta teniendo en cuenta que los límites entre las poblaciones de humanos y animales salvajes en el bosque atlántico se están volviendo cada vez más difusos. En el Estado de Nigeria, Igbinosa, (2016) en su trabajo “Parasites of edible land snails in Edo State, Nigeria”, encontraron larvas en el CGA de Angiostrongylus cantonesis, Fasciola gigantica y Schistosoma mansoni. Concluyendo que los caracoles terrestres son fuentes de proteínas para el hombre y son anfitriones de varios parásitos. El consumo de caracoles podría ser una ruta a la infección humana particularmente cuando se come crudo o poco cocido. En Venezuela, Libora y col., (2010) informaron que el CGA tiene la capacidad de albergar al parasito trematode S. mansoni que causa la esquistosomiasis intestinal en el hombre. Ovidio y col., (2019) en un estudio realizado en el Sur de Italia evalúa la ocurrencia de nematodos en los CGA mantenidos como mascotas. Evaluando muestras fecales y moco de los moluscos encontraron presencia de nematodos Rabditis sp. Los Rhabditidae incluyen nematodos saprófitos de vida libre, que se encuentran ampliamente en el suelo y los desechos orgánicos donde se alimentan principalmente de bacterias. Muchas especies de caracoles pueden servir como hospedadores definitivos. Sin embargo, varias especies de Rhabditis y Rhabditella se han asociado con vertebrados, incluidos los humanos. Aunque su presencia puede ser el resultado de la contaminación ambiental, estos nematodos pueden causar enfermedades en muchos animales y humanos. Rhabditis elongata, Rh.Hominis y Rh. Usuii, se han aislado larvas de heces humanas, orina y torundas vaginales. Estos autores concluyen, que todos los CGA pueden presentan huevos, larvas y nematodos rabdítidos adultos en las heces y, por lo tanto, pueden representar una fuente de infección para otras mascotas y humanos. En Brasil, Silva y col., (2019) en un estudio realizado en el Estado de Aracaju, Sergipe para verificar la ocurrencia del CGA y los riesgos potenciales asociados con su 26 �presencia. Concluyeron que el CGA era más representativo en áreas urbanas, especialmente en lotes baldíos con presencia de basura y materiales en descomposición. En los moluscos examinados se encontraron nematodos género Rhabditis, pero no se encontraron parásitos del género Angiostrongylus. Identificaron una relación significativa entre la humedad – frecuencia y la positividad de los nematodos y una correlación entre factores climáticos y la frecuencia de CGA. También observaron que cuanto más grande es el molusco, mayores son las posibilidades de infección por nematodos. Penagos – Tabares y col. (2019), en su trabajo “Angiostrongylus vasorum y Aelurostrongylus abstrusus: Parásitos desatendidos y subestimados en América del Sur”. Concluye que: teniendo en cuenta la amplia distribución de angiostrongilosis canina y aelurostrongilosis felina en América del Sur, es de gran interés que los médicos de práctica de pequeños animales y de vida silvestre consideren estas infecciones y las especies menos comunes como C. vulpis, T. brevior, T. subrenatus, A. chabaudi, A. felineus y O. rostratus; como diagnóstico diferencial en el caso de trastornos cardiopulmonares. En este mismo estudio Penagos – Tabares y col., refieren que los estudios filogenéticos también están pendientes para evaluar si A. vasorum de América del Sur en realidad representa un genotipo o especie distinto. Se requieren encuestas epidemiológicas en cánidos y felinos domésticos y salvajes, así como en hospedadores paraténicos e intermedios con una caracterización molecular precisa. Además, el impacto de los factores climáticos (por ejemplo, altitud, temperatura, precipitación anual, humedad relativa y región biogeográfica) en las interacciones huésped-parásito y parásito-huésped intermedio y la propagación de estos parásitos a regiones no endémicas son temas relevantes a considerar en futuras investigaciones en una de las regiones con mayor biodiversidad del planeta. 27 �5. MARCO METODOLÓGICO La investigación contó con la autorización por parte del SENASA, Regional CORMIS, Argentina. 5.1 Área de estudio 5.1.1. Características de la Provincia de Misiones La Provincia de Misiones con una superficie de 29.801 kilómetros cuadrados se localiza en el sector sudoccidental de la Gran Cuenca Sedimentaria del Paraná, ubicada entre los paralelos 25º 28´ y 28º 10´de Latitud Sur y los meridianos 53º 38´y 56º 03´de Longitud Oeste en la Región Nordeste de la República Argentina. El perímetro misionero, de 1.200 Km de longitud, ofrece 1.080 Km como fronteras internacionales: unos 330 km sobre el Río Paraná con Paraguay y unos 750 Km sobre los ríos Uruguay, Pepirí Guazú, San Antonio e Iguazú con Brasil. Una pequeña porción de 110 km de su territorio al sur es limítrofe con la Provincia de Corrientes (Instituto Geográfico Militar). Se encuentra organizada políticamente en 17 departamentos, divididos en 75 municipios. 28 �Figura 3: División política. Provincia de Misiones, Argentina (Fuente: Margalot J. A. Geografía de Misiones. 6 ed. Buenos Aires, 1994.) Ambiente, regiones naturales Desde el punto de vista fitogeográfico, Misiones se ubica en el Dominio Amazónico. Se caracteriza por un clima subtropical húmedo, con suelos lateriticos, con alto contenido de óxido de hierro y aluminio, materia orgánica y bajo tenor de sales solubles expresado en cloruros y sulfatos y reacción ácida. El total de lluvias anuales varía de 1000 a 2200 mm por año, y la temperatura media anual es de 16 – 20° C. El 35% de su territorio está ocupado por Selva Misionera o Selva Paranaense que cubre en la actualidad la zona central y norte de la provincia de Misiones, esta área posee una oferta de ecosistemas sumamente variada (Ministerio del Interior, 2010). La mayor parte de esta selva remanente yace dentro de lo que se denomina Corredor Verde, un área de conservación y uso sustentable de más de 1.100.000 hectáreas, creada mediante una ley provincial 3631 (García Fernández, 2002; Cinto & Bertolini, 2003) para evitar la fragmentación de la selva. La Provincia cuenta con 84 áreas protegidas, de las cuales 23 corresponden a la Selva misionera. 29 �Las áreas seleccionadas para el presente estudio corresponden: a la ciudad de Puerto Iguazú (25º36’S,54º35’O) para la etapa 1º del estudio. La misma se encuentra ubicada en la provincia de Misiones (Argentina) ocupando el punto extremo al noroeste de la Provincia en el cruce de fronteras con Paraguay y Brasil. Se halla rodeada por dos grandes ríos, el Paraná al oeste y el Iguazú al norte (Figura 4). Para la etapa 2º se seleccionaron ubicadas de Norte a Sur de la provincia. Figura 4: Imagen satelital de la ciudad de Puerto Iguazú, Misiones, 5.2. Universo Argentina El universo del presente estudio los constituyen los CGA obtenidos de la ciudad de Puerto Iguazú y la población humana de diferentes departamentos de la provincia de Misiones, como también el ambiente. 5.3. Diseño metodológico del estudio El diseño metodológico seguido fue de tipo exploratorio-descriptivo- observacional. 30 �5.4. Diseño muestral El diseño se basó principalmente en un diseño de campo de corte transversal con enfoque cualitativo – cuantitativo y una estrategia de muestreo intencional y de conveniencia. 5.5 Período de estudio El período bajo estudio fue entre diciembre 2018 a diciembre de 2019. 5.6 Criterios de inclusión / Criterios de exclusión Criterios de inclusión: - Se incluyeron para el muestreo moluscos que pertenecieran a la especie Lissachatina Fulica y sus materias fecales de la localidad de Puerto Iguazú. - Se incluyeron para las encuestas epidemiológicas: Localidades fronterizas de la provincia de Misiones. Criterio de exclusión: - Se excluyeron especies de moluscos nativos y sus excreciones. - Se excluyeron localidades sin pasos fronterizos con la República del Paraguay o con la República Federativa del Brasil. 5.7. Recopilación y análisis de la información Para la recopilación y análisis de información primaria, se realizaron colectas de moluscos, encuestas entrevistas y observaciones en terreno para relevar información sobre el CGA. Se realizó una búsqueda sistemática de literatura publicada sobre estudios de L. fulica en el mundo y a nivel regional y provincial: Biblioteca Virtual de Salud (BVS), 31 �Scientific Electronic Library Online (SCieLO), Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal (REDALyC) y Google Académico. Con el fin de complementar la identificación de los factores que influyen o podrían influir en la aparición o persistencia del CGA en Misiones se recolectaron los siguientes datos secundarios con sus respectivos indicadores: - Demográficos: Se obtuvieron por consulta de los datos de los Censos de Población y Viviendas. Al momento de redactar este manuscrito se actualizó con el último censo 2010. - Geográficos: Se recolectaron aquellos correspondientes a hidrografía, regionalización y topografía. Se utilizó información disponible en Bibliotecas regionales e Institutos Geográficos. - Edafológicos: Se estudió la cartografía y la composición de suelos a través de búsquedas en Bibliotecas de las Secretarías de Minería. - Agropecuarios: Se recurrió al Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) y al Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). - Ambientales y Ecológicos: características del lugar, temperatura, clima, humedad relativa, ecosistema de la Provincia de Misiones. 5.7.1. TRABAJO DE CAMPO Las colectas de moluscos en la ciudad de Puerto Iguazú así como, las encuestas y observaciones, fueron realizadas en su totalidad por el investigador y personal de SENASA. 5.7.1.1. Recolección de moluscos. La colecta de caracoles bajo estudio, se llevó a cabo por el método de captura por remoción (Valente 2017) mediante colecta manual, ayudados por elementos de jardinería tales como rastrillos y palas. 32 �El cronograma de colectas del CGA, se estableció por criterios locales, climáticos y por accesibilidad geográfica. Los muestreos se realizaron durante los meses de enero a abril del año en estudio. Tanto la colecta, traslado y procesamiento de los mismos se realizaron bajo Normas de Bioseguridad establecidas por organismos competentes. Los ejemplares colectados de diferentes espacios que correspondieron a viviendas, suelo, paredes, vegetación, arbustos, hojarasca, rocas y troncos caídos fueron colocados en recipientes de plástico secos con tapa perforadas al cual se le agrego papel higiénico húmedo induciéndolos a entrar en un estado de estivación. Cada recipiente fue debidamente codificado según lugar de recolección y trasladados por personal de SENASA al laboratorio de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNNE, Corrientes y la Facultad de Veterinaria de la Universidad del Salvador, Sede Gobernador Virasoro, Corrientes para ser procesados. Se colectaron un total de 201 ejemplares de moluscos. Figura 5: Colecta de moluscos en la Ciudad de Puerto Iguazú, Misiones, Argentina. 33 �5.7.1.2. Encuestas a la población. Para tener una aproximación del grado de conocimiento del CGA en la provincia, se trabajó con fuentes primarias de información (encuestas de tipo epidemiológicas) dirigidas a la población de 11 (once) localidades de la provincia de Misiones, entre los meses de Mayo y septiembre de 2019. El diseño del cuestionario estuvo constituido por 12 preguntas de tipo dicotómicas y de respuestas múltiples (Ver ANEXO V). En la Figura 5, se muestra el mapa de Misiones indicando las zonas evaluadas con y sin declaración Oficial de presencia de CGA. Se incluyeron además entrevistas verbales con apoyo de documentación fotográfica y muestras de especímenes que permitieron reconocer la presencia del CGA por parte de la población. Total de encuestas realizadas: 92 (noventa y dos) encuestas. A todos los encuestados se les entregaron folleto informativo. (Guía de reconocimiento en campo) sobre el CGA, cómo reconocerlos, diferencias con caracoles nativos y recomendaciones por parte del SENASA (Ver ANEXO VI a y b), a fin de sensibilizar y contribuir a la prevención del mismo. 34 �Figura 6: Mapa de la Provincia de Misiones indicando zonas evaluadas por encuestas epidemiológicas. 5.7.2. TRABAJO DE LABORATORIO 5.7.2.1. Estudios macroscópicos - morfológicos de los moluscos En el laboratorio los caracoles colectados fueron sometidos a la técnica de preservación, relajamiento y muerte con cristales de mentol, en el cual permanecieron entre 12 a 15 hs. Una vez transcurrido ese tiempo, se cambió el agua por formol al 10% para su fijación y ser posteriormente examinados, medidos y agrupados según se muestra a continuación: 35 �A. Agrupamiento por género y especie B. Clasificación en Clase según categoría de tamaños: Clase I: individuos recién eclosionados (hasta 10 mm) Clase II: juveniles (10 a 40mm) Clase III: adultos jóvenes (40 a 70 mm) Clase IV: adultos (> 70 mm) Figura 7: Identificación morfológica de los moluscos, estableciendo largo, ancho y alto. 5.7.2.2. Estudios parasitológicos Para la búsqueda de parásitos en: - Materia Fecal: Primeramente se realizó el procesamiento por pool de muestras, por cada grupo conformado. Se realizó la observación de parásitos en la materia fecal siguiendo el esquema propuesto: a). Observación Macroscópica: directa ayudados con una lupa, con el objeto de observar parásitos adultos. b). Observación Microscópica: previo procesamiento con técnicas ya descriptas, para Nematodos, protozoarios y cestodes de la flia. Anoplocephalidae, mediante flotación, (método de Willis y Sheather) y sedimentación (método de Teleman). 36 �- Baba: Se realizaron estudios en fresco entre porta y cubre objetos y además se concentraron las muestras mediante centrifugación y realizando el examen directo del sedimento según técnicas descriptas por otros autores. Durante el manejo de ambas muestras, en toda instancia se respetaron las normas de bioseguridad. Las observaciones se realizaron haciendo uso de dos microscopios con biocular micrométrico (Olimpus®, modelo CHS y Carl Zeiss). Para la identificación taxonómica de géneros y/o especies (protozoos y helmintos) se usaron criterios morfológicos (forma, cubierta, color, contenido) y métricos (longitud y diámetro) descriptos previamente (Acha et al 1986; Soulsby E., 1987; Bowman et al 2004; Manuales del Dto Parasitologia Malbran). Los resultados de las lecturas microscópicas fueron registrados en un formulario al final del cuestionario que contemplaba el código de cada colecta de moluscos. Finalizado el trabajo, todos los ejemplares fueron eliminados siguiendo las recomendaciones establecidas por el SENASA, que consiste en colocar los caracoles durante un tiempo mínimo de 4 horas en un recipiente con 3lts. de agua y 1kg de sal común. Al finalizar, fueron enterrados con cal a una profundidad mínima de 50 cm. 5.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos fueron cargados y procesados en los programas Microsoft Excel 2007, Acess 2007. Se utilizó la prueba estadística chi cuadrado y comparación de proporciones, trabajando con un nivel de confianza del 95% y una precisión del 5 %, utilizándose para su procesamiento el programa estadístico InfoStat® para la correlación de las variables y gráficos. 37 �6. RESULTADOS 6.1. ESTUDIO DE SITUACIÓN. PROVINCIA DE MISIONES. Los datos presentados a continuación, son conducentes para un análisis conjunto de información y el conocimiento respecto al CGA en la provincia de Misiones. Indicadores demográficos, gasto público, de recursos: su impacto. Demográficos Según los datos del censo de 2010 la provincia tiene 1.101.593 habitantes y una densidad poblacional de 37,0 hab/km2. Esto representa al 2,7% de la población nacional, y convierte a Misiones en la novena provincia más poblada, por delante de Chaco y por detrás de Salta. En referencia a la población por sexo, los varones representan 547.335 en la totalidad del mapa provincial (49.9%), mientras que las mujeres alcanzan el número de 554.158 personas (50.3%). Respecto al censo anterior, de 2001, la población creció un 14,1 %. Por otra parte, en el censo de 2010 el crecimiento demográfico sigue aglutinado en el sector urbano con una población de 812.554 habitantes, respecto a la población rural con 288.939 habitantes, representando el 26.2 % de la población. Del total de los pobladores rurales, el 81,2 % vive en zonas consideradas "dispersas" (parajes y picadas). Por otra parte, 33 son las jurisdicciones municipales de la provincia que cuentan con una población totalmente rural. Población de pueblos originarios: El porcentaje de la población que se autoreconoce como indígena o con algún antepasado perteneciente a algún pueblo originario (Mbya Guarani) es del 1,1 % (13.006 38 �personas). Un 49.97 % del total, viven en zonas rurales (Corredor verde Ecológico 23 %, predios privados 19 % y reservas ecológicas 4 %). Dentro de las estadísticas vitales de la población Mbya Guaraní, para el año 2010 se observó una tasa de natalidad por 1000 habitantes de 23,1 %; registro inferior al año 2004 (26,1 %). Población extranjera residente en Misiones Se estimó según Censo 2010, un total de 44.012 extranjeros residentes en la provincia: 20.870 varones y 23.142 mujeres. Los inmigrantes que más suman en las estadísticas son los oriundos de países limítrofes (40.660 personas): paraguayos, con 26.799 habitantes; brasileros, 13.000 personas. Los europeos, 2.063, en su mayoría españoles y alemanes. Por su parte, la comunidad asiática en Misiones alcanzó la cifra de 492 residentes; africanos 16 personas y los oriundos de Oceanía, 85. Viviendas y hogares El total de viviendas a nivel provincial es de 330.631, en tanto que el total de hogares es de 302.953. Del total de viviendas, 290.263 están habitadas, 39.786 se encuentran deshabitadas y las 582 restantes pertenecen a la categoría de viviendas colectivas. Del total de hogares en la provincia, 217.858 (71.9%) cuentan con provisión de agua mediante el suministro de la red pública. Analfabetismo Se observó una disminución del analfabetismo, pasando del 6,2% en el 2001 al 4,1% en el 2010. A nivel país, el índice de personas que no saben leer ni escribir disminuyó considerablemente, pasando del 2,6% en 2001, al 1,9% en 2010. 39 �Gasto público por finalidad y función El principal componente del gasto público de la provincia es la categoría Servicios Sociales, que insume el 49,5% del total. Dentro de este grupo se destaca Educación y Cultura, que insume el 29,2% del gasto total de la provincia de Misiones. Vivienda y urbanismo agrupa a otro 9,4%, y Salud a un 7,8%. La categoría Servicios económicos representó un 23,6% del gasto, mientras que Administración Gubernamental implicó otro 19,5%. Los servicios de seguridad insumieron un 5,2% del gasto provincial, y los servicios de la Deuda otro 2,3%. Indicadores de recursos y utilización de servicio de salud La provincia cuenta con 617 establecimientos, de los cuales 372 pertenecen al sector público. Entre los mismos, encontramos Postas, Unidades, y Puestos Sanitarios, Consultorios periféricos, consultorios externos y Hospitales. Población canina Para un total de 1.097.829 habitantes, se estiman 548.914 perros a nivel provincial (Programa Provincial Control de Enfermedades Zoonóticas, Ministerio Salud Publica de Misiones, 2013), con una relación de 1 perro cada 2 habitantes (Relación Mundial: 1/3 habitantes). Explotaciones agropecuarias (EAP): Según el Censo Nacional Agropecuario, 2018, la provincia de Misiones cuenta con 22.169 EAP, presentando casi el doble de unidades productivas que Chaco y Corrientes, y tres veces más que Formosa. 40 �6.2. ANÁLISIS MORFOLÓGICO DE LOS MOLUSCOS De los 201 moluscos analizados se identificaron 199 moluscos del género y especie L. fulica (tabla 1) en la ciudad de Puerto Iguazú, Misiones. Teniendo en cuenta el tamaño de los moluscos del Grupo I, en la tabla 2 se presenta la clasificación por clase de L. fulica colectados. Observándose que el mayor número presentan las formas juveniles (Clase II) con un rango de 10 a 40 mm, seguidas por formas juveniles (Clase III). Tabla 1. Identificación por grupo según género y especie de molusco evaluado. Pto. Iguazú, Misiones, Argentina. Género y especie de molusco Lissachatina fulica Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 199 Helix aspera 1 Bulimus spp. 1 Tabla 2. Clasificación por Clase según categoría de tamaños de moluscos del Grupo 1 evaluados. Puerto Iguazú, Misiones, Argentina. Clase I Grupo 1 6 Clase II 149 Clase III 35 Clase IV 9 6.3. ESTUDIOS PARASITOLÓGICOS Del análisis parasitológico efectuado a los pooles de materia fecal de L. fulica, se encontraron taxones parasitarios correspondientes a géneros del Phylum Nemata y del Phylum Protozoa (Figura 8). 41 �Entre la clase Secernentea predominaron larvas del orden Strongylida y larvas de vida libre sin especificar, como también se observaron huevos de nematodes del genero Ancylostoma spp. (60 µm x 40 µm). Los protozoos observados correspondieron a quistes de Ameba spp.; Giardia spp. y de la Clase Aplicomplexa a ooquistes de Cystoisospora spp. Por su parte en el análisis de baba de 9 ejemplares adultos de L. fulicas se encontraron taxones parasitarios de la Clase Nematoda Orden Strongylida: larvas de nematodes sin especificar (4/9) y del Orden Ascaridea Familia Toxocaridae: huevos de ascarideos (1/9) compatibles con el genero Toxocara spp. La relación entre zonas de muestreo y taxones parasitarios, no presentaron diferencias significativas (p>0,05). En 4 de 9 muestras de baba se observaron cristales de oxalato de calcio. Figura 8. Taxones parasitarios encontrados en Materia fecal y baba de CGA. Parte superior: larvas de Strongylida y de vida libre. Parte inferior: huevos de Ancylostoma spp, quiste de Giardia spp, oquiste de coccideo. 42 �6.4. EVALUACIONES CUALITATIVAS. Conocimiento del Caracol Gigante Africano (L. fulica) por parte de la población de Misiones. En la tabla 3 se muestra la distribución por localidades de las 92 personas encuestadas y el grado de conocimiento acerca del CGA. Observándose un 67.4 % de desconocimiento sobre la problemática (Gráfico 1). El promedio de edad de los encuestados fue de 43 años (86 – 21). Tabla 3. Conocimiento del Caracol Gigante Africano por parte de la población. Provincia de Misiones, Argentina. N° Escucharon Localidades Lo vieron Encuestados hablar 9 4 0 Corpus Montecarlo 12 0 0 Eldorado 10 2 1 Wanda 9 5 2 Pto. Iguazú 10 6 9 Andresito 5 3 0 San Antonio 8 1 1 B. de Iigoyen 9 5 3 El Soberbio 5 2 0 Alba Posse 10 2 0 San Javier 5 0 0 TOTAL 92 30 16 43 �Escuchó hablar del caracol? 0,7 0,7 0,6 0,6 0,5 0,5 0,4 0,4 0,3 0,3 Sí escuchó No escuchó Gráfico n° 1. Porcentajes de la población encuestada que escucharon o no escucharon hablar sobre el Caracol Gigante Africano. Respecto a la variable haber visto el CGA, solo un 17.4% de estos lo vieron en sus viviendas, patios, paredes, huertas o en las proximidades de las mismas (Gráfico nº 2), ocurriendo un 31.2% de estas observaciones en épocas de verano, un 18.7% en primavera y un 12.5% finales de verano e inicio de otoño. Por otra parte, de las personas que vieron el CGA en sus huertas 2 refirieron haberlos visto alimentándose de verduras de hojas. De esta variable un 0.03 % de los encuestados no respondieron a la pregunta. La correlación entre las personas que escucharon y los que vieron al caracol, fue estadísticamente significativa (p<0,0001). Por otra parte, con una alta significancia estadística (p<0,0002) se correlacionaron negativamente los datos entre los que escucharon y los que no vieron al caracol. 44 �Vió los caracoles? 0,8 0,8 0,7 0,6 0,6 0,5 0,4 0,3 0,3 0,2 0,1 Sí lo vió No lo vió Gráfico 2. Porcentajes de la población encuestada que vio al Caracol Gigante Africano. De las encuestas realizadas, también se desprende que el 61.9% de los encuestados presentan menores de 15 años en sus familias, con un promedio de 2 hijos por matrimonio, de los cuales el 45% andan descalzos en sus domicilios. En relación a la tenencia de mascotas, un 59.7% presenta mascotas en sus domicilios, perros (57.6%) y gatos (18.4%), con un promedio de 2 perros y 4 gatos por familia. Por otra parte, se resalta que un 18,4%, refirió ver ratas en su domicilio o peri domicilio. En cuanto al modo de eliminar al CGA de sus viviendas, solo un 4.34% (4/92) refirieron eliminarlos con sal o sal y fuego. 45 �7. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES El CGA, es una de las especies invasoras más agresivas para la agricultura y la diversidad biológica a escala mundial. En Salud Publica, es catalogado de interés por actuar como vector y dispersor de diferentes especies de microorganismos entre ellos parásitos zoonóticos, de alta implicancia para la salud humana y animal. En la ciudad de Puerto Iguazú, entre otras localidades de la provincia de Misiones y de regiones vecinas, el panorama del CGA presenta una alta probabilidad de acrecentarse debido a su alta tasa de dispersión asociado a variables antrópicas. Algunas de las causas atribuibles por la cual se produjeron nuevos y múltiples focos en diferentes zonas de Puerto Iguazú, pueden estar relacionadas con los movimientos de suelo. Por el traslado de tierra para cubrir calles empedradas de distintos barrios, como también, se puede explicar la aparición del molusco en barrios aledaños al basural del municipio, ya que la gente al juntar a los CGA los desecha a la basura sin su correcta eliminación previa (por ej. por deshidratación con sal). En concordancia con Valente (2017), en el presente estudio se encontraron nuevas áreas de focos, distantes a 52 km de la localidad registrada inicialmente en 2010. Al igual que otros autores, se constató que sitios baldíos y basurales de zonas urbanas y periurbanas, son los lugares de mayor presencia de moluscos por metro cuadrado (Silva y col., 2019). Respecto a la presencia de parásitos en el CGA, en concordancia con los trabajos de (Valente et. al., 2016, 2017; Silva et. al., 2019), se observó que la carga parasitaria de los moluscos es directamente proporcional al tamaño, encontrándose en este estudio taxones parasitarios del orden Ascaridea y Strongylida, en los CGA en estado adulto joven y adulto. Aún, no habiéndose encontrado parásitos del género Angiostrongylus en estos especímenes, los CGA de mayor tamaño presentan un mayor riesgo epidemiológico al ser mayor su 46 �longevidad y oportunidad de contacto con ambientes contaminados con formas parasitarias eliminadas por heces de animales parasitados. Las variables climáticas son capaces de afectar prevalencias, intensidades y distribución geográfica, tanto directamente, influenciando sobre los estadios de vida libre, como indirectamente sobre los hospedadores/vectores (Mas-Coma et. al., 2009). Misiones, presenta todas las condiciones topográficas y climáticas para la persistencia de formas parasitarias y los hospederos o vectores adecuados para diseminarlas. En este trabajo queda demostrado que la baba de A. fulica utilizada para su locomoción y desplazamiento, también puede actuar por arrastre como dispersora de formas infectantes de parásitos zoonóticos, como ser huevos del genero Toxocara, hallados en el presente estudio y de importancia en la salud pública por el daño que ocasionan en el ser humano (Vizcaychipi et. al., 2006; 2014; 2016). Por otra parte, los hallazgos realizados por Igbinosa, (2016), en el Estado de Nigeria, África occidental y por Libora (2009) en Venezuela, demuestran la importancia de mantener una vigilancia epidemiológica constante respecto a los posibles cambios evolutivos entre parásitos y hospedadores, como por ejemplo: los trematodos de importancia sanitaria (médica y veterinaria) encontrados en los CGA. Los Trematodos Digénidos siguen un ciclo heteroxeno con un molusco como primer hospedador intermediario, comúnmente un gaterópodo terrestre o acuático. La Fasciola gigantica (parasito exótico) presente en Africa, Oriente Medio, Asia y Europa Oriental, comparte características biológicas idénticas con la Fasciola hepática, presente en nuestro país. Este último es causante de la distomatosis hepática, una zoonosis de importancia epidemiológica en la región Noreste de Argentina (Lobayan et. al., 2016). Por otra parte, el Schistosoma mansoni causante de la esquistosomiasis, enfermedad no reportada y en estado de vigilancia en la misma región, por presencia del vector gaterópodo. Si bien L. fúlica no es un molusco acuático o que comparte características biológicas con moluscos de los géneros Limnea spp o Biomphalaria spp, el 47 �sólo hecho de haber sido hallado trematodos en el CGA, amerita cautela y atención para futuras investigaciones. Otro trematodo exótico a nuestra región es el Dicrocelium, causante de la dicroceliosis, enfermedad de interés sanitario (médico y veterinario), más raro en humanos y con hospedadores intermediarios (moluscos), del género Helicella spp y Zebrina spp. Si bien son exóticos, comparten una característica con L. fúlica que es la coprofagia, necesaria para completar el ciclo biológico de la dicroceliosis, entre otras enfermedades parasitarias. Muchas de las enfermedades que hoy son endémicas, hasta hace poco eran exóticas. La posibilidad de que el CGA sea susceptible a estos trematodos, actuando como liberador de cercarias, sólo dependerá de su comportamiento evolutivo en el tiempo y del ciclo en constante dinamismo de las cadenas epidemiológicas y su relación huésped, agente y ambiente, resultando en constantes enfermedades emergentes y remergentes. En coincidencia con otros autores (Valente et. al., 2017,2018; Barratt & Ellis, 2019), se considera necesario continuar con el monitoreo y los estudios de parasitofauna en el CGA teniendo en cuenta factores epidemiológicos asociados, cercanía a zonas fronterizas con registros de Angiostrongyliasis entre otros parásitos zoonóticos de interés sanitario, así como también la presencia y valoración de la fauna animal representada principalmente por canidos, félidos y roedores. De las encuestas realizadas, se pudo constatar el escaso conocimiento de la población sobre el CGA, inclusive dentro de las áreas más afectadas. De la misma manera, se constató un insuficiente accionar por parte de las autoridades de los municipios en lo que respecta a educación sanitarias, prevención y control de la plaga; además se observó la necesidad de mayor coordinación conjunta y de accionar continuo entre los organismos municipales, provinciales y nacionales. 48 �8. COMENTARIO FINAL El desconocimiento tanto de las posibles implicancias sanitarias, ambientales o económicas de una plaga, como también, de los eslabones de la cadena epidemiológica, necesarias para el desenlace de una enfermedad, nos llevan a la imposibilidad de actuar en pos de la prevención, ya sea, del desarrollo de una enfermedad o para contrarrestar el avance del Caracol Gigante Africano y con mayor razón, si tiene como principal variable de expansión o saltos de dispersión a la actividad humana. De tal modo que resulta necesario afianzar en la educación y participación ciudadana como medidas preventivas para controlar esta especie invasora. Así mismo, se indican como medidas preventivas gubernamentales, el aprovechamiento de instrumentos legales existentes, y por sobre todo aprender a trabajar de forma integral y multisectorial entre todas las partes involucradas para su correcta vigilancia y control. 49 �9. 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Ciudad de La Habana: Instituto Pedro Kourí; pp: 23-48. 57 �ANEXO I a 58 �ANEXO I b 59 �ANEXO II 60 �ANEXO III 61 �ANEXO IV 62 �ANEXO V 63 �ANEXO VI a 64 �ANEXO VI b 65 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Trabajos, Tesis, Tesinas Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Análisis parasitológico de importancia sanitaria en los caracoles gigantes africanos (Lissachatina fulica) en Misiones Creator An entity primarily responsible for making the resource Reinante, Emiliano Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2019 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Teibler, Pamela (Directora de Tesis); Alvarez, Darío y Vizcaychipi, Katherina A. (Co-Directores) Rights Information about rights held in and over the resource Trabajo presentado para obtención del titulo Magíster en investigación en Ciencias de la Salud otorgado por la Universidad Nacional del Nordeste Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Tesis Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0178 Abstract A summary of the resource. El presente trabajo realiza una evaluación de la situación epidemiológica y parasitaria del caracol L. fulica y sus implicancias en la salud pública de Misiones, Argentina, a fin de conocer y contribuir al estado actual de la citada especie. https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/28e442bf6c02772dd59bf371d0222253.pdf bf981306afed0ed814ba1e27e6a2bcd1 PDF Text Text República Argentina - Poder Ejecutivo Nacional AÑO DE LA DEFENSA DE LA VIDA, LA LIBERTAD Y LA PROPIEDAD Resolución Número: RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA CIUDAD DE BUENOS AIRES Miércoles 24 de Abril de 2024 Referencia: EX-2024-37399153- -APN-DGTYA#SENASA - REGISTRO NACIONAL DE FERTILIZANTES, ENMIENDAS, SUSTRATOS, ACONDICIONADORES, PROTECTORES Y MATERIAS PRIMAS VISTO el Expediente N° EX-2024-37399153- -APN-DGTYA#SENASA; las Leyes Nros. 20.466 y 27.233; los Decretos Reglamentarios Nros. 4.830 del 23 de mayo de 1973, su modificatorio 1624 del 8 de agosto de 1980, y DECTO-2019-776-APN-PTE del 19 de noviembre de 2019; las Resoluciones Nros. 338 del 23 de junio de 1995 de la ex-SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA, 264 del 9 de mayo de 2011, RESOL2019-75-APN-PRES#SENASA del 29 de enero de 2019, RESOL-2022-802-APN-PRES#SENASA del 9 de diciembre de 2022 y RESOL-2023-1004-APN-PRES#SENASA del 12 de octubre de 2023, todas del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, y CONSIDERANDO: Que por la Ley N° 20.466 se establece la norma que regirá el contralor de la elaboración, importación, exportación, tenencia, fraccionamiento, distribución y venta de fertilizantes y enmiendas, en todo el territorio de la REPÚBLICA ARGENTINA. Que el Decreto N° 4.830 del 23 de mayo de 1973, reglamentario de la referida Ley N° 20.466 dispone que el entonces MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERÍA será el órgano de aplicación de la citada norma, así como que los fertilizantes y enmiendas que se elaboren, fraccionen, vendan, importen o exporten, estarán sujetos al requisito de la certificación de aptitud para su empleo como tales, registro y control de calidad, a cargo de los servicios técnicos del mencionado ex-Ministerio, conforme lo establezca la reglamentación que el organismo dicte. Que mediante la Ley N° 27.233 se declara de interés nacional la sanidad de los animales y los vegetales, así como la prevención, el control y la erradicación de las enfermedades y de las plagas que afecten la producción silvoagropecuaria nacional, la flora y la fauna, la calidad de las materias primas producto de las actividades silvoagrícolas, ganaderas y de la pesca, así como también la producción, inocuidad y calidad de los agroalimentos, los insumos agropecuarios específicos y el control de los residuos químicos y contaminantes químicos y �microbiológicos en los alimentos y el comercio nacional e internacional de dichos productos y subproductos, siendo el SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA (SENASA) la autoridad de aplicación y el encargado de planificar, ejecutar y controlar el desarrollo de las acciones previstas en la mencionada ley. Que, asimismo, establece la responsabilidad primaria e ineludible de toda persona física o jurídica vinculada a la producción, obtención o industrialización de productos, subproductos y derivados de origen silvo-agropecuario, cuya actividad se encuentre sujeta al contralor del SENASA, el velar y responder por la sanidad, inocuidad, higiene y calidad de su producción, de conformidad con la normativa vigente y la que en el futuro se establezca. Que por la Resolución N° 264 del 9 de mayo de 2011 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA se aprueba el “REGLAMENTO PARA EL REGISTRO DE FERTILIZANTES, ENMIENDAS, SUSTRATOS, ACONDICIONADORES, PROTECTORES Y MATERIAS PRIMAS EN LA REPÚBLICA ARGENTINA”. Que a través de la Resolución N° RESOL-2023-1004-APN-PRES#SENASA del 12 de octubre de 2023 del citado Servicio Nacional se aprueba el procedimiento para el registro de bioinsumos en los Registros Nacionales de Terapéutica Vegetal, creado por el Decreto N° 5.769 del 12 de mayo de 1959, y de Fertilizantes, Enmiendas, Sustratos, Acondicionadores, Protectores y Materias Primas, instituido por la aludida Ley N° 20.466, para quienes se encuentren interesados en elaborar, importar, exportar, tener, fraccionar, distribuir y/o vender bioinsumos. Que resulta de fundamental importancia para este Servicio Nacional asegurar la protección del ambiente y la salud humana y animal, así como verificar la correcta comunicación de la eficacia de los productos registrados. Que la Dirección de Agroquímicos y Biológicos, dependiente de la Dirección Nacional de Protección Vegetal del mencionado Servicio Nacional, tiene entre sus acciones las de entender en el cumplimiento de las normas técnicoadministrativas referidas a la elaboración y/o formulación de productos fitosanitarios, fertilizantes y enmiendas utilizados para la producción agrícola y el control de plagas vegetales, inscribir, registrar y auditar los establecimientos que elaboren y/o formulen productos fitosanitarios, como así también proponer la inscripción de toda persona humana o jurídica u objeto a ser registrado en el ámbito de su competencia, y realizar la evaluación técnica de la documentación presentada para la aprobación y el registro de los principios activos y/o productos formulados, fertilizantes y enmiendas. Que, asimismo, la referida Dirección tiene a su cargo la administración del aludido Registro Nacional de Fertilizantes y Enmiendas. Que por las citadas Resoluciones Nros. 264/11 y 1004/23 se establecen las condiciones para la elaboración, importación, exportación, tenencia, fraccionamiento, distribución y venta de fertilizantes, enmiendas y productos biológicos en nuestro país, y, además, se determinan las características técnicas que deben cumplir los productos que se inscriben en el Registro Nacional de Fertilizantes, Enmiendas, Sustratos, Acondicionadores, Protectores y Materias Primas para su aprobación. Que atento a los avances en materia de disponibilidad de nuevos productos, condiciones, recomendaciones de uso y diversos aspectos tecnológicos y técnicos, resulta aconsejable la modificación de los requisitos y los procedimientos de inscripción ante el mencionado Registro Nacional, para su actualización, fortalecimiento y mayor eficiencia. Que, en el mismo sentido, es necesario simplificar, actualizar y adecuar los requisitos técnicos para el registro de �productos de uso agrícola destinados a la nutrición de cultivos. Que la Dirección Nacional de Protección Vegetal, y sus direcciones dependientes con competencia en la materia, han tomado la debida intervención. Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete. Que la presente medida se dicta de conformidad con las facultades conferidas por el Artículo 8°, inciso f), del Decreto N° 1.585 del 19 de diciembre de 1996 y sus modificatorios. Por ello, EL PRESIDENTE DEL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA RESUELVE: ARTÍCULO 1°.- Procedimiento de registro de fertilizantes, estimulantes, acondicionadores, enmiendas, sustratos, materias primas y bioinsumos. Se aprueba el procedimiento para el registro de productos en el Registro Nacional de Fertilizantes, Enmiendas, Acondicionadores, Sustratos, Protectores y Materias Primas, instituido por la Ley N° 20.466, para quienes se encuentren interesados en su elaboración, importación, exportación, tenencia, fraccionamiento, distribución y venta, de conformidad con lo establecido en la presente resolución. ARTÍCULO 2°.- Alcance. Se deben inscribir en el citado Registro Nacional, a cargo de la Dirección de Agroquímicos y Biológicos (DAyB) de la Dirección Nacional de Protección Vegetal (DNPV) del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA (SENASA): Inciso a) personas humanas o jurídicas que, para comercialización o uso propio, importen, exporten, distribuyan, elaboren y/o fraccionen productos fertilizantes, estimulantes, acondicionadores, enmiendas, sustratos, materias primas y bioinsumos; Inciso b) productos destinados a la fertilidad, nutrición, estimulación vegetal, acondicionadores, enmiendas, sustratos, materias primas y bioinsumos; Inciso c) plantas mezcladoras; Inciso d) laboratorios elaboradores de productos biológicos. En este caso, debe darse cumplimiento a los requisitos establecidos en el Anexo II “REQUISITOS PARA EL REGISTRO DE BIOINSUMOS DESTINADOS A LA NUTRICIÓN, ESTIMULACIÓN VEGETAL, ENMIENDAS, SUSTRATOS Y PROTECTORES DE ORIGEN BIOLÓGICO” de la Resolución N° RESOL-2023-1004-APN-PRES#SENASA del 12 de octubre de 2023 del mentado Servicio Nacional. ARTÍCULO 3°.- Definiciones. A los efectos de la interpretación y aplicación de la presente resolución, se establecen las siguientes definiciones: Inciso a) Acondicionador: producto que usado junto a otro/s producto/s potencia su efecto, mejorando la �eficiencia agronómica y demostrando una mejora sustancial con respecto al uso del producto individualmente; Inciso b) Enmienda: toda sustancia o mezcla de sustancias cuyo principal componente sea de carácter químico y/o químico-orgánico, y que incorporada al suelo modifica o mejora sus características físicas o químicas, sin perjuicio de su valor como fertilizante; Inciso c) Estimulante: sustancia que, cuando se aplica a semillas, plantas, rizosfera, suelo u otros medios de crecimiento mejoran la eficiencia fisiológica, la tolerancia al estrés biótico y abiótico, la disponibilidad de nutrientes inmovilizados en el suelo, la rizosfera y las características de calidad del cultivo, independientemente de su contenido de nutrientes, y no está destinada al control de enfermedades o insectos; Inciso d) Fertilizante: producto destinado a aumentar el crecimiento y la productividad de los cultivos, debido al aporte directo de nutrientes; Inciso e) Materia prima: cualquier producto que, pudiendo ser utilizado y comercializado como producto final, puede también ser destinado a un proceso productivo para la obtención de otros productos: Apartado I) incluye productos destinados a realizar mezclas físicas elaboradas en plantas mezcladoras inscriptas en el SENASA; Apartado II) incluye productos concentrados que luego serán diluidos para su comercialización. Inciso f) Sustrato: todo material distinto del suelo, colocado en un contenedor en mezcla o puro, que permite el anclaje del sistema radicular desempeñando la función de soporte para la planta. ARTÍCULO 4°.- Requisitos para el registro de productos fertilizantes, estimulantes, acondicionadores, enmiendas, sustratos, materias primas y bioinsumos. Se aprueban los requisitos para el registro de productos destinados a la fertilidad, nutrición, estimulación vegetal, acondicionadores, enmiendas, sustratos y materias primas que, como Anexo I (IF-2024-41864485-APN-DNPV#SENASA), forma parte integrante de la presente resolución: Inciso a) Los requisitos para el registro de bioinsumos destinados a la nutrición, así como para la importación de muestras con fines de experimentación y análisis, se encuentran, respectivamente, en los Anexos II y III, ambos de la referida Resolución N° 1004/23. ARTÍCULO 5°.- Parámetros de calidad. Se aprueban los parámetros de calidad para la comercialización de productos fertilizantes, estimulantes, materias primas, acondicionadores, enmiendas y sustratos que, como Anexo II (IF-2024-41865162-APN-DNPV#SENASA), forma parte integrante de la presente resolución. ARTÍCULO 6°.- Formularios de Inscripción. Los Formularios de Inscripción de Personas, Productos, Plantas Mezcladoras y Laboratorios Elaboradores de Productos Biológicos se encuentran disponibles en los formatos que este Servicio Nacional ponga a disposición a tal efecto. ARTÍCULO 7°.- Certificado de inscripción de producto. Una vez finalizado el proceso de inscripción del producto, se otorgará el “Certificado de inscripción de producto” que, como Anexo III (IF-2024-41864854-APNDNPV#SENASA), forma parte integrante de la presente resolución. ARTÍCULO 8°.- Otros trámites y modificaciones. Dentro de las inscripciones objeto de la presente norma, se admiten los siguientes trámites y modificaciones: �Inciso a) nombramiento de distribuidor: la persona humana o jurídica registrante de un producto autoriza a otra persona humana o jurídica, registrada en la mencionada Dirección de Agroquímicos y Biológicos, a comercializar o distribuir dentro del Territorio Nacional, importar o exportar dicho producto, sin cederle su titularidad; Inciso b) transferencia de productos de una empresa a otra: la persona humana o jurídica comunica a la precitada Dirección la cesión del producto a otra persona humana o jurídica, quien recibe los derechos de comercialización del producto y notificará la nueva titularidad a la mencionada dependencia del SENASA. La empresa a quien se le transfiere el producto se compromete a resguardar los restantes datos que oportunamente fueron aprobados para la comercialización del producto; Inciso c) cambio de razón social y/o nombre comercial del producto: consiste en la presentación ante la Dirección de Agroquímicos y Biológicos de la nueva razón social de la persona humana o jurídica y/o marca comercial, resguardando los restantes datos que fueran oportunamente aprobados para la comercialización del producto; Inciso d) ampliación de envases: consiste en la presentación de los envases modificados; Inciso e) otros: cualquier otra modificación al registro de personas, productos o establecimientos no contemplada en la presente norma debe ser consultada a la Autoridad de Aplicación. ARTÍCULO 9°.- Certificados sujetos a intervención. Se autorizan las Solicitudes de Importación y/o Exportación y los Certificados de Importación y/o Exportación de los productos alcanzados por la presente norma, según las Resoluciones Nros. RESOL-2019-75-APN-PRES#SENASA del 29 de enero de 2019 y RESOL-2022-802-APNPRES#SENASA del 9 de diciembre de 2022, ambas del citado Servicio Nacional. ARTÍCULO 10.- Cancelación del registro de los productos. El registro de los productos puede ser cancelado por: Inciso a) sanción: se determina por resolución como resultado de un incumplimiento de cualquiera de las disposiciones establecidas en la presente resolución, previo trámite administrativo del correspondiente sumario por infracción; Inciso b) restricción de uso o prohibición del producto: se determina por resolución; Inciso c) retiro voluntario de la persona humana o jurídica que sea el titular. ARTÍCULO 11.- Importación de muestras de productos con fines de experimentación y análisis. Toda persona humana o jurídica que desee realizar experimentación y análisis con productos importados destinados a usos agrícolas para registro, debe solicitar, en forma previa a la importación, la autorización de ingreso de muestras ante la Dirección de Agroquímicos y Biológicos: Inciso a) las muestras de los productos destinados a experimentación y análisis no podrán exceder la cantidad requerida por el protocolo de experimentación aprobado por la mentada Dirección. ARTÍCULO 12.- Tránsito de mercadería nacional o importada. La mercadería nacional o importada embolsada que se encuentre en tránsito debe poseer una identificación donde conste la denominación genérica del producto, la cual debe permanecer adherida al pallet o contenedor durante todo el transporte hasta su llegada a depósito. Dicha identificación debe poseer la resistencia necesaria para soportar mojaduras y estibas (etiquetas plásticas, sellos, autoadhesivos, etcétera). Una vez en depósito, debe procederse a la identificación individual del producto con un marbete aprobado de acuerdo con lo establecido en la presente resolución, si este no estuviera ya �identificado. ARTÍCULO 13.- Almacenamiento de fertilizantes con nitratos. Los productos a base de nitrato de potasio, nitrato sódico potásico, nitrato de calcio, nitrato de sodio y nitrato de amonio se encuentran alcanzados por los términos de la Resolución N° 338 del 23 de junio de 1995 de la ex-SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA, donde se establecen las condiciones específicas para su almacenaje. ARTÍCULO 14.- Prohibiciones. Se prohíbe: Inciso a) el uso de fertilizantes con un contenido mayor al DOS POR CIENTO (2 %) de cloruros en el cultivo de tabaco. Todos los productos que contengan al menos ese porcentaje de cloruro deben llevar la siguiente leyenda en el marbete o impresión: “PROHIBIDO SU USO EN CULTIVOS DE TABACO POR CONTENER CLORO EN SU FORMULACIÓN”; Inciso b) la elaboración y/o comercialización de mezclas secas que contengan simultáneamente componentes en polvo y granulados; Inciso c) los productos embolsados con materias primas de compatibilidad limitada (parcialmente incompatibles); Inciso d) la comercialización de productos vencidos o no aptos; Inciso e) la comercialización de productos que hayan sufrido alteraciones físicas y/o químicas en su almacenamiento o transporte, sin la correspondiente autorización de la Dirección de Agroquímicos y Biológicos, para lo cual se exigirá el previo análisis del laboratorio oficial; Inciso f) la importación, por razones sanitarias, de materias orgánicas provenientes de estiércoles o guanos no esterilizados. La esterilización debe ser certificada por la autoridad sanitaria o fitosanitaria del país de origen, indicando el método empleado: Apartado I) se exigirá, para cada partida de importación de otras materias orgánicas que el Organismo considere pertinente, como así también de turba, el Certificado Fitosanitario y/o Zoosanitario, según corresponda, emitido por el Ente Oficial competente del país de origen; Inciso g) la comercialización y/o distribución de los productos destinados a experimentación. ARTÍCULO 15.- Anexos. Se aprueban los siguientes Anexos, que forman parte integrante de la presente resolución: Inciso a) Anexo I: “Procedimiento para el registro de productos en el Registro Nacional de Fertilizantes, Enmiendas, Acondicionadores, Sustratos, Protectores y Materias Primas” (IF-2024-41864485-APNDNPV#SENASA); Inciso b) Anexo II: “Parámetros de calidad para la comercialización de productos fertilizantes, estimulantes, materias primas, acondicionadores, enmiendas y sustratos” (IF-2024-41865162-APN-DNPV#SENASA); Inciso c) Anexo III: “Certificado de inscripción de producto” (IF-2024-41864854-APN-DNPV#SENASA); Inciso d) Anexo IV: “Constancia de inscripción de plantas mezcladoras” (IF-2024-41902638-APNDNPV#SENASA); �Inciso e) Anexo V: “Constancia de inscripción de plantas biológicas” (IF-2024-41902969-APNDNPV#SENASA). ARTÍCULO 16.- Facultades. Se faculta a la Dirección Nacional de Protección Vegetal a dictar las normas y los procedimientos complementarios a la presente resolución y a adoptar las medidas pertinentes para lograr efectivizar el registro de productos pertenecientes a la categoría Fertilizantes, Estimulantes, Acondicionadores, Enmiendas, Sustratos, Materias Primas y Bioinsumos. ARTÍCULO 17.- Incumplimiento. Sanciones. El incumplimiento o las transgresiones a la presente norma serán pasibles de las sanciones establecidas en el Capítulo V de la Ley N° 27.233 y su Decreto Reglamentario N° DECTO-2019-776-APN-PTE del 19 de noviembre de 2019, sin perjuicio de las acciones preventivas que pudieran adoptarse en virtud de lo dispuesto en la Resolución N° 38 del 3 de febrero de 2012 del entonces MINISTERIO DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA y su modificatoria, o la que en el futuro la reemplace. ARTÍCULO 18.- Abrogación. Se abroga la Resolución N° 264 del 9 de mayo de 2011 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. ARTÍCULO 19.- Incorporación. Se incorpora la presente resolución al Libro Tercero, Parte Cuarta, Título I, Capítulo III, del Índice Temático del Digesto Normativo del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, aprobado por la Resolución N° 401 del 14 de junio de 2010 y su complementaria N° 913 del 22 de diciembre de 2010, ambas del citado Servicio Nacional. ARTÍCULO 20.- Vigencia. La presente resolución entra en vigencia a partir del día siguiente al de su publicación en el Boletín Oficial. ARTÍCULO 21.- Comuníquese, publíquese, dese a la DIRECCIÓN NACIONAL DEL REGISTRO OFICIAL y archívese. Digitally signed by CORTESE Pablo Luis Date: 2024.04.24 13:39:13 ART Location: Ciudad Autónoma de Buenos Aires Pablo Cortese Presidente Presidencia Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Digitally signed by GESTION DOCUMENTAL ELECTRONICA - GDE Date: 2024.04.24 13:39:26 -03:00 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Resoluciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Resolución SENASA N° 0431/2024 Description An account of the resource Se aprueba el procedimiento para el Registro de Productos en el Registro Nacional de Fertilizantes, Enmiendas, Acondicionadores, Sustratos, Protectores y materias Primas. Creator An entity primarily responsible for making the resource Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Source A related resource from which the described resource is derived <a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=398542">Resolución SENASA N° 0431/2024</a> Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource Miércoles 24 de abril de 2024 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Resolución Abstract A summary of the resource. Se aprueba el procedimiento para el registro de productos en el Registro Nacional de Fertilizantes, Enmiendas, Acondicionadores, Sustratos, Protectores y Materias Primas, instituido por la Ley N° 20.466, para quienes se encuentren interesados en su elaboración, importación, exportación, tenencia, fraccionamiento, distribución y venta, de conformidad con lo establecido en la presente resolución. Is Replaced By A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource. <strong>Abrogada por el Art. 14 de la <a href="https://biblioteca.senasa.gob.ar/items/show/id/4459">Resolucion 214/2025 del SENASA&nbsp;</a></strong> https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/0fb0a72d238f896ea30a7d7e6203c988.pdf 852addc12d58978e77f4be546d833765 PDF Text Text República Argentina - Poder Ejecutivo Nacional AÑO DE LA DEFENSA DE LA VIDA, LA LIBERTAD Y LA PROPIEDAD Resolución Número: RESOL-2024-657-APN-PRES#SENASA CIUDAD DE BUENOS AIRES Miércoles 19 de Junio de 2024 Referencia: EX-2024-37399153- -APN-DGTYA#SENASA - MODIFICA LA RESOLUCIÓN N° 431/2024 (PROCEDIMIENTO PARA EL REGISTRO DE PRODUCTOS EN EL REGISTRO NACIONAL DE FERTILIZANTES, ENMIENDAS, ACONDICIONADORES, SUSTRATOS, PROTECTORES Y MATERIAS PRIMAS) VISTO el Expediente N° EX-2024-37399153- -APN-DGTYA#SENASA; las Leyes Nros. 20.466 y 27.233; los Decretos Reglamentarios Nros. 4.830 del 23 de mayo de 1973 y su modificatorio 1.624 del 8 de agosto de 1980, y DECTO-2019-776-APN-PTE del 19 de noviembre de 2019; la Resolución N° RESOL-2024-431-APNPRES#SENASA del 24 de abril de 2024 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, y CONSIDERANDO: Que por la Resolución N° RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA del 24 de abril de 2024 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA se aprobó el procedimiento para el registro de productos en el Registro Nacional de Fertilizantes, Enmiendas, Acondicionadores, Sustratos, Protectores y Materias Primas, instituido por la Ley N° 20.466. Que en la citada norma se establecieron límites de metales pesados basados en normativa correspondiente a la UNIÓN EUROPEA (UE). Que los fertilizantes que están alcanzados por los referidos límites resultan de gran volumen e importancia para el país, y su fuente es principalmente la importación desde el REINO DE MARRUECOS, la REPÚBLICA POPULAR CHINA y los ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA. Que este gran volumen de comercialización condiciona la logística de estos productos enmarcados dentro de los denominados “commodities”. Que en esta dinámica, para hacer un uso eficiente del transporte, un mismo barco puede descargar en la REPÚBLICA ARGENTINA, en la REPÚBLICA FEDERATIVA DE BRASIL y en la REPÚBLICA �ORIENTAL DEL URUGUAY el mismo tipo de producto, razón por la cual el tener límites de metales pesados diferentes requeriría una modificación de la logística adecuada solo para nuestro país, lo que acrecentaría los costos de los productos. Que, por otra parte, cabe destacar que la producción argentina sigue principios agroecológicos similares a los de los aludidos países vecinos, por las condiciones de suelo, clima y cultivo, lo que nos asemeja en el uso de las tecnologías que atañen al manejo de cultivos, como siembra directa, aplicación de nutrientes o manejos sanitarios, entre otros. Que, por lo expuesto, resulta necesario adecuar los valores de los límites oportunamente establecidos, a fin de unificar los parámetros vigentes en la región para la cuantificación de metales pesados. Que, asimismo, corresponde establecer que, en todos los casos en que se requiera la inscripción de un producto, deberá declararse su procedencia. Que, por su parte, deviene necesario estipular que la información técnica presentada a los fines de registro sea respaldada técnicamente por un profesional con incumbencias afines. Que la Dirección Nacional de Protección Vegetal, y sus direcciones dependientes con competencia en la materia, han tomado la debida intervención. Que la Dirección de Laboratorio Vegetal, dependiente de la Dirección General de Laboratorios y Control Técnico, ha tomado intervención en el ámbito de sus competencias. Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete. Que la presente medida se dicta de conformidad con las facultades conferidas por el Artículo 8°, inciso f), del Decreto N° 1.585 del 19 de diciembre de 1996 y sus modificatorios. Por ello, EL PRESIDENTE DEL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA RESUELVE: ARTÍCULO 1°.- Punto 2.2. del Capítulo 2 del Anexo I de la Resolución N° RESOL-2024-431-APNPRES#SENASA. Sustitución. Se sustituye el subapartado “Nota” del Punto 2.2. del Capítulo 2 del Anexo I de la Resolución N° RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA del 24 de abril de 2024 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, por el siguiente texto: “Nota: La información técnica presentada por las empresas deberá ser respaldada por un responsable técnico con incumbencia profesional en la materia.”. ARTÍCULO 2°.- Punto 3.4.6. del Capítulo 3 del Anexo I de la citada Resolución N° RESOL-2024-431-APNPRES#SENASA. Sustitución. Se sustituye el Punto 3.4.6. del Capítulo 3 del Anexo I de la mencionada �Resolución N RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA por el siguiente texto: “3.4.6. Origen: declarar origen.”. ARTÍCULO 3°.- Punto 2.6.3. del Capítulo 2 del Anexo II de la mentada Resolución N° RESOL-2024-431-APNPRES#SENASA. Sustitución. Se sustituye el Punto 2.6.3. del Capítulo 2 del Anexo II de la referida Resolución N° RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA por el siguiente texto: “2.6.3. Contenido máximo de metales pesados o elementos potencialmente tóxicos. CONTENIDO MÁXIMO DE ELEMENTOS POTENCIALMENTE TÓXICOS (EPT) [mg/kg MS (materia seca)] Cadmio 1,5 Cobre 150 Cromo total 100 Mercurio 0,7 Níquel 30 Plomo 100 Zinc 300 Arsénico 15 ARTÍCULO 4°.- Punto 2.10.1. del Capítulo 2 del Anexo II de la citada Resolución N° RESOL-2024-431-APNPRES#SENASA. Sustitución. Se sustituye el Punto 2.10.1. del Capítulo 2 del Anexo II de la aludida Resolución N° RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA por el siguiente texto: “2.10.1. Requisitos para Productos Fosforados. 2.10.1.1. Metales pesados como contaminantes en concentraciones que no superen los siguientes valores límites: 2.10.1.1.1. Cadmio (Cd): CUATRO MILIGRAMOS POR KILOGRAMO (4 mg/kg) por cada UN POR CIENTO (1 %) de P2O5. �2.10.1.1.2. Plomo (Pb): VEINTE MILIGRAMOS POR KILOGRAMO (20 mg/kg) por cada UN POR CIENTO (1 %) de P2O5. 2.10.1.1.3. Mercurio (Hg): CERO COMA CERO CINCO MILIGRAMOS POR KILOGRAMO (0,05 mg/kg) por cada UN POR CIENTO (1 %) de P2O5. 2.10.1.1.4. Cromo (Cr) Total: CUARENTA MILIGRAMOS POR KILOGRAMO (40 mg/kg) por cada UN POR CIENTO (1 %) de P2O5. 2.10.1.1.5. Arsénico (As) Total: DOS MILIGRAMOS POR KILOGRAMO (2 mg/kg) por cada UN POR CIENTO (1 %) de P2O5.”. ARTÍCULO 5°.- Puntos 2.1.4. y 2.2.5. del Capítulo 2 del Anexo I de la mencionada Resolución N° RESOL2024-431-APN-PRES#SENASA. Derogación. Se derogan los Puntos 2.1.4. y 2.2.5. del Capítulo 2 del Anexo I de la referida Resolución N° RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA. ARTÍCULO 6°.- Vigencia. La presente resolución entra en vigencia a partir del día siguiente al de su publicación en el Boletín Oficial. ARTÍCULO 7°.- Comuníquese, publíquese, dese a la DIRECCIÓN NACIONAL DEL REGISTRO OFICIAL y archívese. Digitally signed by CORTESE Pablo Luis Date: 2024.06.19 12:08:34 ART Location: Ciudad Autónoma de Buenos Aires Pablo Cortese Presidente Presidencia Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Digitally signed by GESTION DOCUMENTAL ELECTRONICA - GDE Date: 2024.06.19 12:08:36 -03:00 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Resoluciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Resolución SENASA N° 0657/2024 Creator An entity primarily responsible for making the resource Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Source A related resource from which the described resource is derived <a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=400749">Resolución SENASA N° 0657/2024</a> Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource Miércoles 19 de Junio de 2024 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Resolución Is Replaced By A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource. <strong>Abrogada por el Art. 14 de la <a href="https://biblioteca.senasa.gob.ar/items/show/id/4459">Resolucion 214/2025 del SENASA&nbsp;</a></strong> Description An account of the resource Se establecen límites de metales pesados Abstract A summary of the resource. Que en esta dinámica, para hacer un uso eficiente del transporte, un mismo barco puede descargar en la REPÚBLICA ARGENTINA, en la REPÚBLICA FEDERATIVA DE BRASIL y en la REPÚBLICA ORIENTAL DEL URUGUAY el mismo tipo de producto, razón por la cual el tener límites de metales pesados diferentes requeriría una modificación de la logística adecuada solo para nuestro país, lo que acrecentaría los costos de los productos. Que, por lo expuesto, resulta necesario adecuar los valores de los límites oportunamente establecidos, a fin de unificar los parámetros vigentes en la región para la cuantificación de metales pesados. https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/7e33afd4dc0b6553d1590d4dd6e76f30.pdf adef44b7e31f136ce84ed8142f62ca40 PDF Text Text República Argentina - Poder Ejecutivo Nacional AÑO DE LA RECONSTRUCCIÓN DE LA NACIÓN ARGENTINA Resolución Número: RESOL-2025-214-APN-PRES#SENASA CIUDAD DE BUENOS AIRES Martes 1 de Abril de 2025 Referencia: EX-2025-33846938- -APN-DGTYA#SENASA - APRUEBA MANUAL TÉCNICO VISTO el Expediente N° EX-2025-33846938- -APN-DGTYA#SENASA; la Ley de Fiscalización de Fertilizantes y Enmiendas N° 20.466 y la Ley N° 27.233; el Decreto Reglamentario N° DECTO-2025-101-APN-PTE del 14 de febrero de 2025; los Decretos Nros. 434 del 1 de marzo de 2016, DECTO-2016-1063-APN-PTE del 4 de octubre de 2016 y DECTO-2017-891-APN-PTE del 1 de noviembre de 2017; la Resolución Conjunta N° RESFC2019-1-APN-SECCYMA#SGP del 7 de enero de 2019 de la ex-SECRETARÍA DE CONTROL Y MONITOREO AMBIENTAL de la entonces SECRETARÍA DE GOBIERNO DE AMBIENTE Y DESARROLLO SUSTENTABLE y del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA; las Resoluciones Nros. RESOL-2019-19-APN-SGAYDS#SGP del 22 de enero de 2019 de la referida ex-Secretaría de Gobierno, 816 del 4 de octubre de 2002, RESOL-2019-75-APN-PRES#SENASA del 29 de enero de 2019, RESOL-2022-802-APN-PRES#SENASA del 9 de diciembre de 2022, RESOL-2023-1004-APN-PRES#SENASA del 12 de octubre de 2023, RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA del 24 de abril de 2024 y RESOL-2024657-APN-PRES#SENASA del 19 de junio de 2024, todas del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, y CONSIDERANDO: Que la Ley de Fiscalización de Fertilizantes y Enmiendas N° 20.466 establece el régimen jurídico aplicable al control de la elaboración, importación, exportación, tenencia, fraccionamiento, distribución y venta de fertilizantes y enmiendas en el Territorio Nacional, con el propósito de garantizar la calidad y la seguridad de estos insumos. Que el Decreto Reglamentario N° DECTO-2025-101-APN-PTE del 14 de febrero de 2025 reglamenta la citada ley y actualiza el marco normativo vigente, adecuándolo a las necesidades actuales del sector y a los principios de modernización de la Administración Pública Nacional. Que, el mencionado decreto designa a la SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA del MINISTERIO DE ECONOMÍA como Autoridad de Aplicación de la referida Ley N° 20.466, y establece que las �funciones operativas y de implementación de los registros y controles previstos en la norma serán ejercidas por el SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA (SENASA). Que, por su parte, el Artículo 6° del mentado Decreto N° 101/25 establece un régimen diferencial para la importación de fertilizantes y enmiendas, en función de las certificaciones emitidas por autoridades competentes de determinados países, a fin de agilizar el comercio exterior sin desatender los resguardos sanitarios y productivos. Que el Artículo 8° del mismo texto normativo dispone que la inscripción de productos y personas humanas o jurídicas en el registro respectivo estará exenta de aranceles y tendrá vigencia plena sin límite de tiempo, y determina también causales de cancelación del registro ante modificaciones en la composición del producto. Que, asimismo, el Artículo 9° del referido decreto establece obligaciones específicas en materia de comercialización y transporte de fertilizantes que contengan nitrato de amonio a granel, con el objetivo de fortalecer la trazabilidad y garantizar el resguardo de la seguridad pública y ambiental. Que mediante el Artículo 10 del aludido decreto se otorga a la SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA, por intermedio de su servicio especializado, facultades expresas para limitar, prohibir o excluir del registro productos que considere inapropiados para determinadas regiones o cultivos, en resguardo de la producción agropecuaria y del medio ambiente. Que la Ley N° 27.233 declara de interés nacional la sanidad de los animales y los vegetales, así como la prevención, el control y la erradicación de las enfermedades y de las plagas que afecten la producción silvoagropecuaria nacional, la flora y la fauna, la calidad de las materias primas producto de las actividades silvoagrícolas, ganaderas y de la pesca, así como también la producción, inocuidad y calidad de los agroalimentos, los insumos agropecuarios específicos y el control de los residuos químicos y contaminantes químicos y microbiológicos en los alimentos y el comercio nacional e internacional de dichos productos y subproductos, siendo el SENASA la autoridad de aplicación y el encargado de planificar, ejecutar y controlar el desarrollo de las acciones previstas en la mencionada ley. Que, asimismo, establece la responsabilidad primaria e ineludible de toda persona física o jurídica vinculada a la producción, obtención o industrialización de productos, subproductos y derivados de origen silvo-agropecuario, cuya actividad se encuentre sujeta al contralor del SENASA, el velar y responder por la sanidad, inocuidad, higiene y calidad de su producción, de conformidad con la normativa vigente y la que en el futuro se establezca. Que por el Decreto N° 434 del 1 de marzo de 2016 se aprueba el Plan de Modernización del Estado, orientado a la transformación de la Administración Pública mediante la simplificación de trámites, la reducción de plazos y costos administrativos y la incorporación de tecnologías de gestión. Que a través del Decreto N° DECTO-2016-1063-APN-PTE del 4 de octubre de 2016 se aprueba el Sistema de Gestión Documental Electrónica (GDE) y se regula la Plataforma de Trámites a Distancia (TAD), estableciendo su carácter obligatorio para los trámites ante la Administración Pública Nacional. Que el Decreto N° DECTO-2017-891-APN-PTE del 1 de noviembre de 2017 establece las Buenas Prácticas en Materia de Simplificación, imponiendo a los organismos nacionales la obligación de sustentar los procedimientos administrativos en los principios de celeridad, eficacia, digitalización e interoperabilidad. Que mediante la Resolución N° RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA del 24 de abril de 2024 y su �modificatoria, Resolución N° RESOL-2024-657-APN-PRES#SENASA del 19 de junio de 2024, ambas del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA (SENASA) se aprueba el procedimiento para el registro de productos en el Registro Nacional de Fertilizantes, Enmiendas, Acondicionadores, Sustratos, Protectores y Materias Primas, instituido por la Ley N° 20.466. Que, por su parte, la Resolución N° RESOL-2023-1004-APN-PRES#SENASA del 12 de octubre de 2023 del mencionado Servicio Nacional aprueba el procedimiento para el registro de bioinsumos en los Registros Nacionales de Terapéutica Vegetal, creado por el Decreto N° 5.769 del 12 de mayo de 1959, y de Fertilizantes, Enmiendas, Sustratos, Acondicionadores, Protectores y Materias Primas, instituido por la citada Ley N° 20.466, para quienes se encuentren interesados en elaborar, importar, exportar, tener, fraccionar, distribuir y/o vender bioinsumos. Que, a su vez, la Resolución N° RESOL-2019-75-APN-PRES#SENASA del 29 de enero de 2019 del mentado Servicio Nacional establece, complementariamente, un régimen de importación y exportación de fertilizantes y enmiendas. Que la precitada resolución fue posteriormente prorrogada por el término de CUATRO (4) años mediante la Resolución N° RESOL-2022-802-APN-PRES#SENASA del 9 de diciembre de 2022 del referido Servicio Nacional. Que, atento el nuevo marco establecido por el Decreto N° 101/2025, corresponde adoptar un nuevo ordenamiento reglamentario que garantice la coherencia normativa, la seguridad jurídica y la efectiva implementación de los preceptos determinados por el citado Decreto N° 101/25. Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete. Que el suscripto es competente para dictar el presente acto en virtud de lo dispuesto por los Artículos 4° y 8°, inciso f), del Decreto N° 1.585 del 19 de diciembre de 1996 y sus modificatorios. Por ello, EL PRESIDENTE DEL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA RESUELVE: INSCRIPCIONES VINCULADAS AL REGISTRO NACIONAL DE FERTILIZANTE, ESTIMULANTE, ENMIENDA, SUSTRATO, INOCULANTE, ACONDICIONADOR, PROTECTOR Y MATERIA PRIMA EN LA REPÚBLICA ARGENTINA ARTÍCULO 1°.- Registro de personas, establecimientos y plantas. Se aprueba el procedimiento simplificado de inscripción por autogestión y emisión inmediata de registro para personas humanas y jurídicas que intervengan en la elaboración, el fraccionamiento, la distribución, la importación o la exportación de productos fertilizantes, estimulantes, enmiendas, sustratos, inoculantes, acondicionadores, protectores y materias primas, así como de las plantas en las que se desarrollen dichas actividades, conforme a lo dispuesto en el Capítulo I del Manual Técnico obrante como Anexo de la presente resolución. �Inciso a) Las personas humanas y jurídicas deben completar, con carácter de Declaración Jurada, el formulario de inscripción a través de la plataforma de Trámites a Distancia (TAD) o la que se informe o la reemplace en el futuro. Inciso b) La presentación de la Declaración Jurada habilitará automáticamente a las firmas registrantes a comercializar los productos registrados, quedando estas sujetas a fiscalización posterior por parte del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA (SENASA). Inciso c) La detección de información falsa, incompleta o adulterada será motivo suficiente para suspender o cancelar automáticamente el registro otorgado, independientemente del resto de las medidas y sanciones administrativas que correspondan. Sin perjuicio de lo dispuesto precedentemente, el SENASA podrá formular los pedidos de subsanación que estime corresponder. ARTÍCULO 2°.- Registro de productos. Se aprueban las modalidades y los procedimientos de inscripción para el registro de productos fertilizantes, estimulantes, enmiendas, sustratos, inoculantes, acondicionadores, protectores o materias primas, incluidos los bioinsumos, conforme a lo dispuesto en el Capítulo I del citado Manual Técnico. Inciso a) Las personas humanas y jurídicas deben completar, con carácter de Declaración Jurada, el formulario de solicitud de inscripción del producto a través de la plataforma de Trámites a Distancia (TAD) o la que se informe o la reemplace en el futuro. Inciso b) El SENASA verificará la documentación presentada en un plazo no superior a DIEZ (10) días hábiles. En caso de no expedirse en dicho plazo, se considerará aprobado el registro del producto. Una vez obtenido el registro, el producto quedará en condiciones de ser comercializado. Los productos inscriptos contarán con su correspondiente “Certificado de registro de producto” y quedarán sujetos a fiscalización y control posterior por parte del SENASA. Inciso c) La detección de información falsa, incompleta o adulterada en la Declaración Jurada presentada, o cualquier modificación o alteración del producto comercializado y de su correcta identificación, será motivo suficiente para suspender o cancelar automáticamente el registro otorgado, independientemente de la aplicación del resto de las medidas y sanciones administrativas que correspondan. Sin perjuicio de lo dispuesto precedentemente, el SENASA podrá formular los pedidos de subsanación que estime corresponder. ARTÍCULO 3°.- Requisitos de importación y exportación. A los fines de la importación y exportación de productos, se establece que: Inciso a) Los productos que cuenten con certificaciones de inscripción o registro emitidas por las autoridades competentes de los países contemplados en el Anexo I del Decreto N° DECTO-2025-101-APN-PTE del 14 de febrero de 2025, podrán ingresar mediante el procedimiento simplificado de autogestión y emisión inmediata de la constancia de registro y Aviso de Importación, conforme a lo dispuesto en el Capítulo II del Manual Técnico obrante como Anexo de la presente resolución. Inciso b) Para el resto de los productos importados no alcanzados por el Anexo I del precitado decreto y para el caso de productos con carácter biológico sin antecedentes de registro en el país, la Autorización de Importación se debe gestionar conforme a lo establecido en el Capítulo II del referido Manual Técnico. Estas gestiones se tramitarán mediante Declaración Jurada a través de la plataforma de Trámites a Distancia �(TAD), o la que la se informe o la reemplace en el futuro. El SENASA resolverá la solicitud de “Certificado de Autorización de Importación” en un plazo máximo de CINCO (5) días hábiles. Inciso c) En caso de exportación, los productos deberán cumplir únicamente con los requisitos exigidos por el país de destino, si es que lo requiere. La detección de información falsa, incompleta o adulterada será motivo suficiente para suspender o cancelar automáticamente el registro otorgado, independientemente del resto de las medidas y sanciones administrativas que corresponda aplicar a la firma, al representante legal y al asesor técnico. ARTÍCULO 4°.- Régimen de Ventanilla Única de Comercio Exterior. El SENASA arbitrará los medios para acordar con la DIRECCIÓN GENERAL DE ADUANAS de la AGENCIA DE RECAUDACIÓN Y CONTROL ADUANERO (ARCA), dependiente del MINISTERIO DE ECONOMÍA, que mediante el Régimen de Ventanilla Única de Comercio Exterior Argentino (VUCEA) se remitan los “Avisos de Importación” y “Autorización de Importación” mencionados en el marco del “Servicio de Recepción de LPCO” para la admisión de Licencias, Permisos, Certificados y Otros documentos, a fin de que su validación sea automática en el SISTEMA INFORMÁTICO MALVINA (S.I.M.), la que deberá ser declarada al momento de la oficialización de las solicitudes de importación. Inciso a) En el caso de exportaciones, bastará con la presentación del “Certificado de registro de producto” emitido por el SENASA, como documento válido para efectuar la exportación, o una “Nota de autorización especial de exportación” de dicho Organismo para el caso de muestras, conforme al procedimiento dispuesto en el Capítulo II del Manual Técnico obrante como Anexo de la presente resolución. ENVÍOS A GRANEL DE FERTILIZANTES QUE CONTENGAN NITRATO DE AMONIO ARTÍCULO 5°.- Nitrato de amonio. La comercialización de envíos a granel de más de CINCUENTA TONELADAS (50 t) de fertilizantes que contengan nitrato de amonio debe ser comunicada al SENASA con antelación a su despacho, mediante la plataforma de Trámites a Distancia (TAD), o la que se informe o la reemplace en el futuro, declarando: Inciso a) Datos del declarante. Inciso b) Datos de la firma comercializadora de la partida. Inciso c) Identificación del producto. Inciso d) Composición del producto. Inciso e) Lugar de origen del despacho de la mercadería. Inciso f) Lugar de arribo final de la mercadería despachada. Inciso g) Circuito a recorrer. Inciso h) Volumen a trasladar en toneladas (t). �Inciso i) Fecha de envío. ARTÍCULO 6°.- Gastos de muestreo. El SENASA podrá efectuar la extracción de muestras de productos en el marco de las actividades de fiscalización y control del registro de productos fertilizantes, estimulantes, enmiendas, sustratos, inoculantes, acondicionadores, protectores y materias primas para su fiscalización. Los costos que demande el envío de muestras y las determinaciones o ensayos de laboratorio estarán a cargo de la firma titular del registro. DISPOSICIONES FINALES ARTÍCULO 7°.- Manual Técnico. Anexo. Aprobación. Se aprueba el Manual Técnico que, como Anexo (IF2025-34012252-APN-PRES#SENASA), forma parte integrante de la presente resolución. ARTÍCULO 8°.- Resolución N° RESOL-2019-75-APN-PRES#SENASA del 29 de enero de 2019 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. Sustitución. Se sustituye el Artículo 1° de la Resolución N° RESOL-2019-75-APN-PRES#SENASA del 29 de enero de 2019 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, el que quedará redactado de la siguiente manera: “ARTÍCULO 1°.- Solicitud de Autorización de Exportación y/o Importación. Trámite a través de la Ventanilla Única de Comercio Exterior (VUCE ARGENTINA) o de la plataforma de Trámites a Distancia (TAD). A fin de solicitar el Certificado de Autorización de Exportación y/o el Certificado de Autorización de Importación, el exportador y/o importador de principios activos, productos agroquímicos y biológicos utilizados en la producción y comercialización de productos fitosanitarios, debe ingresar a la Ventanilla Única de Comercio Exterior (VUCE ARGENTINA), a la plataforma de Trámites a Distancia (TAD) o a cualquier otra que en el futuro las reemplace, y completar los campos de las solicitudes que se aprueban en los Artículos 3° y 5° de la presente resolución, según corresponda.”. ARTÍCULO 9°.- Resolución N° RESOL-2023-1004-APN-PRES#SENASA del 12 de octubre de 2023 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. Sustitución. Se sustituye el Artículo 1° de la Resolución N° 1004 del 12 de octubre de 2023 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, el que quedará redactado de la siguiente forma: “ARTÍCULO 1°.- Procedimiento de registro de bioinsumos. Se aprueba el procedimiento para el registro de bioinsumos en el Registro Nacional de Terapéutica Vegetal, creado por el Decreto N° 5.769 del 12 de mayo de 1959, para quienes se encuentren interesados en elaborar, importar, exportar, tener, fraccionar, distribuir y/o vender bioinsumos para tratamiento fitosanitario, conforme lo establecido en la presente resolución.”. ARTÍCULO 10.- Resolución N° 1004/23. Sustitución. Se sustituye el Artículo 2° de la citada Resolución N° 1004/23, el que quedará redactado de la siguiente forma: “ARTÍCULO 2°.- Alcance. Se encuentran sujetas a registro las siguientes categorías de bioinsumos destinados a la protección vegetal: Inciso a) invertebrados como agentes de control biológico, Inciso b) semioquímicos de origen biológico, Inciso c) a base de extractos de origen vegetal, animal o microbiológico, �Inciso d) agentes de control microbiano.”. ARTÍCULO 11.- Resolución N° 1004/23. Sustitución. Se sustituye el Artículo 3° de la mencionada Resolución N° 1004/23, el que quedará redactado de la siguiente forma: “ARTÍCULO 3°.- Definiciones. A los efectos de la interpretación y aplicación de la presente resolución, se establecen las siguientes definiciones: Inciso a) Agente de control biológico microbiano: agente microbiano de ocurrencia natural, o introducido en el ambiente, para la prevención y/o el control de poblaciones o actividades biológicas de organismos considerados plaga de la agricultura. Inciso b) Bioinsumo: producto que consista o haya sido producido por microorganismos o macroorganismos de origen animal o vegetal, extractos o compuestos bioactivos obtenidos a partir de ellos, y que estén destinados a ser aplicados como insumos en la producción agrícola con fines nutricionales, estimulación vegetal, enmiendas, sustratos, protectores biológicos o para la protección del cultivo. Entiéndase por tales a aquellos productos que durante su formulación solo hayan sufrido procesos físicos de deshidratación, molienda, congelación, mezcla, separación, concentración o procesos químicos de extracción en agua o en soluciones ácidas y/o alcalinas. Cuando los bioinsumos sean obtenidos por extracción con ácidos y bases fuertes, se evaluará la posible inclusión en esta categoría. Inciso c) Fitorregulador biológico: producto fitosanitario de origen biológico que tiene acción sobre los órganos vegetativos o de reproducción de las plantas, provocando efectos tales como la inhibición, el retardo o la aceleración del crecimiento, la maduración, la inducción, el raleo, la fijación y el cambio de los caracteres organolépticos de frutas y hortalizas. Inciso d) Invertebrados como agentes de control biológico: se consideran agentes de control biológico a los invertebrados introducidos en el ambiente para controlar una población o actividades biológicas de poblaciones de organismos plaga de la agricultura. Inciso e) Organismo Genéticamente Modificado (OGM): cualquier entidad biológica capaz de transferir o replicar material genético que posea una combinación nueva de material genético que se haya obtenido mediante la aplicación de la biotecnología moderna. Inciso f) Plaga: cualquier especie, raza o biotipo vegetal o animal, agente patógeno dañino para las plantas o productos vegetales (FAO 1990; revisado FAO, 1995; CIPF, 1997). Inciso g) Semioquímicos de origen biológico: se entiende por productos semioquímicos a aquellos constituidos por sustancias bioquímicas obtenidas sin que se involucre reacción química alguna, que provocan respuestas conductuales o fisiológicas en los organismos receptores y que se utilizan con fines de monitoreo, modificación etológica y control de una población de artrópodos plaga, pudiendo clasificarse, según el tipo de acción que provocan, como feromonas (comunicación intraespecífica) y aleloquímicos (comunicación interespecífica).”. ARTÍCULO 12.- Resolución N° 1004/23. Sustitución. Se sustituye el Artículo 6° de la mentada Resolución N° 1004/23, el que quedará redactado de la siguiente forma: “ARTÍCULO 6°.- Bioinsumos con más de UNA (1) aptitud. Los bioinsumos con más de UNA (1) aptitud deben cumplir los requisitos establecidos para cada una de las aptitudes en que se inscriban.”. �ARTÍCULO 13.- Derogaciones. Se derogan los Artículos 5° y 10 de la Resolución N° RESOL-2023-1004-APNPRES#SENASA del 12 de octubre de 2023 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. ARTÍCULO 14.- Abrogaciones. Se abrogan las Resoluciones Nros. RESOL-2024-431-APN-PRES#SENASA del 24 de abril de 2024 y RESOL-2024-657-APN-PRES#SENASA del 19 de junio de 2024, ambas del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. ARTÍCULO 15.- Incumplimiento. Sanciones. El incumplimiento o la transgresión a la presente norma serán pasibles de las sanciones establecidas en el Capítulo V de la ley N° 27.233 y su Decreto Reglamentario N° DECTO-2019-776-APN-PTE del 19 de noviembre de 2019, sin perjuicio de las acciones preventivas que pudieran adoptarse en virtud de lo dispuesto en la Resolución N° 38 del 3 de febrero de 2012 del entonces MINISTERIO DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y PESCA y su modificatoria, o la que en el futuro la reemplace. ARTÍCULO 16.- Vigencia. La presente resolución entra en vigencia a los SESENTA (60) días corridos posteriores a su publicación en el Boletín Oficial. ARTÍCULO 17.- Comuníquese, publíquese, dese a la DIRECCIÓN NACIONAL DEL REGISTRO OFICIAL y archívese. Digitally signed by CORTESE Pablo Luis Date: 2025.04.01 18:58:42 ART Location: Ciudad Autónoma de Buenos Aires Pablo Cortese Presidente Presidencia Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Digitally signed by GESTION DOCUMENTAL ELECTRONICA - GDE Date: 2025.04.01 18:58:53 -03:00 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Resoluciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Resolución SENASA N° 0214/2025 Description An account of the resource Introduce modificaciones a las reglamentaciones referidas a la fiscalización de Fertilizantes y Enmiendas Creator An entity primarily responsible for making the resource Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Source A related resource from which the described resource is derived <a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=411236">Resolución SENASA N° 0214/2025</a> Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource Martes 1 de Abril de 2025 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Resolución Abstract A summary of the resource. Se aprueba el procedimiento simplificado de inscripción por autogestión y emisión inmediata de registro para personas humanas y jurídicas que intervengan en la elaboración, el fraccionamiento, la distribución, la importación o la exportación de productos fertilizantes, estimulantes, enmiendas, sustratos, inoculantes, acondicionadores, protectores y materias primas Has Part A related resource that is included either physically or logically in the described resource. Incluye Anexos https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/39dd1833ac756eae39d3ff2b017fe40c.pdf 580cb04112f0314058bcc462b2431d2d PDF Text Text MANUAL DE PROCEDIMIENTO Diagnóstico serológico de brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis) Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) Edición 2025 �El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria es un organismo descentralizado, responsable de ejecutar las políticas nacionales en materia de sanidad y calidad animal, vegetal y de la inocuidad de los alimentos de su competencia, así como de verificar el cumplimiento de la normativa vigente en la materia. Equipos de trabajo Coordinación de Bacteriología Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico Coordinación General de Comunicación Institucional Edición 2025 �Índice Introducción 6 Objetivos 6 Abreviaturas y definiciones 6 Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio 7 Principios de bioseguridad 7 Prácticas operativas seguras y hábitos personales 8 Limpieza y desinfección del laboratorio 10 Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) 10 Aseguramiento de la calidad en el laboratorio 10 Control de calidad de insumos 11 Equipos 13 Sobre la enfermedad 13 Descripción de la enfermedad 14 Infección por Brucella en ganado bovino 14 Infección por Brucella en ovejas y cabras 15 Infección por Brucella en cerdos 15 Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes 16 en cautiverio o en libertad Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red 17 18 18 20 �Registro de entrada de muestras 20 Características y condiciones de las muestras 21 Condiciones de recepción de las muestras 21 Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las 21 muestras Informes de resultados Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) 22 23 para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Desarrollo 23 Ejecución del ensayo de BPAT 23 Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala 24 Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de scree- 25 ning con antígeno tamponado en placa Informes de resultados Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) 25 26 Desarrollo 26 Ejecución del ensayo 27 Incubación 28 Lectura e interpretación de resultados 28 Informes de resultados 30 Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME 31 Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos 31 Desarrollo 32 Toma de la muestra 33 Ejecución del ensayo 33 Lectura 33 Modificación de la prueba para tanques muy grandes 34 Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) 34 Etapas 35 Desarrollo 36 �ELISA por competición / bloqueo Desarrollo Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos 38 38 41 contra brucella en suero Desarrollo 42 Ejecución del ensayo 42 Lectura e interpretación 43 Fijación de complemento 44 Desarrollo 44 Manejo y conservación de las muestras 45 Condiciones del ensayo 46 Ejecución 46 Lectura de resultados 48 Anexos 52 Bibliografía 68 �Introducción El presente manual está dirigido a profesionales que se desempeñan en la Red de Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab) respecto a las técnicas relacionadas con el diagnóstico serológico de brucelosis. Estas técnicas son internacionalmente reconocidas y recomendadas por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) y el Senasa. Objetivos • Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los laboratorios que realizan el diagnóstico serológico de la brucelosis en diferentes especies animales inscriptos en la Redlab. • Proporcionar a la Redlab un instrumento que facilite el desarrollo adecuado, sistematizado y estandarizado de los procedimientos técnicos que se realizan en los laboratorios. • Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de calidad que deben cumplirse cuando se desarrolle un procedimiento técnico. • Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de las actividades del laboratorio. Abreviaturas y definiciones • Ag: Antígeno • Biovariedad: bv • BPAT (Buffered plate antigen test): Aglutinación con antígeno bufferado en placa • CELISA: Enzimoinmunoensayo competitivo • C’: Complemento de cobayo • DGLYCT: Dirección General de Laboratorios y Control Técnico • DLA: Dirección de Laboratorio Animal • DNSA: Dirección Nacional de Sanidad Animal • DT: Dilución de Trabajo • ELISA: Enzimoinmunoensayo • FCT: Fijación de Complemento Test • FPA: Ensayo de Polarización Fluorescente • GR: Glóbulos Rojos • IELISA: Enzimoinmunoensayo Indirecto • IgG: Inmunoglobulina G • IgM: Inmunoglobulina M • LPS: Lipopolisacárido • 2-ME: 2- Mercaptoethanol • M: Molar • mP: milipolarización MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 6 �• MRT (PAL): Prueba de anillo en leche • OMSA: Organización Mundial de Sanidad Animal • PAC: Poder anticomplementario • RBT: Rosa de Bengala Test • Renspa: Registro Nacional de Productores Agropecuarios • SAT: Seroaglutinación lenta en tubo • SB: Solución Buffer • Senasa: Servicio de Sanidad y Calidad Agroalimentaria • SH: Sistema Hemolítico • UI/ml: Unidades Internacionales por mililitro • UIFCT/ml: Unidad Internacional fijadora del complemento Test por mililitro • UA: Unidad de Antígeno • UC: Unidad de Complemento • UH: Unidad de Hemolisina Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio Se entiende por bioseguridad: La disciplina que trata el manejo seguro y la contención de microorganismos infecciosos y materiales biológicos peligrosos. La práctica del manejo seguro de microorganismos patógenos y sus toxinas en el laboratorio biológico se realiza a través de la aplicación de los principios de contención y la evaluación de riesgos. Principios de bioseguridad El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales infecciosos en el medio ambiente del laboratorio, donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos. Contención primaria: la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos es provista tanto mediante buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de Equipos de Protección Personal (EPP) de seguridad adecuados. La aplicación de vacunas al personal cuando corresponda puede brindar un mayor nivel de protección del personal. Contención secundaria: la protección del medioambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos se logra a través de una combinación del diseño de la instalación y prácticas operativas. Por lo tanto, los elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos. Prácticas y técnicas de laboratorio: el elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 7 �estándares. Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales, y también deben estar capacitados y ser expertos en las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura. Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se debe alertar al personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las prácticas y procedimientos requeridos. El personal capacitado y bien informado acerca de las técnicas de laboratorio adecuadas, procedimientos de seguridad y riesgos asociados a la manipulación de agentes infecciosos debe ser el responsable de la conducción de los trabajos con cualquier agente o material infeccioso. Esta persona tiene la obligación de consultar a profesionales especializados en bioseguridad u otros profesionales de la salud y seguridad respecto de la evaluación del riesgo. Cuando las prácticas de laboratorio estándares no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o a un procedimiento de laboratorio particular, quizás sea necesario aplicar medidas adicionales. El director del laboratorio es responsable de seleccionar prácticas de seguridad adicionales, que deben guardar relación con los riesgos relacionados con el agente o procedimiento. El director o la persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitación adecuada del personal. Prácticas operativas seguras y hábitos personales • Limitar o restringir el acceso al laboratorio. • Diseñar el laboratorio para que su limpieza sea sencilla. Las superficies de las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y ser resistentes al calor moderado y a solventes orgánicos, ácidos, álcalis y productos químicos utilizados para descontaminar la superficie de trabajo y los equipos. • Seleccionar muebles de laboratorio con capacidad de soportar cargas y usos previstos. Los espacios entre las mesas de trabajo, gabinetes y equipos deben ser accesibles para su limpieza. • Cada laboratorio debe contener una pileta para el lavado de manos. • Adecuar la iluminación para todas las actividades, evitando los reflejos y el brillo que pueda molestar la visión. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 8 �• Proveer mosquiteros para las ventanas del laboratorio que se abren hacia el exterior (en lo posible deberían ser fijas). • Usar ambos, delantales, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados durante la permanencia en el mismo. Retirar y dejar esta ropa de protección en el laboratorio antes de dirigirse a otras áreas (por ejemplo, cafetería, biblioteca, oficinas administrativas); además, usar calzado cerrado y cabello recogido. • Es obligatorio el uso de guantes cuando es probable que las manos entren en contacto con materiales infecciosos, superficies o equipos contaminados (puede ser apropiado el uso de dos pares de guantes). Descartar los guantes cuando están contaminados y retirarlos cuando se completa el trabajo con los materiales infecciosos o cuando está comprometida la integridad del guante. Los guantes descartables no se lavan, no se vuelven a usar, ni se utilizan para tocar superficies “limpias” (teclados, teléfonos, picaportes, entre otros), y no se deben usar fuera del laboratorio. • No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar alimentos para uso humano en áreas de trabajo. • Utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos. Las personas que usan lentes de contacto en laboratorios deben también utilizar antiparras o un protector facial. • Lavarse las manos luego de manipular materiales viables, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio. (Ver Anexo I). • Almacenar los alimentos fuera del área de trabajo en gabinetes o refrigeradores designados y utilizados con este único fin. • Está prohibido pipetear con la boca: utilizar dispositivos de pipeteo mecánicos. Aplicar políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes. • Llevar a cabo todos los procedimientos con precaución a fin de minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles. • Descontaminar las superficies de trabajo como mínimo una vez por día, luego de finalizar las tareas y ante todo derrame de material viable. • Descontaminar todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados antes de ser desechados mediante un método aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato son colocados en un recipiente duradero, estanco y cerrado para su transporte desde el laboratorio. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de conformidad con las normas locales, estatales MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 9 �y federales aplicables antes de retirarlos del establecimiento de acuerdo a las indicaciones de la Ley 24.051 de Residuos Peligrosos. • El laboratorio debe tener las hojas de seguridad1 de cada sustancia química que utiliza en formato impreso y capacitar al personal sobre las mismas. Limpieza y desinfección del laboratorio Todo laboratorio debe tener un programa con métodos de limpieza y desinfección bien definidos para disminuir los riesgos de contaminación con materiales peligrosos acorde a las características del lugar y volumen de trabajo. La limpieza de los laboratorios incluye a los equipos, mesas de trabajo, heladeras, freezer, aberturas, etc. Dentro de la limpieza se debe incluir el control de insectos y roedores. Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) El laboratorio debe elaborar un procedimiento de la manipulación, clasificación y descarte de los residuos peligrosos ya que pueden causar daño, directa o indirectamente a seres vivos o contaminar el suelo, el agua, la atmósfera o el ambiente en general. Se consideran residuos patológicos/químicos al material biológico de diversos orígenes que puede no tener características infecciosas pero sí de toxicidad. Un residuo se considera tóxico cuando es capaz de, a determinadas dosis, provocar una acción química o químico-física que cause daño en la salud, luego de estar en contacto con la piel o las mucosas o de haber penetrado en el organismo por cualquier vía. Los residuos serán acumulados en recipientes colocados convenientemente y en cantidad suficiente en el lugar de generación de los mismos. Los mismos se podrán tratar mediante los siguientes métodos: incineración, enterramiento por relleno de seguridad, esterilización por autoclave, ya sea por el mismo laboratorio o por empresas dedicadas a ese fin. Se ajustará a la normativa establecida por la jurisdicción donde se encuentra el laboratorio. Aseguramiento de la calidad en el laboratorio Se debe cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (buenas prácticas de laboratorio), requisitos particulares del Senasa y la Norma ISO/IEC 17025 (última versión vigente) según la categoría del laboratorio. Es un documento que indica las particularidades y propiedades de una determinada sustancia para su uso más adecuado (en inglés, Material Safety Data Sheet o MSDS). El principal objetivo de esta hoja es proteger la integridad física del operador durante la manipulación de la sustancia. Esta hoja o ficha contiene las instrucciones detalladas para su manejo y persigue reducir los riesgos laborales y medioambientales. 1 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 10 �Para que los resultados del diagnóstico sean uniformes, confiables y trazables, deben efectuarse siguiendo técnicas estandarizadas, con operadores capacitados en la realización e interpretación de los resultados, utilizando equipos y reactivos controlados. Los procedimientos de laboratorio están sujetos a múltiples causas de error que deben ser detectados para poder aplicar correcciones o acciones correctivas. Los procedimientos se pueden monitorear mediante controles internos con la utilización diaria de sueros controles internos con títulos conocidos; mientras que el control externo –que se refiere al realizado por un laboratorio de referencia– se puede hacer mediante auditorías que revisen los métodos analíticos, la organización del trabajo del laboratorio y los procedimientos de control de calidad internos implementados. Respecto a la participación en ensayos interlaboratorios, los mismos deben ser provenientes de organismos reconocidos y programas de ensayos de aptitud. Se deben mantener documentados los resultados y, en caso de obtener resultados no satisfactorios, implementar las acciones correctivas pertinentes para su seguimiento y cierre. Del mismo modo podrán utilizarse otras herramientas a los fines de garantizar el desempeño adecuado y asegurar la calidad de los resultados de ensayo, como la confección de gráficos de control2. El control permanente de la calidad de los resultados junto con las buenas prácticas de laboratorio que incluye la utilización de técnicas evaluadas, personal capacitado y operaciones estandarizadas, garantiza el resultado confiable del diagnóstico. Control de calidad de insumos Todos los insumos y reactivos que se utilizan en el laboratorio deben ser establecidos con fórmulas y procedimientos detallados en manuales disponibles en el área de trabajo. La composición, el tipo de envase, la identificación y el lugar de almacenamiento deben ser los indicados en los manuales. No introducir cambios que no estén registrados y autorizados por el responsable del laboratorio. Todos los insumos y materiales de referencia deben cumplir con las especificaciones registradas. 2 Diagrama que sirve para examinar si un proceso se encuentra en una condición estable, o para asegurar que se mantenga en esa condición. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 11 �Los reactivos biológicos que se emplean en las técnicas de ensayo deben utilizarse de acuerdo a las especificaciones del manual de procedimientos operativos correspondiente, respetando las indicaciones para la conservación, almacenamiento y titulación. Los reactivos para el diagnóstico de brucelosis que se comercializan en la República Argentina, deben cumplir la normativa vigente del Senasa y aprobar el control de calidad de cada lote o serie indicado en la estampilla correspondiente. Se debe llevar un registro de cada lote de antígeno/kit que se utiliza con la fecha de uso. En los laboratorios se requiere usar agua con mínimo de impurezas. Los requisitos de calidad o pureza se encuentran establecidos sobre la base de diferentes normas o criterios, dependiendo de las instituciones u organismos internacionales que establecen las referencias. Entre éstas se encuentran la American Society for Testing and Materials (ASTM), British Standards Institution (BSI) y la International Organization for Standardization (ISO). Actualmente están definidos los diferentes niveles de pureza del agua en función de los parámetros físico-químicos, tales como conductividad eléctrica, resistividad, contenido de carbono, oxígeno o sílice. Clasificación del agua de acuerdo a su característica fisicoquímica. Especificaciones según ISO 3696 Parámetros Fisicoquímicos Grado 1 Grado 2 Grado 3 Conductividad eléctrica valor máximo a 25 ºC, µS/cm 0,1 1 5 Resistividad, MΩ 10 1 0,25 Absorbancia (UA a 254 nm) 0,001 0,01 -- Sílice Total valos máximo mg/l 0,01 0,02 1 pH -- -- 5,0 a 7,5 Clasificación de los tipos de agua según NC-ISO 3696: 2004 Grado 1- Exenta básicamente de contaminantes constituidos por iones disueltos o coloidales y materias orgánicas. Es apropiada para los requisitos de análisis más exigentes, incluyendo la cromatografía líquida de alta definición. Se puede preparar por un tratamiento adicional del agua de grado 2 (por ejemplo osmosis inversa o desionización seguida de filtrado a través de una membrana con tamaño de poro de 0,2 µm para separar las partículas, o por redestilación en un aparato de sílice fundido). Grado 2- Con muy pocos contaminantes inorgánicos, orgánicos o coloidales. Es apropiada para análisis delicados, incluyendo la espectrometría de absorción atómica (EAA) y la determinación de componentes en cantidades mínimas. Se puede preparar por destilación múltiple o por desionización u osmosis inversa seguida de destilación. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 12 �Grado 3- Apropiada para la mayoría de los trabajos de química en laboratorios por vía húmeda y la preparación de soluciones de reactivos. Se puede preparar mediante una sola destilación, por desionización o por osmosis inversa. Salvo indicación en contrario, se puede utilizar para el trabajo normal de análisis. Equipos El laboratorio debe tener inventario del equipamiento y un programa de control y mantenimiento de los equipos que emplea en el laboratorio. El equipamiento que afecte la calidad de los resultados de ensayo, debe mantenerse controlado, estipulando dentro de un programa los intervalos de control, calibración /verificación y mantenimiento de los mismos. Sobre la enfermedad3 Brucelosis es el nombre genérico que se aplica a las infecciones–humanas o animales– causadas por distintas especies del género Brucella, principalmente Brucella abortus, B. melitensis y B. suis. La infección del ganado ovino por B. ovis se describe por separado en el Capítulo 3.7.7 Epididimitis ovina (Brucella ovis) del manual de la OMSA. Agente: Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis) El género Brucella forma parte de la familia Brucellaceae, que a su vez forma parte del orden Rhizobiales, en la clase alphaproteobacteria. Presenta una estrecha relación genética con ciertos agentes patógenos de las plantas y simbiontes de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como con agentes patógenos de animales (Bartonella) y bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum). La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes en cuanto al tipo de hospedador y a la epidemiología, así como evidencias moleculares de variaciones genómicas, el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas, Subcomité de Taxonomía de Brucella, adoptó en 2005 una decisión firme sobre el retorno a las posiciones anteriores a 1986 en lo relativo a la taxonomía de Brucella; la consecuencia de ese posicionamiento es la reaprobación de las seis especies de Brucella con sus biovariedades reconocidas. Los nombres clásicos relacionados con las seis especies de Brucella están publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las cepas típicas designadas aparecen asociadas a esos nombres publicados y validados: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las Fuente: Capítulo 3.1.4.- Manual Organización Mundial de Sanidad Animal -OMSA)- versión 2022. 3 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 13 �tres primeras se subdividen en biovariedades por sus características de cultivo y serológicas. En la última década se han aislado cepas de Brucella de mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las especies ya reconocidas. Hay estudios en curso destinados a establecer su posición en la taxonomía de este género y se ha propuesto que podrían clasificarse en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis. Recientemente se ha aislado una nueva cepa, denominada Brucella microti, en el topillo campesino (Microtus arvalis) y en zorros y suelo de Europa Central (Scholz et al., 2008). También se han descrito por primera vez ciertas cepas aisladas de infecciones humanas de implantes mamarios y de pulmón, aunque todavía no está claro cuál es el reservorio natural de las mismas. Si bien solo se han descrito dos cepas de cada nuevo tipo, formalmente se han publicado como décima y onceava especies de Brucella, B. inopinata y B. papionis, respectivamente (Scholz et al., 2010; Whatmore et al., 2014). Por último, las cepas aisladas de roedores, zorros y ranas se han caracterizado como cepas atípicas de Brucella claramente diferenciables de las especies descritas actualmente, pero todavía no se han aprobado como nuevas especies de Brucella. Descripción de la enfermedad Infección por Brucella en ganado bovino La infección por Brucella en el ganado bovino suele estar causada por biovariedades (bv.) de Brucella abortus. En algunos países, sobre todo del sur de Europa, África y Asia occidental, en los que el ganado bovino se cría en estrecha relación con ganado ovino o caprino, la infección también puede deberse a B. melitensis (Verger, 1985). En ocasiones, B. suis puede causar una infección crónica de la glándula mamaria del ganado bovino, pero no se ha observado que cause aborto ni que se transmita a otros animales. La infección por Brucella en ganado bovino se transmite a nivel mundial, pero varios países del norte y centro de Europa, así como Canadá, Japón, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres tanto de B. abortus como de B. melitensis. Esta enfermedad suele ser asintomática en animales de corta edad y en hembras no gestantes. Tras la infección por B. abortus o B. melitensis, las hembras adultas gestantes presentan placentitis, que suele dar lugar a aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto, en la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales producen una profusa excreción del microorganismo. La glándula mamaria y los ganglios linfáticos relacionados también pueden resultar infectados, y es posible que se excreten microorganismos con la leche. Las siguientes gestaciones suelen llegar a término, pero la infección uterina y mamaria reaparece, con cantidades bajas de microorganismos tanto en los productos del parto como en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo se encuentra presente en la mayoría de ganglios linfáticos principales del organismo. Los bovinos machos adultos pueden presentar orquitis/epididimitis y la brucelosis puede ser una causa de infertilidad en ambos sexos. Los higromas, que suelen afectar a las articulaciones de las extremidades, son un signo frecuente en caso de brucelosis en algunos países tropicales y pueden ser el único indicador manifiesto de infección; el líquido de los higromas suele estar infectado por Brucella. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 14 �Infección por Brucella en ovejas y cabras La infección por Brucella en ovejas y cabras (excepto la infección por B. ovis) está causada principalmente por las biovariedades de B. melitensis. En ovejas y cabras se han observado infecciones esporádicas causadas por B. abortus o B. suis, pero estos casos son extremadamente infrecuentes. La infección por Brucella en ovejas y cabras es endémica en la región del Mediterráneo, pero se dan casos en todo el mundo. América del Norte (excepto México) se considera libre del agente, del mismo modo que el norte y el centro de Europa, el sudeste asiático, Australia y Nueva Zelanda. Patológica y epidemiológicamente, la infección por B. melitensis en ovejas y cabras es muy similar a la infección por B. abortus en ganado bovino. En la mayoría de los casos, las vías principales de transmisión de Brucella son la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales expulsadas por las ovejas y cabras infectadas, ya sea al abortar o al parir a término. La expulsión de Brucella también es frecuente en las secreciones de la ubre y en el semen, y puede aislarse Brucella de distintos tejidos, como los ganglios linfáticos de la cabeza, el bazo y los órganos asociados a la reproducción (útero, epidídimo y testículos), así como de lesiones artríticas (Alton et al., 1988). Infección por Brucella en cerdos La infección por Brucella en cerdos está causada principalmente por las biovariedades 1, 2 o 3 de B. suis. En cerdos también se han observado infecciones esporádicas por B. abortus o B. melitensis, pero estos casos son muy infrecuentes. La enfermedad tiene lugar en muchos países en los que se crían cerdos. En general, la prevalencia es baja, pero en algunas regiones, como América del Sur o el sudeste asiático, la prevalencia puede ser mucho más alta. En algunos países, la brucelosis porcina puede ser un problema grave, aunque actualmente no reconocido. Se ha observado infección por la bv 1 de Brucella suis en jabalíes de algunos estados del sur de EE.UU., así como de Queensland (Australia) y de otros países de Oceanía. En estos países, se han documentado varias infecciones humanas en personas que practicaban la caza y manipulaban material obtenido de jabalíes. En general, la enfermedad se transmite por la ingesta de alimento contaminado por productos del parto o de un aborto, o bien por secreciones uterinas. Los cerdos se comen de inmediato los fetos abortados y las membranas fetales. La transmisión durante la cópula también es frecuente, y la excreción de B suis en el semen tiene implicaciones para el personal que lleva a cabo la inseminación artificial. En los cerdos, como en los rumiantes, tras la bacteriemia inicial, B. suis coloniza las células del tracto reproductor de ambos sexos. En las hembras, resultan invadidas la placenta y los fetos, mientras que en los machos la invasión tiene lugar en uno o más de los siguientes tejidos: testículos, próstata, epidídimo, vesículas seminales o glándulas bulbouretrales. En los machos, las lesiones, que suelen ser unilaterales, empiezan con una hiperplasia que puede avanzar a absceso; la fase final se caracteriza por esclerosis y atrofia. Pueden aparecer artritis en varias articulaciones, y a veces tiene lugar una espondilitis. En las cerdas, el signo más frecuente de brucelosis es el aborto en cualquier momento de la gestación, aunque es más habitual entre los días 50 y 110. La secreción vaginal no suele ser evidente y, en los rebaños infecMANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 15 �tados de forma crónica, el signo clínico más relevante es la infertilidad, no el aborto. En los machos, la brucelosis tiene más probabilidades de ser persistente, y ocasiona lesiones en el tracto genital que a menudo dan lugar a una interferencia con la actividad sexual, que puede ser temporal o irreversible. El verraco puede excretar Brucella con el semen sin ninguna anomalía aparente en los órganos sexuales ni interferencia con la actividad sexual. En ambos sexos puede aparecer una tumefacción articular y de las vainas de los tendones, cojera y, en ocasiones, parálisis posterior. Un porcentaje considerable tanto de cerdos como de cerdas se recupera de la infección, a menudo en un plazo máximo de 6 meses, pero muchos quedan infectados de por vida (Olsen et al., 2012). La infección causada por la bv 2 de B. suis difiere de la causada por la bv 1 y la bv 3 en cuanto a la gama de hospedadores, la distribución y la patogenicidad. Históricamente, la distribución geográfica de la bv 2 de B. suis ha sido un amplio territorio situado entre Escandinavia y los Balcanes. La prevalencia en jabalíes parece ser alta en toda Europa continental (EFSA, 2009). En los brotes de Europa, los jabalíes intervienen como fuente de transmisión de la bv 2 a cerdos criados en el exterior, y se consideran el principal reservorio salvaje de esta infección (EFSA, 2009). La bv 2 de Brucella suis causa lesiones miliares, sobre todo en tejidos reproductivos, que a menudo se vuelven purulentas. Hasta la fecha, la bv 2 se ha documentado en muy pocos casos como causa de brucelosis humana. No obstante, sí se han observado infecciones por la bv2 en cazadores con inmunocompromiso que hayan estado excesivamente expuestos debido a prácticas como el destripado y despellejado de jabalíes o liebres. Asimismo, en ganado bovino y ovino de Europa expuesto a jabalíes infectados, se han observado casos, aunque muy infrecuentes, de infección por la bv 2 de B. suis sin signos clínicos. Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio o en libertad Se ha observado infección por B. abortus y B. melitensis en el dromedario (Camelus dromedarius) y en el camello (C. bactrianus), así como en camélidos de América del Sur: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guanicoe) y la vicuña (Vicugne vicugne), y se ha relacionado con el contacto con rumiantes grandes y pequeños infectados por B. abortus y B. melitensis. Asimismo, se ha observado brucelosis en el búfalo doméstico (Bubalus bubalis), el bisonte americano y el europeo (Bison bison y B. bonasus, respectivamente), el yak (Bos grunniens), el elk/wapiti (Cervus elaphus), el búfalo africano (Syncerus caffer) y varias especies de antílopes de África. Los signos clínicos de brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en el ganado bovino, ovino y caprino. La infección por Brucella melitensis en rumiantes salvajes puede tener lugar cuando estas especies se encuentran en estrecho contacto con ovejas y cabras de zonas enzoóticas. Los signos de la brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en bovinos, ovinos y caprinos, pero en varias especies de rumiantes salvajes (como el rebeco [Rupicapra rupicapra], el íbex alpino [Capra ibex] y la cabra ibérica [Capra pyrenaica] salvaje) se ha observado artritis purulenta o calcificada y orquitis, así como uveítis y problemas neurológicos. Estas especies se consideran portadores terminales, que no pueden transmitir la enfermedad, la cual suele desaparecer de forma natural en cuanto la infección por Brucella se ha erradicado del ganado doméstico, a no ser que tengan lugar efectos antropogénicos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 16 �Existen dos tipos distintos de situación epidemiológica respecto a la infección por B. suis en otras especies no porcinas. En el primer caso, la infección por B. suis tiene lugar en animales que no son el hospedador natural de la infección concreta mediante la ingesta de materiales contaminados o por cohabitación con hospedadores naturales infectados. Por ejemplo, zorros y lobos del ártico pueden contraer la bv 4 de B. suis del reno; los perros y los roedores, como ratas o ratones, pueden contraer otras biovariedades de B. suis por cohabitación con hospedadores infectados; y el ganado bovino y los caballos pueden resultar infectados por cohabitación o interacción con porcinos infectados. Las bacterias infectantes pertenecen siempre a las biovariedades definidas de especies hospedadoras naturales. En el segundo caso, los hospedadores naturales de B. suis o microorganismos similares a B. suis son especies salvajes. Un ejemplo es la denominada brucelosis murina de la Comunidad de Estados Independientes (CIS) y los países bálticos, donde pequeños roedores resultan infectados por la bv 5 de B. suis. Una situación similar se ha observado en Australia, donde, a partir de roedores, se han aislado cepas parecidas a B. suis pero con características distintas; finalmente se ha considerado que son distintas de B. suis en función del perfil genético. Además del jabalí, la liebre común europea (Lepus europaeus) también se considera reservorio de la bv 2 de B. suis y se ha observado que interviene como posible fuente de transmisión al ganado doméstico. En la liebre común europea, la enfermedad se caracteriza por la formación de nódulos de tamaños variables comprendidos entre el de una semilla de mijo y el de una cereza o incluso mayor; a menudo se vuelven purulentos. Estos nódulos pueden desarrollarse en casi cualquier lugar, a veces en el tejido subcutáneo o intramuscular, en el bazo, el hígado o los pulmones y en los órganos reproductivos de ambos sexos. La condición corporal de la liebre puede quedar sorprendentemente intacta. Otras especies también pueden resultar infectadas por cohabitación con cerdos, jabalíes o liebres infectados por la bv 2 de B. suis. El destripado o despellejado de jabalíes en explotaciones bovinas podría ser una vía de transmisión al ganado bovino. La bv 4 de Brucella suis causa una zoonosis grave en renos salvajes o domesticados (Rangifer tarandus y sus distintas subespecies) en toda la región del Ártico, incluidos Siberia, Canadá y Alaska. Rangifer tarandus es muy susceptible a la infección por B. suis, que causa fiebre, abatimiento y distintos signos locales, como aborto, retención de placenta, metritis, a veces con secreciones sanguinolentas, mastitis, bursitis y orquitis. La transmisión al ser humano puede tener lugar por contacto directo o por el consumo de leche cruda u otros productos cocidos de manera insuficiente procedentes del reno, especialmente la médula ósea. Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Ciertas especies de Brucella, sobre todo B. melitensis, B. abortus, B. suis –y probablemente en menor medida B. canis– son fácilmente transmisibles al ser humano, en el que causan un proceso febril (fiebre ondulante) que puede avanzar a una forma más crónica y también producir complicaciones graves que afecten a los sistemas músculo esquelético, cardiovascular y al sistema nervioso central. Deben aplicarse medidas de precaución para prevenir la infección humana. La infección se contrae básicamente por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero la ingesta de productos lácteos crudos constituye el principal riesgo para el MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 17 �público general en los lugares en los que la enfermedad es endémica. Existe un riesgo ocupacional en veterinarios, trabajadores de mataderos y ganaderos que manipulen animales/canales infectados y fetos abortados o placentas. La brucelosis también es una de las infecciones de laboratorio más fáciles de contraer, y todas las manipulaciones de laboratorio relacionadas con cultivos vivos o material que pueda estar infectado o contaminado deben realizarse a un nivel de bioseguridad y contención adecuado, que se determinará a partir de un análisis del riesgo biológico. Se han realizado recomendaciones específicas relativas a las precauciones en materia de bioseguridad que deben aplicarse con los materiales infectados por Brucella (se ofrece más información en Alton et al., 1988; Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis, 1986; OMS, 1953; OMS, 2004). Todos los abortos en el ganado deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberían investigarse. El cuadro clínico no es patognomónico, aunque la historia del rebaño puede servir de ayuda. El diagnóstico inequívoco de infecciones por Brucella solo puede hacerse por aislamiento e identificación de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el análisis bacteriológico, el diagnóstico puede basarse en métodos serológicos. Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas No existe una prueba única que permita la identificación de Brucella. Normalmente se necesita una combinación de los métodos serológicos y bacteriológicos. Ninguna prueba serológica aislada es adecuada en todas y cada una de las situaciones epidemiológicas, presentando limitaciones en el análisis de animales individuales. Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del método de prueba y de sus resultados para una aplicación o interpretación diagnóstica específica. Los métodos serológicos que se describen en este manual son métodos estandarizados y validados, con características de realización adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilización de reactivos diferentes. Sin embargo, los métodos y reactivos descritos en esté manual suponen un estándar de comparación respecto a la realización esperada del diagnóstico. Debe resaltarse que la prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de fijación de complemento (FCT) es más específica que la SAT para el diagnóstico y además posee un sistema estandarizado de unidades. Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el análisis las pruebas con antígeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinación tamponada en placa (BPAT), así como el enzimoinmunoensayo (ELISA) y el ensayo de polarización fluorescente (FPA). Las reacciones positivas deben volverse a analizar utilizando una estrategia confirmatoria adecuada. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 18 �En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), camellos (Camelus dromedarius, C.bactrianus) y camélidos sudamericanos, la infección por Brucella sigue un curso similar al del ganado bovino. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serológicos, pero cada uno debe ser validado en el animal estudiado. Tabla 1 Métodos analíticos disponibles para el diagnóstico de infección por Brucella abortus, melitensis o suis (Manual OMSA, 2022). Propósito Método Demostrar ausencia de infección en la población Demostrar ausencia de infección en animales individualesa Contribuir a las políticas de erradicaciónb Confirmar casos clínicos sospechososc Determinar la prevalencia de la infección – vigilancia en el rebaño / manada Determinar el estado inmunitario en animales individuales o en poblaciones tras la vacunación - - Identificación del agente Métodos de tinción - Cultivo PCRd - - + +++ +/++ Detección de la respuesta inmune BBAT (RBT o BPAT) +++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + +++ + +++ +++ + + + + ++ ++ ++ + +++ - +++ ++ +++ +++ ++ ++ + - Pruebas basadas en el NH y proteínas del citosole - - + ++ - - Prueba en leche de tanquef I- ELISA en leche o prueba de anillo en leche +++ - +++ + +++ - FPA CFT I-ELISA C-ELISA BST SAT Clave: +++ = método recomendado; ++ = método adecuado; + = puede utilizarse en ciertas situaciones, pero el costo, la fiabilidad u otros factores limitan su aplicación; - = no adecuado para esta finalidad. PCR = reacción en cadena de la polimerasa; BBAT = pruebas con antígeno tamponado de Brucella (es decir, RBT [rosa de bengala] y BPAT [prueba de aglutinación en placa tamponada]); CFT = fijación de complemento; I- o C-ELISA = enzimoinmunoanálisis indirecto de competición; FPA = prueba de polarización de la fluorescencia; BST = prueba de la brucelina; SAT = prueba de aglutinación en suero; NH = hapteno nativo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 19 �a Solo aplicable a rebaños / manadas, países o zonas libres de la infección por Brucella. b Para aumentar la eficiencia de las políticas de erradicación en rebaños/ manadas, se recomienda combinar pruebas para aumentar la sensibilidad en cuanto al diagnóstico, es decir, al menos dos pruebas serológicas, como BBAT o FPA y CFT o I- ELISA. La sensibilidad aumenta aún más si se aplica simultáneamente serológica y BST. c En zonas de prevalencia baja o casi libres, el valor predictivo de los resultados positivos en las pruebas serológicas puede ser muy bajo. En tales situaciones, para confirmar casos clínicos suele ser necesario identificar el agente causal. En rebaños/manadas infectados, un resultado positivo en cualquier prueba serológica puede considerarse una confirmación de un caso clínico. Todo animal que dé positivo en cualquier prueba debe considerarse infectado, incluso en ausencia de signos clínicos. En zonas de prevalencia baja o casi libres, los resultados positivos aislados pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) o BST. En países o zonas libres, los animales sospechosos son los que dan positivo tanto en una prueba serológica de cribado como en una confirmativa (pruebas en serie) y pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) y/o BST. d Es posible que se obtenga falsos positivos. e En las zonas en las que se practica la vacunación subcutánea con S19 o Rev. 1, esta prueba puede ayudar a diferenciar entre los anticuerpos generados a partir de la vacunación y los generadores a partir de la infección. f Solo ganado lechero. Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red Registro de entrada de muestras Todo laboratorio debe contar con un instructivo o procedimiento de recepción, manejo y rechazo de muestras. Es responsabilidad del veterinario acreditado que envía las muestras asegurarse la correcta identificación, embalaje y documentación que acompaña a las mismas. Los laboratorios deben contar con un registro de entrada de muestras (en papel o software con back- up), en el que figure como mínimo la siguiente información: • Fecha de recepción de muestras. • Cantidad de muestras. • Especie. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 20 �• Fecha de extracción de muestras. • Procedencia: establecimiento, número de Renspa. • Localidad: departamento, partido, provincia. • Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), Senasa. • Motivo del envío: • DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario). • MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica para mantenimiento del estatus). • SAN (Saneamiento de rodeo bajo plan), CSM (Certificado de seronegatividad para el Movimiento). • Control interno (según requerimiento de veterinario acreditado). • Remuestreo, otros. Características y condiciones de las muestras Condiciones de recepción de las muestras: • Sangre entera o suero refrigerados • Suero congelado • Leche para PAL refrigerada (no congelada) • Leche para IELISA refrigerada/congelada • Tubos con identificación clara, de preferencia sobre cinta de papel o similar adherida al tubo; otra opción es la marcación firme e indeleble en el cuerpo del tubo • Planillas/protocolo completas de toma de muestras (Anexo II, Resolución Senasa 67/2019) Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las muestras: • Falta de planillas/protocolo o planillas incompletas de toma de muestras (Anexo II, Resolución Senasa 67/2019) • Falta de la firma del veterinario acreditado en la planilla de extracción, responsable de la toma de muestra • Sangre entera congelada • Leche para PAL congelada, contaminada • Sangre entera o suero, contaminados • Sueros hemolizados • Tubos no identificados • Volumen insuficiente Los laboratorios reconocidos y autorizados deben ser exigentes con la calidad de las muestras a procesar, como así también con la planilla de toma de muestra firmada por el veterinario acreditado actuante que debe acompañar a las muestras. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 21 �Informes de resultados Los informes que elabore el laboratorio deben ser precisos para poder desarrollar adecuadamente las acciones de saneamiento (Ver modelo Anexo I del presente manual). En el informe de resultados debe constar: • Logo del laboratorio/Dirección/Tel./e-mail/ Número de identificación del laboratorio • N.° de protocolo interno • Fecha de extracción de muestras • Fecha de recepción de muestras • Fecha de informe o emisión de resultados • Cantidad de muestras • Especie • Procedencia: establecimiento, número de Renspa • Localidad: Departamento, partido, provincia • Remitente: Veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), Senasa • Motivo del envío: DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario), MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica para mantenimiento del estatus), SAN (Saneamiento de rodeo bajo plan), CSM (Certificado de seronegatividad para el movimiento), control interno (según requerimiento de veterinario acreditado), remuestreo • Columnas con la información del tubo / caravanas / edad / fecha de vacunación / pruebas utilizadas / resultados con los valores obtenidos (SAT-2ME, ELISA, FCT, FPA), valor de corte e interpretación cuando corresponda • Información de los antígenos / kits utilizados • Firma del director técnico del laboratorio • Observaciones • Paginación x de y • Que conste en todas las páginas N.° del protocolo y N.° de Renspa Animales para examinar: Hembras vacunadas mayores de 18 meses y animales no vacunados mayores de 6 meses. Figura 1: Diagrama de diagnóstico serológico de brucelosis en la República Argentina. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 22 �Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Son pruebas tamiz de aglutinación en placa. Se fundamentan en la inhibición de las aglutininas inespecíficas a bajo pH. Detectan anticuerpos IgG y algunos IgM específicos. Desarrollo Materiales: • Micropipetas de10-100 µl. • Gradillas. • Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45 cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa, provista de una placa de vidrio marcada con cuadrados de aproximadamente 4 cm de lado, que se apoya cerca de la parte superior de la caja de manera que pueda quitarse y ponerse fácilmente. • La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente), de la mezcla de suero y antígeno. El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. • Debe colocarse dentro del aglutinoscopio una pequeña cámara húmeda para evitar la evaporación de las muestras. • Mezcladores de acero o plástico. Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 º C). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 ° C). • Vórtex. • Centrífuga. • Timer. Reactivos: • Antígeno BPAT con volumen celular aprox. de 11%. • Antígeno Rosa de Bengala, volumen celular aprox. de 8%. • Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ± 3 ° C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad. • Suero control interno positivo. • Suero control interno negativo. • Cada laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. Ejecución del ensayo de BPAT • Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. • Llevar las muestras de suero y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 º C) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (No usar vórtex). • Colocar sobre el aglutinoscopio (con cámara húmeda), la placa de vidrio (limpia y seca), se recomienda pasar papel absorbente embebido en alcohol 70º de ambos lados de la misma. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 23 �• Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 80 µl de suero, previo mezclado con vórtex. Utilizar un tip o punta de pipeta para cada suero. • Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota del suero, con la precaución de no tocar el suero para no contaminar con el tip el frasco de antígeno. • Mezclar bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno abarcando una superficie circular aproximada de 3 cm de diámetro. • Se retira la placa de vidrio y se imprimen 3 movimientos en forma rotativa hasta homogeneizar la mezcla. • Se coloca la placa sobre el aglutinoscopio con cámara húmeda y se tapa, permaneciendo la luz apagada. • Se efectúa una nueva rotación, pasados 4 minutos. A los 8 minutos, rotando de nuevo la placa y con la luz encendida, se procede a la lectura. Figura 2: Aglutinoscopio. Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala • Colocar la placa de vidrio sobre el aglutinoscopio, como se indicó en la prueba de BPAT. • Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 30 µl de suero. Utilizar un tip para cada suero. • Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota de suero. • Se mezcla bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno, abarcando una superficie circular de aproximadamente 2 cm de diámetro. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 24 �• Se retira la placa de vidrio y se imprimen movimientos en forma rotativa durante 4 minutos a razón de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con rotadores diseñados especialmente. • Finalizados los 4 minutos y rotando la placa sobre la caja de lectura o aglutinoscopio con la luz encendida, se procede a la lectura sobre fondo blanco. En el caso de muestras de sueros caprinos y ovinos, la OMSA recomienda utilizar la prueba de Rosa de Bengala modificado (RBTm), el cual consiste en mezclar 75 µl de suero y 25 µl de antígeno. Lectura a los 4 minutos, como se detalla en la explicación anterior. Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa Las reacciones se clasifican en: POSITIVAS: Cuando se forman grumos, aun siendo finos (no confundir con aglutinaciones inespecíficas producidos por impurezas, hemólisis, etc.). Estas muestras deben someterse a las pruebas confirmatorias de SAT / 2-ME, FPA, ELISA o FCT. NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos. Estas muestras se informan como negativas y no se realizan las pruebas complementarias. + - + Figura 3: Lectura BPAT/RBT - Informes de resultados Se aceptan las siguientes expresiones de resultados en las planillas: Positivo Negativo + - POS NEG P N MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 25 �Criterios de aceptación del resultado En paralelo a las muestras problema se dispensan los sueros controles internos negativos y positivos. Para aceptar los resultados, ambos controles deben arrojar la lectura correspondiente. Si los controles no arrojan la lectura esperada, se deben revisar las posibles causas, calidad de los sueros controles, antígeno, calibración de pipetas, etc. Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) Las pruebas de seroaglutinación detectan la presencia de los anticuerpos IgM e IgG. Los anticuerpos IgM aglutinan más intensamente que los IgG ya que, al ser las moléculas pentavalentes, poseen un mayor número de sitios de unión. El título de un suero se determina por la inversa de la dilución más alta que causa un determinado grado de aglutinación y se expresa en unidades que corresponden al recíproco de esa dilución. La prueba de 2-mercaptoethanol (2-ME) es una prueba selectiva que detecta solamente la presencia de IgG, se basa en que los anticuerpos IgM, con configuración de pentámero, se degradan en cinco subunidades semejantes por la reducción de enlaces disulfuro, debido a la acción de ciertos compuestos que contienen el radical tiol, tales como el 2-mercaptoethanol. Estas subunidades conservan sus características de antigenicidad, pero pierden la actividad de anticuerpo plurivalente y se comportan como univalentes. Aun cuando las subunidades están integradas por dos cadenas pesadas y dos livianas, al combinarse con el antígeno no originan complejos suficientemente grandes como para aglutinar, probablemente como consecuencia de algún impedimento estérico. Las moléculas de IgG, en cambio, no sufren un efecto obvio que altere su actividad para dar reacciones objetivas como la aglutinación. La prueba se usa, por lo tanto, como evidencia presuntiva de la presencia de anticuerpos de la clase IgG. Desarrollo Materiales: • Micropipetas de10-100 µl. • Gradillas. • Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45 cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa. La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente). El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. • Tubos de serología: tipo Wasserman de 13 por 100 mm o tubos de Khan de vidrio. • Probetas (100 ml y 1000 ml). • Pipetas 1, 2, 5 y 10ml. • Recipientes de vidrio de volúmenes variados. • Propipetas. • Dispensador automático o pipetas graduadas de 1-10 ml. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 26 �Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 °C). • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Balanza. • Vórtex. • Centrífuga. • Timer. • Termómetro calibrado. Reactivos: 1. Antígeno SAT, volumen celular aprox.4.5%.4 2. Suero control interno positivo. 3. Suero control interno negativo. Cada laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo (determinar el título) y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. Drogas y soluciones5: • Cloruro de sodio p.a. • Fenol p.a. • 2-mercaptoethanol p.a. • Solución salina al 0,85 %. • Solución salina fenolada al 0,5 %. Ejecución del ensayo Ambas pruebas (SAT y 2-ME) se realizan simultáneamente procediendo de la siguiente manera: • Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. • Llevar las muestras de suero y de antígeno a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC al menos una hora antes de la ejecución del ensayo. • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos de 10 minutos (no usar vórtex). • Por cada muestra de suero problema positivo a BPAT, colocar en una gradilla 1 hilera de 8 tubos de 13 x 100 mm o tubos de Khan. Identificar la gradilla con el número de protocolo. • Identificar el primer tubo de cada hilera con el número correspondiente al suero problema. En los primeros 4 tubos se realiza la prueba de SAT; se deja un espacio libre y en los 4 tubos siguientes de la misma hilera, se realiza la prueba de 2-ME. • Por cada muestra de suero debidamente identificada, se utilizan tubos en los cuales se dispensa con micropipeta 80 µl de suero en el fondo del primer tubo, 40 µl se distribuyen en el segundo tubo, 20 µl en el tercero y 10 µl en el cuarto. • Repetir el procedimiento descripto para depositar las mismas cantidades de suero en los tubos de 2-ME. 4 Conservar el antígeno en la heladera a 5 ± 3 ° C. No se debe congelar porque esto lo inutiliza al modificar la sensibilidad. 5 Tener copia impresa de la hoja de seguridad de cada droga. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 27 �• Incluir un suero control interno positivo (título conocido) y negativo, además de un control de soluciones y antígeno sin suero. • Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución de 2-ME (0,1 M) en cada tubo de este grupo y mezclar muy bien agitando la gradilla. • Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución salina fenolada al 0,5 % a cada uno de los tubos del grupo de SAT. • Dejar las gradillas con las mezclas durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC y, posteriormente, dispensar a cada tubo 1 ml de antígeno de SAT diluido al 2 % (0,09 % de brucelas) en solución salina 0,85 %. • Mezclar bien agitando la gradilla y llevar a estufa. Consideraciones generales: • Las muestras que resulten positivas a BPAT o RBT deben confirmarse por las técnicas de SAT y 2-mercaptoethanol, ELISA, FPA o FCT. • La existencia de hemólisis excluye el empleo del método de tubo y placa. La presencia de hemólisis en las muestras de suero interfiere en la prueba de aglutinación en tubo, no solo porque la coloración puede enmascarar la reacción de aglutinación, sino porque se forma un precipitado como resultado de la acción del fenol que contiene la solución de antígeno sobre la hemoglobina libre. Es muy difícil distinguir esta falsa reacción de la aglutinación específica de la unión antígeno-anticuerpo. Incubación La incubación se realiza a 37 ± 2 ºC durante 40-48 horas y tiene por objeto obtener en el tiempo más corto posible el máximo de aglutinación. Se recomienda tomar y registrar las temperaturas máximas y mínimas de la estufa durante el transcurso de las 40-48 horas de la incubación, para verificar la estabilidad de la estufa. Lectura e interpretación de resultados Una vez finalizada la incubación de las muestras, se realiza la lectura de las pruebas contra el fondo negro opaco de la caja de lectura o aglutinoscopio, iluminada desde atrás con una fuerte luz que atraviese los tubos. La aglutinación del complejo antígeno-anticuerpo bajo la forma de grumos y su depósito en el fondo del tubo por gravedad determina la clarificación de la columna de líquido en el tubo; después de una leve agitación del tubo, se mantienen los grumos firmes. La aglutinación es el resultado directo de la unión específica de los anticuerpos presentes en el suero, con las Brucellas inactivadas contenidas en el antígeno. Las determinaciones se deben basar tanto en la claridad/turbidez de las MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 28 �mezclas como en el grado de aglutinación y la firmeza de los grumos al agitar suavemente el tubo. El título se determina por la inversa de la dilución más alta donde se observa aglutinación en el tubo, en el que se presenta una disminución evidente de la turbidez y los grumos firmes se mantienen a pesar de una agitación leve. Si esto ocurre, por ejemplo, en los 3 primeros tubos solamente, el título del suero (recíproco de la dilución) es de 100 UI / ml de aglutinación en SAT o en 2-ME. El grado de aglutinación en cada una de las distintas diluciones puede clasificarse como completo (+), incompleto (I) o negativo (-). • Aglutinación completa es aquella en que el líquido de la mezcla suero-antígeno aparece límpido, translúcido y la agitación suave no rompe los grumos. • Aglutinación incompleta es la que muestra la mezcla suero-antígeno parcialmente turbia y una suave agitación no rompe los grumos. • Negativa es aquella en que la mezcla suero-antígeno no evidencia aglutinación, la columna líquida aparece turbia y una suave agitación no revela grumos. Fenómeno de zona En ciertas ocasiones, puede ocurrir que se encuentre aglutinación en las diluciones más altas, pero no en las diluciones más bajas. Esta inhibición de la aglutinación en las diluciones bajas es llamada “fenómeno de zona” y está asociado a un exceso en la concentración de anticuerpos en el suero en las diluciones más bajas, lo que provoca una aglutinación no visible por estar fuera de la zona de equivalencia de la unión antígeno-anticuerpo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 29 �Figura 4: Esquema Prueba simultánea de SAT y 2-ME. Informes de resultados Ejemplo: Negativo Neg I 25 25 1/25 I: Incompleto Tabla 2 Interpretación de los resultados para hembras bovinas mayores de 18 meses de edad vacunadas con Brucella abortus cepa 19 entre los 3 a 8 meses de edad BPAT SAT 2-ME INTERPRETACIÓN - NH * NH NEGATIVO + ≤ 50 - NEGATIVO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - SOSPECHOSO + I 200 - SOSPECHOSO + 200 - POSITIVO + 25 a 50 I 25 NEGATIVO + ≤ 25 ≤ 25 NEGATIVO + ≥ I 50 ≥ I 50 POSITIVO * NH: No se hace MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 30 �Tabla 3 Interpretación de los resultados para animales no vacunados (bovinos y otras especies) mayores de 6 meses de edad BPAT SAT 2-ME INTERPRETACIÓN - NH NH NEGATIVO + 25 - NEGATIVO + I 50 - SOSPECHOSO + 50 - SOSPECHOSO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - POSITIVO + 200 - POSITIVO + ≥ 25 ≥ 25 POSITIVO Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME Solución salina 0,14 m • Cloruro de sodio 8,5 g • Agua destilada 1000 ml Solución salina fenolada Solución salina 0,14 M con la adición de 0,5 % de fenol. Conservar a temperatura ambiente por un plazo de 30 días. Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. Solución 2-ME 0,1 m • 2-Mercaptoethanol 7,8 ml • Solución salina 0,14 M. 992,2 ml Importante: no utilizar solución salina fenolada El 2-mercaptoethanol es sensible a la luz y al calor y se deteriora rápidamente por exposición al aire. Se debe conservar en frasco color ámbar herméticamente cerrado a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC). Leer detenidamente la hoja de seguridad. Evitar la inhalación, manipularlo en lo posible con máscara de gases o en cabina de extracción. Nunca pipetear con la boca. La solución de 2-mercaptoethanol ya preparada se puede conservar por una semana a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC). Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. • Solución de antígeno SAT (wright) al 2 % • Solución salina 0,14 M (no utilizar solución salina fenolada) 98 ml • Antígeno SAT (wright) (4,5 %) 2 ml MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 31 �La solución de antígeno al 2 % se puede conservar por una semana en heladera (5 ± 3 ºC). Descartar toda aquella solución que presente turbidez o signos de contaminación. Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos La prueba se diseñó para detectar la presencia de anticuerpos en leche de bovinos. Estos anticuerpos reaccionan con el antígeno coloreado con hematoxilina formando un complejo antígeno anticuerpo que queda adherido a la superficie de los glóbulos grasos y asciende con ellos a la superficie, de esta manera forma una capa o anillo de crema de color púrpura azulada, de intensidad variable según el grado de la reacción. Paralelamente, desaparece parcial o totalmente la tinción de la columna de leche. Si la muestra no contiene anticuerpos específicos, el antígeno no se fijará a los glóbulos grasos y permanecerá uniformemente distribuido, coloreando la columna de leche, mientras que la capa de crema forma un anillo de color blanco natural. Esta prueba se usa especialmente como diagnóstico presuntivo para detectar rebaños infectados. También se emplea en la vigilancia epidemiológica en áreas de control de la brucelosis. El porcentaje de grasa de la muestra influye en la prueba, ya que la formación del anillo de crema en la superficie dependerá del tenor graso. Los animales de rebaños positivos a la prueba de anillo en leche deben ser examinados por las pruebas serológicas para identificar aquellos infectados. Desarrollo Materiales: • Tubos de serología: tipo Wassermann de 13 mm por 100 mm, o tubos de Khan de vidrio claro y completamente limpio. • Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml. • Micropipetas de 10 a 100 µl y 1 ml. • Gradillas. • Timer. Equipos: • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Termómetro calibrado. Reactivos: • Antígeno PAL con volumen celular aprox.4 %. • Conservar el antígeno en la heladera a 5 ± 3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad. • Muestras de leche refrigerada (no congelada). • Solución de formalina 1 %. • Muestras de leche controles positivo y negativo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 32 �Ejecución del ensayo Las muestras de leche se deben mantener en refrigeración a una temperatura de 5 ± 3 ºC hasta que hayan transcurrido no menos de 24 horas desde su recolección (preferiblemente, 48 a 72 horas). No deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitación violenta ni conservadas durante más de 72 horas. • Llevar las muestras de leche y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 º C) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente (tubo o frasco). • Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (no usar vórtex). • Colocar 1 ml de la muestra en un tubo de vidrio 13 x 100 mm o tubo de Khan. La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mínimo de 25 mm. • Agregar 30 µl de antígeno a cada tubo. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces, sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno sobre las paredes. • Incubar en estufa a 37 ± 2 º C, durante una hora. Lectura - Anillo de crema, blanco; columna de leche, azul. + Anillo de crema y columna de crema, del mismo color, o casi igual. ++ Anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche. +++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche tiene aún un poco de color. ++++ Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche es blanca. Cualquier grado de + debe interpretarse como positivo. Observaciones • El exceso o la escasez de crema dificultan la interpretación de la prueba. También, la agitación vigorosa dificulta su realización. • El calentamiento de la leche interfiere con los resultados; por lo tanto, la prueba no se puede efectuar con leches pasteurizadas. • Cuando la prueba se efectúa el mismo día en que se ha recolectando la leche, se pueden obtener algunos resultados falsos positivos o dudosos. • La leche de calostro puede dar resultados falsos positivos. • La leche de vacas con mastitis también puede dar falsos positivos o impedir la interpretación de la prueba debido al descoloramiento del antígeno. • La leche de vacas próximas a secarse puede dar resultados dudosos o falsos positivos. • Hay vacas infectadas con Brucella que no eliminan anticuerpos por la leche. Estas vacas son positivas en las pruebas de sangre y negativas en la prueba del anillo. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 33 �Modificación de la prueba para tanques muy grandes Para hacer más sensible la prueba, aumentar la cantidad de leche manteniendo constante la cantidad del antígeno (30 µl). Cuando se ajusta la PAL para aplicarla a rebaños de gran tamaño (2 o 3 ml de leche), se añaden 0,1 ml de una mezcla de crema negativa no pasteurizada al tubo de ensayo y, a continuación, 30 µl del antígeno de la prueba del anillo. Después de mezclar, la prueba se incuba y se lee de la misma forma que para la PAL no ajustada. La mezcla de crema negativa se recoge mediante la separación de la leche compuesta por varias muestras y sin pasteurizar correspondiente a un rebaño de 25 o más vacas que sean negativas a brucelosis. < 150 vacas 1 ml de leche 150 – 450 vacas 2 ml de leche 451- 700 vacas 3 ml de leche Figura 5: Prueba de vigilancia epidemiológica para muestras de pool de leche. Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) Se realiza siguiendo el protocolo de los kits comerciales validados y aprobados para el diagnóstico oficial de la brucelosis en la República Argentina con el valor de corte establecido por el Senasa. El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un método empleado habitualmente para la detección o cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se encuentran en concentraciones muy bajas. El método combina la especificidad de unión de los anticuerpos con la amplificación de “señal” que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. En la práctica clínica es la técnica inmunológica más empleada. Se utiliza para cuantificar, entre otras cosas, MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 34 �hormonas, marcadores tumorales, para determinar la presencia de antígenos microbianos y para la determinación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos totales o frente a algún antígeno en particular. Etapas Previo al inicio de la ejecución del ensayo, equilibrar todos los componentes del kit a temperatura del laboratorio. 1. Adición en cada pocillo de los controles y sueros/leche problemas en la dilución indicada en el protocolo, de tal forma que si hay presencia de anticuerpos, estos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. 2. Incubación. 3. Lavado para eliminar los anticuerpos que no se hayan pegado al antígeno o uniones inespecíficas. Es importante que la placa no se seque, lo que podría incrementar la actividad inespecífica del ensayo. 4. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima (generalmente anti IgG de especie), los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. 5. Incubación. 6. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados (conjugado) que no hayan reaccionado. 7. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 8. Adición de la solución de frenado. 9. Lectura colorimétrica de la placa. Figura 6: Esquema ELISA indirecto. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 35 �Desarrollo Materiales y equipamiento: • Lector de placas automático con filtros (405 nm, 414 nm, 450 nm). • Computadora. • Agitador orbital de placas. • Lavador manual o automático de placas. • Heladera (5 ± 3 º C) y freezer (-20 ± 5 ºC). • Estufa de incubación (37 ± 2 ºC). • Vórtex. • Sistema purificador de agua (mínima calidad de agua requerida: destilada o desionizada). • Micropipetas monocanal de volumen variable (0,5 –10 µl, 5 - 50 µl, 50 -200 µl, 200 - 1000 µl). • Micropipetas multicanal de volumen variable (5 - 50 µl, 30 -300 µl). • Propipetas. • Dispensadores automáticos. • Timer. • Selladores de placas de acetato o parafilm. • Cubetas plásticas para pipetas multicanales. • Microtubos (para realizar las diluciones previas de los sueros), tubos o placas fondo en U. • Criotubos de polipropileno para el almacenamiento de los sueros. • Gradillas. • Material de vidrio (probetas, pipetas, erlenmeyers, etc., de distintos volúmenes). • Toallas o papel absorbente. Reactivos: Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el Senasa y contienen: • Buffer de lavado • Buffer de dilución • Conjugado • Sustrato cromógeno • Solución de frenado • Sueros controles • Placas o tiras de 8 pocillos con el Ag pegado MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 36 �Precauciones para tener en cuenta al ejecutar la técnica de Elisa: • Seguir expresamente las instrucciones del kit para la preparación de todos los reactivos. • Ambientar los reactivos del kit a temperatura ambiente por lo menos una hora antes de su utilización. • No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes lotes o kits. • Evitar cualquier contaminación de los reactivos. • No utilizar los kits una vez superada la fecha de caducidad. • Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra y reactivo. • Utilizar agua desionizada o destilada para la preparación / dilución de los reactivos que se empleen en el ensayo. • Corroborar que el lector de placas posee el filtro con el cual se debe leer la placa y seguir las instrucciones de uso del equipo. • Se recomienda trabajar las muestras por duplicado, para verificar la repetibilidad del operador. • Incluir sistemáticamente un control positivo y un control negativo siempre que se utilice el kit. • El sustrato es extremadamente sensible a la luz y a las contaminaciones, por lo que, se recomienda retirar del frasco únicamente el volumen que se vaya a utilizar y nunca devolver el sustrato sobrante al frasco original. • La solución de frenado es un ácido fuerte. En caso de contacto con la piel lavar inmediatamente con abundante agua. Figura 7: Placa de Elisa. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 37 �ELISA por competición / bloqueo La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS-l) de Brucella sobre una matriz sólida (microplaca de 96 pocillos). A continuación, se añade la dilución de los sueros y el anticuerpo monoclonal, específico para un epitope de la cadena O del LPS-l. Se mezclan los dos junto con el antígeno adherido y se dejan incubar. Después de la incubación, se lava la microplaca y a continuación se añade el conjugado de anticuerpo antimonocolonal conjugado con enzima. Es importante mencionar que el anticuerpo del conjugado ha sido previamente adsorbido con suero normal (no infectado) de bovino, equino y humano para reducir las reacciones inespecíficas entre especies. La etapa final de la prueba es la adición de la solución substrato/cromógeno. Después de un periodo de tiempo fijo, se frena la reacción y se mide fotométricamente. Entre cada uno de los pasos del ensayo la placa debe ser lavada debidamente. En la ausencia de anticuerpos anti Brucella en los sueros problemas (sueros negativos), el anticuerpo monoclonal se liga con el epitope de la cadena O del LPS-l, lo cual es indicado en la prueba por el desarrollo de color. En el caso que el suero problema contenga anticuerpos anti Brucella (suero positivo), estos compiten con el anticuerpo monoclonal por sitios del epitope e inhiben el enlace del anticuerpo monoclonal con la porción de cadena O del LPS-l, manifestándose por la ausencia de color en el ensayo. Los sueros con anticuerpos posvacunales por B. abortus cepa 19 compiten en menor grado con el anticuerpo monoclonal porque su afinidad, especificidad y concentración es baja, lo que usualmente resulta en una reacción negativa (excepto los animales vacunados en los tres meses anteriores al sangrado). Diversos CELISA/bloqueo comerciales se encuentran disponibles en el mercado. En el caso del Elisa de bloqueo, sobre las placas con el LPS de Brucella abortus pegado, se depositan las muestras de suero, las cuales en el caso de contener anticuerpos específicos se unirán al antígeno. Tras eliminar el material no unido mediante lavados, se añade el anticuerpo monoclonal específico del LPS (epítope C) conjugado con una enzima. En el caso de que las muestras contengan anticuerpos frente a LPS, estos no permitirán la unión del conjugado, mientras que, si las muestras no contienen este tipo de anticuerpos, el conjugado se unirá libremente al antígeno de la placa. Tras sucesivos lavados para eliminar el material no unido, podremos revelar las reacciones acontecidas en la placa mediante la adición del sustrato adecuado, el cual desarrollará una reacción colorimétrica en presencia de la enzima (es decir en presencia del monoclonal conjugado con enzima). De este modo la aparición de una reacción coloreada, indicará que la muestra evaluada no contiene anticuerpos específicos del LPS de Brucella spp. y la ausencia de color indicará que la muestra es positiva y contiene dichos anticuerpos. Desarrollo Materiales y equipamiento, reactivos, cuidados y precauciones, manejo y conservación de las muestras: Idem Elisa indirecto. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 38 �Figura 8: CELISA. Tabla 4 Guía de problemas y soluciones en la técnica de ELISA Señal Posible causa Solución 1. Error de pipeteo 2. Falta de mezcla de reactivos 3. Falta de lavados Práctica Mejorar técnica Precaución 1. Se omitió el substrato 2. Concentración substrato errónea Revisar Revisar 3. Conjugado muy diluido 4. Se omitió el conjugado Revisar Revisar Color parejo en toda la placa 1. Conjugado muy concentrado 2. Falla en el lavado 3. Substrato contaminado Controlar Mejorar técnica Revisar Elevado color de fondo “background” 1. Reacción inespecífica 2. Material de vidrio sucio 3. Agua de mala calidad Cambiar solución de lavado Mejorar lavado Controlar calidad Desarrollo de color muy rápido 1. Substrato muy concentrado 2. Conjugado muy concentrado Revisar Controlar dilución Desarrollo de color muy lento 1. Substrato muy diluido 2. Conjugado muy diluido 3. Concentración cromógeno errónea Revisar Revisar dilución Revisar Efecto borde 1. Incubación despareja 2. Resecación por aire 3. Tampón de lavado residual Utilizar estufa Mantener la placa cubierta Eliminarlo Color irregular No hay color MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 39 �Figura 9: Modelo de protocolo de Trabajo ELISA. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 40 �Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos contra brucella en suero El ensayo de polarización fluorescente (FPA) para la detección de anticuerpos contra Brucella tiene la capacidad de ser una prueba multiespecies, lo que permite el diagnóstico presuntivo en bovinos, porcinos, caprinos, ovinos, ciervos y bisontes. Este ensayo, validado para bovinos, tiene la capacidad de distinguir animales infectados con Brucella de los animales vacunados con B. abortus cepa 19 a partir de los 3 meses posvacunación aproximadamente, y de los animales con reacción cruzada con bacterias gramnegativas en más del 90% de los casos. A diferencia de los enzimoinimunoensayos, el FPA es un ensayo homogéneo que no requiere la necesidad de varias etapas de lavado. Los reactivos son agregados secuencialmente en solución y el tiempo total de la prueba no excede los 5 minutos para cada muestra. En resumen, la prueba involucra la adición de una determinada cantidad de suero a una solución tampón de dilución en un tubo de vidrio. A continuación, la muestra es equilibrada por aproximadamente cinco minutos, posteriormente se realiza una primera lectura en el analizador fluorescente para obtener una lectura blanco de referencia (autofluorescente). A continuación, el antígeno conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) es agregado a la solución y luego la muestra es equilibrada nuevamente por un mínimo de dos minutos para permitir que el antígeno y el anticuerpo interactúen. La muestra es leída nuevamente en el polarizador. Si anticuerpos específicos contra Brucella están presente (suero positivo), el resultado será un valor alto de unidades de mili polarización (mP). En ausencia de anticuerpos anti Brucella (suero negativo), el resultado es un valor bajo en mP. El valor de corte para distintas especies animales para la República Argentina se ha determinado en: Bovinos: • Animales negativos: < 94 mP. • Animales sospechosos: Los valores entre 94 mP y 104 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 105 mP. Caprinos y porcinos: • Animales negativos: < 85 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 85 mP. Ovinos (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis): • Animales negativos: < 80 mP. • Animales sospechosos: Los valores entre 80 mP y 90 mP. • Animales positivos: valores igual o mayor a 91 mP. Se modifica el valor de corte en la especie ovina (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis) con una sensibilidad del 97 % y una especificidad del 95 %. Programa GraphPad Prism. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 41 �Desarrollo Materiales y equipamiento: • Lector de polarización fluorescente. • Vórtex. • Micropipetas monocanal de volumen variable (0,1– 10 µl, 20 –200 µl, 200– 1000 µl). • Heladera (5 ± 3 º C) y freezer (-20 ± 5 º C). • Tubos de vidrio: Tubos de borisilicato de 10 x 75 mm. • Material de vidrio. • Termómetro de temperatura ambiental. • Computadora e impresora. Reactivos: Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el Senasa e incluyen: • Buffer de dilución. • Sueros controles positivo y negativo. • Antígeno marcado con isotiocionato de fluoresceína. Ejecución del ensayo Preparación de los reactivos Se deben seguir las instrucciones del prospecto que acompaña al kit comercial. Preparación del equipamiento/instrumentos El usuario debe leer el manual de instrucciones y familiarizarse con los controles de los instrumentos, calibración y la solución de los problemas de todos los equipos previos a la ejecución del ensayo. Preparación de la prueba En el día de la prueba preparar y analizar los sueros controles, siguiendo con lo especificado en los puntos indicados a continuación. Si el valor de mP de los sueros controles no se ajusta dentro de los límites especificados, el ensayo debe ser rechazado. Dejar a temperatura ambiente los reactivos, sueros controles y problemas por lo menos dos (2) horas antes de su uso. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo. Encender el equipo y seguir las instrucciones de uso: • Para bovinos dispensar 990 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). • Dispensar 10 µl de suero bovino (dilución 1/100) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex evitando la formación de espuma. • Para porcinos y caprinos dispensar 960 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). • Dispensar 40 µl de suero porcino o caprino (dilución 1/25) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex. • Para ovinos (B. melitensis) dispensar 975 µl de la solución tampón de dilución de sueros. • Dispensar 25 µl de suero ovino (dilución 1/40). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 42 �• Esperar como mínimo cinco minutos a que la solución suero-Buffer se estabilice. • Continuado el período de equilibración, realizar la lectura blanco de las muestras. • Dispensar 10 µl de antígeno conjugado con FITC determinado en cada tubo y mezclar bien con vórtex. Es importante evitar la formación de espuma en la muestra. En caso de que el suero se vea contaminado con partículas en suspensión, dejar el suero equilibrarse por lo menos 10 minutos para asegurarse que estas partículas hayan sedimentado o centrifugar el mismo. Las partículas inespecíficas pueden interferir con la lectura de la muestra dado que la misma se basa en el peso molecular de las partículas en suspensión. • Dejar que la muestra y el antígeno se equilibren por lo menos por dos minutos. • Leer las muestras exactamente en el mismo orden que fueron blanqueadas. Figura 10: Esquema ensayo de polarización fluorescente. Lectura e interpretación Los sueros controles del ensayo deben estar dentro de los límites especificados por el fabricante del kit utilizado según el control de calidad desarrollados durante la estandarización, optimización e implementación del ensayo. Los resultados de los sueros controles y problemas son expresados en unidades de mili polarización (mP) de la actividad del suero contra el antígeno. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo. Aceptación de los controles Si los valores de mP de los sueros controles están fuera de los límites especificados, la prueba será rechazada y los controles y las muestras deben ser repetidas. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 43 �Fijación de complemento La fijación del complemento (FCT) es la prueba de referencia internacional para el diagnóstico serológico de la brucelosis bovina, ovina y caprina. La prueba permite la detección y cuantificación relativa de los anticuerpos específicos antibrucélicos “capaces de fijar” el complemento (IgG1 y algunas IgM específica), cuya presencia en determinados niveles posee una gran correlación con el estado de “Animal infectado”. La FCT es una prueba confirmatoria ampliamente usada y aceptada pese a la complejidad de su realización y a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y mantener los reactivos adecuadamente. La técnica se desarrolla en dos etapas: en la primera, el antígeno y el suero problema (cuyo complemento se destruyó previamente por calentamiento a baño maría) se incuba en presencia de complemento de cobayo. Después de dejar reaccionar la mezcla de reactivos, se mide en la segunda etapa la cantidad de complemento libre (que indica la ausencia o presencia de anticuerpos antibrucelares en suero y su cantidad) mediante la incorporación de un “sistema indicador” o “sistema hemolítico” formado por eritrocitos de carneros recubiertos de anticuerpos de conejo (hemolisina) como complejo antígeno-anticuerpo alternativo. La presencia de anticuerpos en el suero problema induce la formación de inmunocomplejos en la primera etapa de la reacción que determina la activación del sistema complemento y el agotamiento de sus factores. En la segunda etapa de la reacción no existe complemento libre que pueda activarse ante la presencia del “sistema hemolítico”. El resultado es la ausencia de hemólisis (resultado positivo). Alternativamente, la lisis de los eritrocitos (hemólisis) es indicadora de la existencia de complemento libre en la segunda etapa de la reacción, que no se agotó en la primera por no haberse formado inmunocomplejos ante la ausencia de anticuerpos antibrucelares (resultado negativo). Se han propuesto varios métodos para FCT que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (GR) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al 2 %, 2,5 % o al 3 %). Los GR están sensibilizados con un volumen igual de suero anti-GR de conejo diluido (hemolisina) hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentración mínima necesaria para producir un 100 % de lisis de los GR en presencia de soluciones titulada de complemento de cobayo. Desarrollo Materiales: • Tubos de ensayo. • Material de vidrio de volúmenes varios. • Gradillas. • Film para cubrir placas. • Puntas de pipetas (tips). • Placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U. • Cubetas o reservorios de plástico para reactivos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 44 �Equipos: • Pipetas monocanales con rangos de 2 µl a 20 µl, 20 µl a 200 µl y 500 µl a 5000 µl. • Pipetas multicanales de rango 20 µl a 200 µl. • Centrífuga. • Centrífuga de placas. • Estufa con temperatura controlada (37 ± 2 ºC). • Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 °C). • Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5 °C). • Agitador de microplacas. • Vórtex. • Baño térmico. • Espectrofotómetro. Reactivos: • Solución buffer: Ver Anexo FCT I Solución GR 2%: ver Anexo FCT II Titulación Hemolisina: Ver Anexo FCT III Sistema hemolítico Anexo FCT IV • Titulación Complemento: Ver Anexo FCT V Titulación Antígeno: Ver Anexo FCT VI Sueros controles: • Suero control positivo bovino. • Suero control negativo bovino. Manejo y conservación de las muestras • Conservar los sueros en heladera (5 ± 3 º C) no más de dos días, para períodos mayores, conservarlos a –20 ± 5 º C. • Evitar repetidos ciclos de congelamiento/ descongelamiento. • No usar sueros contaminados, que presenten precipitados o intensa hemólisis. • Homogeneizar con el uso de vórtex los sueros antes de usarlos. Inactivación de los sueros Los sueros controles y las muestras de suero se inactivan 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2 ºC para eliminar el complemento natural contenido en las mismas. La temperatura del baño termostático se controla mediante la introducción de un termómetro certificado en el agua durante todo el tiempo de exposición de las muestras. - Los sueros ovinos se inactivan por 30 minutos en baño termostático entre 60 - 63 °C (en caso de que los sueros sean anticomplementarios, se recomienda realizar otro ciclo de inactivación de 30 minutos). - Las muestras podrán ser sumergidas en el baño termostático en tubos de ensayo tapados herméticamente, contenidos en gradillas, debidamente identificados. Volumen de suero sugerido para inactivar: 200 µl. - La inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del análisis. En este caso, una vez retiradas del baño termostático se dejan a tem- MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 45 �peratura ambiente durante al menos 30 minutos para luego conservar en heladera. Si el análisis se realiza después de las 24 horas, las muestras ya inactivadas se conservan a -20 ± 5 ºC. Condiciones del ensayo El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37 ± 2 º C) y se utilizan los siguientes reactivos en volúmenes de 25 µl: a. Diluciones en base 2, a partir de 1/2 de los sueros problemas en SB. b. Solución de complemento de cobayo en SB que contenga 2 UC (100 %). c. Solución de antígeno en SB a la dilución de trabajo. d. Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales, de una solución de suero hemolítico en SB que contenga 2UH (100 %) y de una suspensión de glóbulo rojos de carnero en SB al 2 %. Ejecución Dependiendo del número de muestras que se realizarán, se podrán incluir los controles en la misma placa o utilizar una placa para los sueros y otra para los controles. Dilución de las muestras de suero El procedimiento de dilución se realiza de forma general en placa fondo en U, mediante la utilización de volúmenes de 25 μl. La secuencia de operaciones se detalla en la tabla 1. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 Suero 25 µl 25 µl de la dilución 1/2 25 µl de la dilución 1/4 25 µl de la dilución 1/8 25 µl de la dilución 1/16 25 µl de la dilución 1/32 25 µl de la dilución 1/64 25 µl de la dilución 1/128 SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25µl Sueros controles Control positivo: El procedimiento de dilución se realiza mediante la utilización de volúmenes de 25 μl, siguiendo la secuencia de operaciones que se detalla en la tabla 2. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 2 1/12,5 1/25 Suero positivo 01/05 25 µl SB - 25 µl 25 µl 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 25 µl de la dilución 1/25 25 µl de la dilución 1/50 25 µl de la dilución 1/100 25 µl de la dilución 1/200 25 µl de la dilución 1/400 25 µl de la dilución 1/800 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25µl MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 46 �Control negativo: El suero control negativo se diluye siguiendo el mismo protocolo de los sueros problema (1/2, 1/4, 1/8 etc.). Controles del ensayo a. Control de la ausencia de poder anticomplementario del antígeno: Se dispensa por duplicado en la placa 25 μl/pocillo de SB, 25 μl/pocillo de C y 25 μl/pocillo de antígeno. b. Control sistema hemolítico con complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 50 μl/pocillo de SB y 25 μl/pocillo de C. c. Control sistema hemolítico sin complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 75 μl/pocillo de SB. Disposición de los sueros en la placa Los controles y muestras diluidas deben quedar dispuestas en la placa fondo en U (25 µl/pocillo) según indica la tabla 3. Tabla 3 1 Control positivo 2 Control negativo 3 muestra 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/12,5 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 B 1/25 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 C 1/50 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 D 1/100 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 E 1/200 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 F 1/400 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 G 1/800 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 H 1/1600 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 Preparación y dispensado de las soluciones de antígeno y complemento • Preparar la solución de C según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todas las muestras. • Preparar la solución de antígeno según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todos los pocillos salvo en la dilución 1/2 (muestras y control negativo) y 1/12,5 (control positivo) Fila A, las cuales actuarán como controles de poder anticomplementario (PAC) de cada suero. Primera incubación en caliente • Tapar y agitar la placa en agitador de placas durante 2-4 minutos. • Incubar a 37 ± 2 ºC durante 30 minutos. Dispensado del sistema hemolítico • Quince (15) minutos antes de finalizar la primera incubación, preparar e incubar a 37 ± 2 ºC durante 15 minutos el sistema hemolítico según el Anexo FCT IV. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 47 �• Finalizada la primera incubación, dispensar 25 μl/ pocillo del sistema hemolítico en todos los pocillos de las placas incluida la placa de los controles. Segunda incubación en caliente • Tapar y agitar las placas en agitador de placas durante 2-4 minutos. • Incubar a 37 ± 2 ºC durante 30 minutos. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugar la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos o bien dejarla en reposo en heladera durante una hora antes de su lectura. Lectura de resultados El grado de fijación del complemento se manifiesta por la presencia (negativos) o ausencia (positivos) de hemólisis del sistema hemolítico. La reacción positiva se cuantificará mediante la determinación del título y su grado de hemólisis. Reacción positiva • Sedimento en grado variable de los glóbulos rojos en el fondo del pocillo. • El sobrenadante estará afectado por un cierto tinte rojizo en función de la hemólisis que se haya producido. Este grado de hemólisis debe cuantificarse y consignarse mediante un sistema de cruces. Figura 11: Placa fijación de complemento. ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botó de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 48 �Determinación del título del suero Será la inversa de la dilución más alta que siga dando algún grado de sedimentación de los GR. Este grado de fijación será informado mediante el sistema de cruces descripto y convertido a UIFCT. - En el caso de los bovinos vacunados con Brucella abortus S19, para el diagnóstico de las Brucellas lisas (B. abortus), se considera un resultado positivo cualquier valor ≥ 40 UIFCT (1/8 ++). - Para animales no vacunados (bovinos, caprinos, ovinos y porcinos) se considera positivo cualquier valor ≥ 20 UIFCT (1/4 ++). Expresión de los resultados en unidades internacionales de fijación del complemento El sistema de expresión de los resultados en UIFCT, ajustados al suero patrón internacional OIEISS (en el caso de las Brucellas lisas), usado a continuación, se basa en el “Procedimiento IZS TE B2. 1.6 SOP 004 del Centro Internacional de Referencia OIE para Brucelosis” (Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Teramo. Italia) y el “Manual de Procedimiento del Laboratorio Agroalimentario” (Gobierno de Aragón. España. Tabla 4). Tabla 4 Interpretación en UIFCT Dilución % de Fijación del Complemento 1000 UIFCT (1/200) + ++ +++ ++++ 16,6 20 23,2 26,6 1:8 + ++ +++ ++++ 33,2 40 46,4 53,2 1:16 + ++ +++ ++++ 66,4 80 92,8 106,4 + ++ +++ ++++ 132, 8 160 185,6 212,8 1:64 + ++ +++ ++++ 265,6 320 371,2 425,6 1:128 + ++ +++ ++++ 531,2 640 742,4 851,2 + ++ +++ ++++ 1062,4 1280 1484,8 1702,4 1:4 1:32 1:256 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 49 �Controles del ensayo La aprobación del ensayo debe realizarse si los controles han dado los resultados esperados: Controles Resultado esperado Suero control positivo 50 % de fijación (++) en la dilución 1:200 que corresponde a 1000 UIFCT (Brucellas lisas) Suero control negativo 100 % de hemólisis en todos las diluciones, ausencia de fijación de complemento Control de poder anticomplementario de los sueros 100 % de hemólisis ausencia de fijación del complemento en la dilución 1:2 (sin antígeno) Control de ausencia de poder anticomplementario del antígeno 100 % hemólisis Control del sistema hemolítico sin C 0 % de hemólisis Control del sistema hemolítico con C 100 % de hemólisis Criterio de aceptación del análisis: El ensayo se debe considerar APROBADO/NO APROBADO a) APROBADO: • Los controles de antígeno, sistema hemolítico con y sin complemento dan los resultados pre-establecidos. • El control de suero positivo da el resultado pre-establecidos (1:200) con una variación máxima de (± 2 ++). • El control negativo da un resultado Negativo. b) NO APROBADO: si uno de los controles no da el resultado esperado, se repite el ensayo. La presencia de, al menos, un 25 % de sedimento de eritrocitos (+) de la fila A (dilución ½) indica poder anticomplementario en la muestra. En este caso, se informa el resultado de PAC, lo que implica la solicitud de una nueva extracción de la toma de muestra. Para facilitar la lectura e interpretación de los resultados se puede preparar una escala visual del siguiente modo: • En un tubo se coloca 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2 % + 900 µl de SB 1X. • En otro tubo colocar 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2 % + 700 µl de agua destilada, agitar para provocar la completa hemólisis de los GR (solución de hemoglobina), y agregarle 200 µl de SB 5X para mantener la presión osmótica. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 50 �Estos dos tubos mantienen la misma relación de GR. intactos en el primer caso y de glóbulos lisados en el segundo, que el que el 0 % de hemólisis y el 100 % de hemólisis en la prueba. De esta manera mezclándolas en distintas proporciones podremos obtener la imagen que corresponde a los distintos grados de hemólisis, luego de centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm. PORCENTAJE DE HEMÓLISIS Reactivos en µl 0% Solución hemolisada Suspensión de glóbulos rojos 0 100 10 % 10 90 20 % 20 80 30 % 40 % 50 % 60 % 70 % 80 % 90 % 30 40 50 60 70 80 90 100 60 50 40 30 20 10 0 70 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 100 % 51 �Anexos MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 52 �Anexo FCT I: Solución Buffer (SB) Realizar una solución de stock de calcio/magnesio como indica la tabla 1, luego conservar en refrigeración durante 6 meses o eliminar si hay turbidez producto de contaminación. Solución de stock calcio 0,3 M y magnesio 1 M Ca Cl2. Mg 3,7g Cl2. 9,5 g Agua destilada 100 ml • Añadir 1ml de solución stock a 1 litro de solución salina 0,85 % (NaCl2 8,5 g/agua destilada 1 litro). • La solución de trabajo debe tener un pH de 7,3 - 7,4. • Luego de su uso, conservar en refrigeración por 7 días. II: Preparación de la suspensión de GR 2 % a) Lavado de los GR 1. Homogeneizar cuidadosamente el frasco que contiene los eritrocitos. 2. En un tubo cónico resuspender los eritrocitos en una proporción de 1 volumen de GR + 5 volúmenes de SB, luego homogeneizar cuidadosamente. 3. Centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 5 minutos y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. 4. Repetir la resuspensión de los GR en SB, centrifugar de la misma manera anteriormente descripta y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. 5. Realizar la última resuspensión de los GR en SB y centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 10 minutos. 6. Luego de la última centrifugación descartar el sobrenadante, el cual debe estar libre de hemólisis. 7. El método para la estandarización de la suspensión de glóbulos rojos 2 % se podrá realizar por medio de dos técnicas. • Método espectrofotométrico. • Método en cámara de Neubauer. Método espectrofotométrico: 1. Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB (2 %). 2. Realizar un blanco de lectura en el espectrofotómetro dispensando 2,5 ml agua destilada en la celda o tubo del espectrofotómetro. 3. Determinar la lisis 100 % de los GR realizando una dilución 1/15 con agua destilada, agregando en un tubo que contiene 2,8 ml de agua destilada 0,2 ml de glóbulos rojos al 2 %. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 53 �4. Una vez lisados los eritrocitos, leer la densidad óptica (DO) a 545 nm. 5. La DO esperada debe ser de 0.330 ± 0.05. El laboratorio debe determinar según el modelo de espectrofotómetro cual es la DO optima que indique la concentración de GR al 2 %. Método en cámara de Neubauer: 1. Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlos en 9,8 ml de SB (2 %). 2. Realizar una dilución 1/200 y hacer el recuento de glóbulos rojos en la cámara. 3. La suspensión deberá tener 5,4 (± 0,2) X 108 GR / ml. III: Titulación Hemolisina Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina Se prepararán 15 diluciones de hemolisina (tabla 1). En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de hemolisina. La solución se homogeniza mediante agitación en vórtex. Tabla 1: Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina N.° de tubo Dilución SB (ml) Hemolisina 1 1/50 4,9 100 µl 2 1/100 2 2 ml T1 3 1/150 7,45 50 µl 4 1/200 1 1 ml T2 5 1/250 12,5 50 µl 6 1/500 1 1 ml T5 7 1/1000 6 2 ml T5 8 1/2000 1 1 ml T7 9 1/3000 2 1 ml T7 10 1/4000 3 1 ml T7 11 1/5000 4 1 ml T7 12 1/6000 5 1 ml T7 13 1/7000 3 0,5 ml T7 14 1/8000 3,5 0,5 ml T7 15 1/9000 4 0.5 ml T7 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 54 �Preparación de las soluciones “hijas” de hemolisina • En la filas B, C, D, G y H de una placa fondo en U dispensar 25 µl/pocillo de SB excepto de las columnas 10, 11 y 12 de las filas A, B, C y D (tabla 2). • En la filas A (excepto las columnas 10, 11 y 12) y F de la placa dispensar 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de hemolisina preparadas en la batería de tubos de ensayo, según protocolo de la tabla 1. • Con una pipeta multicanal recoger 25 µl por pocillo de la fila A y pasar a la fila B. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se realiza mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensado de la pipeta. Recoger 25 µl / pocillo de la fila B y pasar a la fila. • Volver a homogenizar. Recoger 25 µl / pocillo de la fila C y pasar a la D. Homogeneizar y recoger 25 µl / pocillo y descartar. • De la misma forma, haga diluciones de la fila F sobre las filas G y H. • Las diluciones finales obtenidas se detallan en la tabla 3. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones ‘’madres’’ de hemolisina y SB 1 A B C D 2 3 4 5 6 7 8 9 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 550 µl 50 µl 50 µl de T1 de T1 de T1 de T2 de T2 de T3 de T3 de T4 de T4 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 10 11 12 E F G H 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl de T5 de T5 de T6 de T7 de T8 de T9 de T10 de T11 de T12 de T13 de T14 de T15 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de 25 µl de SB SB SB SB SB SB SB SB SB SB SB MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS SB 55 �Tabla 3. Diluciones finales de hemolisina 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/50 1/50 1/50 1/100 1/100 1/150 1/150 1/200 1/200 B 1/100 1/100 1/100 1/200 1/200 1/300 1/300 1/400 1/400 C 1/200 1/200 1/200 1/400 1/400 1/600 1/600 1/800 1/800 D 1/400 1/400 1/400 1/800 1/800 1/1200 1/1200 1/1600 1/1600 F 1/250 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/3000 1/4000 1/5000 1/6000 1/7000 1/8000 1/9000 G 1/500 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/6000 1/8000 1/10000 1/12000 1/14000 1/16000 1/18000 H 1/1000 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/12000 1/16000 1/20000 1/24000 1/28000 1/32000 1/36000 E Preparación y dispensado de la suspensión de glóbulos rojos Se prepara una suspensión de GR al 2 % según lo indicado anteriormente. En este ensayo se prepara una suspensión de 5 ml. 1. Dispensar la suspensión (25 µl/pocillo) en los pocillos de la microplaca. 2. Cubrir y agitar la microplaca en un agitador de placas durante 30 minutos a bajas revoluciones. Esto proporciona la sensibilización de los GR (unión con los anticuerpos presentes en las diluciones de hemolisina). 3. Dispense 25 µl/pocillo de SB en las filas A, B, C, D, F, G y H. En los pocillos de la columna 1 se dispensan adicionalmente otros 25 µl (esta columna actúa como control del poder hemolítico de la hemolisina). Preparación y dispensado de una solución de complemento El objeto es preparar una solución de complemento a una concentración tal que siempre haya reactivo disponible para detectar una posible unión de Ag (GR) Ac (hemolisina diluida). Para complementos (comerciales) que den un título (unidad de complemento) superior a 1/90, debe prepararse una solución de 1/30. Para complementos que den títulos inferiores, la solución que se deberá preparar será de 1/10 - 1/20 (tabla 4). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 56 �Tabla 4: Dilución del complemento TV Complemento Solución de complemento 1/20 5,7 ml 0,3 ml Solución de complemento 1/30 5,8 ml 0,2 ml 1. Dispensar 25 µl/pocillo de la solución de complemento en las filas A, B, C, D, F, G y H, excepto en los pocillos de la columna 1. 2. Cubrir y agitar la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Incubación Incubar a 37 ± 2 ° C, durante 30 minutos. Cálculos y expresión de resultados El resultado de la relación de cada pocillo se evalúa por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consigna mediante un sistema de cruces (tabla 5). Tabla 5: Expresión de resultados ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Los resultados de la lectura se emiten en la hoja de laboratorio correspondiente. Cálculos de los resultados • Se define la unidad de hemólisis (UH) como la dilución más alta que permita la lisis del 100 % de los eritrocitos en el pocillo. • Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de hemólisis presentan un grado de hemólisis similar. • Se elige la UH de la dilución en la que se obtenga 100 % de hemólisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (mayor concentración de hemolisina). • La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UH, es decir 2 UH 100 %. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 57 �Ejemplo: Si la UH se ha establecido en 1/1000 DT= 2 x 1/1000= 1/500 • Los cálculos y las proporciones finales de reactivos se registran en hojas de trabajo. • Se podrá realizar una dilución 1/50 o 1/100 de la hemolisina en SB conservando a -20 ± 5 º C para luego diluirla al título de trabajo. Se registra el lote, fecha y cantidad de hemolisina diluida. IV: Sistema hemolítico • Para la preparación del sistema hemolítico, el volumen total del sistema depende del número de placas que se deberán utilizar (1 placa= 96 pocillos fondo en U). Ejemplo para dos placas: 2 placas x 2,4 ml = 4.8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de perdidas) • Dispensar en un frasco 2,5 ml de GR 2 % y luego 2,5 ml de hemolisina al título de uso agitando suavemente para homogenizar las dos suspensiones e incubar a 37 ± 2° C, durante 15 minutos. V: Titulación complemento Se llama complemento al suero de cobayo completo, que contiene el sistema enzimático denominado ‘’sistema complemento’’, cuya función en la técnica de fijación del complemento es la de detectar uniones especificas antígeno-anticuerpo. En el caso que en dichas uniones una de las partes sean glóbulos rojos, es capaz de lisarla, como en el caso del sistema hemolítico que se utiliza en la reacción de fijación del complemento, donde los hematíes de carnero hacen el papel de antígeno y el suero de conejo (hemolisina) de anticuerpos. El complemento que sea objeto de titulación debe descongelarse dejándolo llevar a temperatura de laboratorio. Una vez reconstituido o descongelado se mantendrá en refrigeración y solo se sacará de la heladera en el momento de su utilización. Si se prevé que se va a utilizar más de un vial, se juntarán todos en uno y se titulará el conjunto. Preparación de las soluciones “madres” del complemento 1. Realizar 6 diluciones “madres’’ del complemento, empleando para ello tubos de ensayo. Tabla 1 de este anexo. 2. En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de complemento. La solución se homogeneiza perfectamente mediante un agitador. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 58 �Tabla 1. Diluciones “madre” del complemento Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 SB µl 725 850 975 1100 1225 1350 C µl 25 25 25 25 25 25 Preparación de las soluciones “hijas” en placas de ensayo y dispensado del SB 1. En la filas B, C y D de una placa fondo en U, dispense 25 µl/pocillo de SB (tabla 2). 2. En la filas A de la placa, dispense 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de complemento por duplicado según protocolo descripto en tabla 1. 3. Con una pipeta multicanal, recoja 25 µl/pocillo de la fila A y trasváselos a la fila B. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se propiciará mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensación de la pipeta. Recoja 25 µl/pocillo de la fila B y páselo a la fila. 4. Vuelva a homogenizar. Recoja 25 µl/pocillo de la fila C y páselo al D. Homogenice y recoja 25 µl/pocillo y descártelos (las diluciones que han quedado preparadas en la placa se detallan en la tabla 3). 5. Dispense a continuación 50 µl/pocillo de SB en todas las filas de la placa. 6. Agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones “madres’’ de complemento y SB 1 A B C D 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl de T1 de T2 de T4 de T2 de T5 de T6 de T1 de T2 de T4 de T2 de T5 de T6 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB E F G H MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 59 �Tabla 3. Diluciones finales del complemento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 B 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 C 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 D 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 E F G H Cubra la placa para evitar evaporación excesiva e incube en estufa a 37 ± 2 °C durante 15 minutos. Dispensado del sistema hemolítico El sistema hemolítico habrá sido preparado según procedimiento descripto anteriormente. 1. Finalizada la incubación de la placa, dispense 25 µl / pocillo del SH en todos los pocillos de la placa. 2. Cubra y agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. 3. Incube en estufa a 37 ± 2 °C durante 30 minutos. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 60 �Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces: Tabla 4 ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Cálculos de los resultados 1. Se define la unidad de complemento (UC) o unidad hemolítica como la dilución más alta que permita la lisis del 100 % de los eritrocitos en el pocillo. 2. Sobre la hoja del laboratorio se comprobará la respetabilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de complemento presentan un grado de hemólisis similar. 3. Se elige la UC con la dilución más alta que de 100 % de hemólisis. 4. La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UC. Ejemplo: supongamos que se necesite preparar una solución de complemento para utilizar en el análisis de 2 placas según el procedimiento descripto. Ello supone un volumen total de solución de complemento de 2 placas x 2,4ml / placa = 4,8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de pérdidas). a. Supongamos que UC = 1/100 DT= 2 x UC= 2 x 1/100 = 1/50 Si en 50 ml de SB se dispensa 1 ml de C puro: En 5 ml de SB se dispensan x. x= 5/50= 0,1 ml b. Por tanto las proporciones serán: 0,1 ml de complemento y 4,9 ml de SB. Tubo 1 (2 unidades) Tubo 2 (1,5 unidades) Tubo 3 (1 unidades) Tubo 4 (0,75 unidades) Tubo 5 (0,5 unidades) C: 2 unidades (µl) 400 300 200 150 100 SB (µl) 0 100 200 250 300 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 61 �Control de dos unidades de complemento (2 UC) Una vez obtenida la dilución de trabajo, se realizarán diluciones del complemento que contengan 2 unidades; 1,5 unidades; 1 unidad; 0,75 unidades y 0,5 unidades. Para ello trabajaremos según la siguiente secuencia (tabla 5). Tabla 5. Diluciones del complemento Tubo 1 (2 unidades) Tubo 2 (1,5 unidades) Tubo 3 (1 unidades) Tubo 4 (0,75 unidades) Tubo 5 (0,5 unidades) C: 2 unidades (µl) 400 300 200 150 100 SB (µl) 0 100 200 250 300 Se dispensarán por duplicado 25 µl/pocillo de cada una de las diluciones en los correspondientes pocillos de una placa y luego se completan con 50 µl de SB (tabla 6). Tabla 6. Unidades del complemento en la placa 1 2 3 4 5 A 2U 1, 5U 1U 0,75 U 0,5 U B 2U 1, 5U 1U 0,75 U 0,5 U 6 7 8 9 10 11 12 C D E F G H 1. Cubra la placa para evitar evaporación excesiva, agite 2-4 minutos e incube en estufa a 37 ± 2 ° C durante 15 minutos. 2. Luego repita lo descripto agregando el SH Lectura del análisis: • Pocillo con 2 unidades: 100 % de hemólisis • Pocillo con 1,5 unidades: 100 % de hemólisis MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 62 �• Pocillo con 1 unidades: 100 % de hemólisis o traza de GR en suspensión • Pocillo con 0,75 unidades: 0 % a 75 % de hemólisis • Pocillo con 0,5 unidades: 0 % a 50 % de hemólisis Control de calidad El ensayo debe ser repetible: pocillos con diluciones iguales deben tener un grado de reacción similar. En caso contrario se repetirá el análisis. Debe observarse cada gama de reacciones posibles desde diluciones con el 100 % (N) de hemólisis (las más bajas), hasta diluciones con el 0 % (++++) de hemólisis (las más alta). En caso contrario se repetirá el análisis. En el control de 2 unidades de complemento deben dar los resultados preestablecidos. El análisis debe informarse como APROBADO / NO APROBADO en el apartado de observaciones de la planilla de titulación del complemento. En caso de no aprobado, se repite el proceso. VI: Titulación antígeno Se utiliza el antígeno de seroaglutinación en tubo (SAT) volumen celular aproximado de 4,5 %. Se trata de determinar lo que se denomina UA (unidad antigénica) que corresponde para cada lote de antígeno y será la dilución óptima de uso para garantizar la unión con los anticuerpos presentes en los sueros problema, en la cantidad suficiente para fijar el complemento. El antígeno formará el complejo antígeno-anticuerpo con los anticuerpos presentes de los sueros problema y que serán capaces de fijar el complemento. Esta reacción requiere un título mínimo para que se lleve a cabo, es decir, se debe garantizar una concentración mínima de antígeno que reaccione con los anticuerpos y sea capaz de fijar el complemento. Preparación de diluciones “madre” de antígeno Se preparan tres diluciones previas en tubos, luego se dispensarán: • en un tubo 500 µl de SB y 10 µl de antígeno; • en un segundo tubo 750 µl de SB y 10 µl de antígeno; • en un tercer tubo 1250 µl de SB y 10 µl de antígeno. Esto da una dilución de 1/50, 1/75 y 1/125, respectivamente. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 63 �Preparación de las diluciones “hijas” de antígeno En una placa de fondo en U se dispensan 25 µl de SB en todos los pocillos salvo en la columna 1 y los pocillos A10, A11, A12. La fila C y F no se utilizarán hasta la columna 9 (tabla 1). En la columna 1 se pondrán 50 µl de las soluciones madres del antígeno por duplicado y en los pocillos A10, A11, A12 de forma simple (tabla 1). Se diluye pasando 25 µl sucesivamente de estos pocillos a los siguientes consiguiendo diluciones al duplo del antígeno. Las diluciones se realizan de la columna 1 a la columna 9 y de los pocillos A10, A11, A12 hasta los pocillos H10, H11 y H12. Es decir, se pasan 25 µl de la columna 1 a la 2, se homogeniza y se pasan otros 25 µl a la columna 3 y así sucesivamente, y se eliminan los 25 µl que sobran en la columna 9 y lo mismo en vertical en las columna 10, 11 y 12. Tabla 1. Diluciones ‘’hijas’’ del antígeno 1 2 3 4 5 6 7 A 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 B 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 8 9 10 11 12 1/6400 1/12800 1/50 1/75 1/125 1/6400 1/12800 1/100 1/150 1/250 1/200 1/300 1/500 C D 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/400 1/600 1/1000 E 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/800 1/1200 1/2000 1/1600 1/2400 1/4000 1/8000 F G H 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/3200 1/4800 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/6400 1/9600 1/16000 Dispensado de sueros controles positivo y negativo Seguidamente se dispensan 25 µl de suero control positivo en los pocillos de la fila A, B, D, E, G y H salvo en las columnas 10, 11, 12 donde se dispensan 25 µl de suero control negativo y servirá como control de hemolisis. El suero control positivo debe ir a una dilución igual al título conocido (1/200) en la reacción de fijación del complemento. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 64 �Dispensado de una solución de complemento Posteriormente se dispensan 25 µl de complemento a todos los pocillos según el título obtenido previamente. Se agita la placa 2-4 minutos y se incuba durante 30 minutos a 37 ± 2°C. Dispensado del sistema hemolítico Tras la incubación de la placa se procede a dispensar 25 µl de sistema hemolítico a todos los pocillos. Luego se agita la placa 2-4 minutos e incubará durante otros 30 minutos a 37 ± 2°C. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces. Tabla 2 ++++ Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR 0 % de hemólisis +++ Sobrenadante rojizo en un 25 % de intensidad, en el fondo un depósito claro de GR 25 % de hemólisis ++ Sobrenadante rojizo en un 50 % de intensidad, en el fondo un depósito tenue de GR 50 % de hemólisis + Sobrenadante rojizo en un 75 % de intensidad, en el fondo un depósito muy tenue de GR 75 % de hemólisis Sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR 100 % de hemólisis Negativo Los resultados de la lectura se registran en la hoja de laboratorio correspondiente MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 65 �Cálculos de los resultados 1. Se define la unidad de antígeno (UA) como la dilución más alta que permita una fijación completa (0 % de hemolisis). 2. Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de antígeno presentan un grado de hemólisis similar. 3. Se elige la UA a dilución en la que se obtenga el 0 % de hemólisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (de mayor concentración de antígeno). 4. La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UA. Ejemplo: supongamos que la UA se ha establecido 1/800: DT= 2 x UA= 2 x 1/800 = 1/400 MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 66 �Anexo I Modelo de planilla de emisión de resultados MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 67 �Bibliografía MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 68 �Normativa vigente Ley 24.696 de año. Por la cual se declara de interés nacional el control y erradicación de la enfermedad reconocida como Brucelosis (Brucella abortus) en las especies bovina, suina, caprina y otras en todo el Territorio Nacional. 26 de septiembre de 1996. B.O. N.º 28.492. Norma Organización Internacional de Normalización [ISO/IEC 17025]. 2017 (España). Resolución 957 de 2024 [Senasa]. Por la cual se aprueba el uso de los inmunógenos RB51 y Delta PGM. 15 de agosto de 2024. Resolución 276 de 2023 [Senasa]. Por la cual se adopta el sistema de diagnóstico serológico para el Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina en la República Argentina. 14 de abril de 2023. Resolución 77 de 2021 [Senasa]. Por la cual se sustituye el articulo 9° y 10 de la Resolución N.° 67/19 y otras modificaciones. 19 de febrero de 2021. Resolución 67 de 2019 [Senasa]. Por la cual se aprueba el Plan Nacional De Control y Erradicación De Brucelosis Bovina en la República Argentina, de aplicación obligatoria en todo el territorio nacional, excepto en la provincia de Tierra Del Fuego, Antártida e islas del Atlántico Sur. 1.° de febrero de 2019. Resolución 857-E de 2017 [Senasa]. Por la cual se declara como zona libre de brucelosis ovina y caprina a Brucella melitensis, a la región patagónica y se establece el Programa De Vigilancia y Prevención. 27 de diciembre de 2017. Resolución 372-E de 2017 [Senasa]. Por la cual se aprueba el Plan Nacional de Control de Brucelosis Caprina en la República Argentina y se establecen las estrategias sanitarias básicas que deben ser aplicadas en cada zona o provincia. 14 de junio de 2017. Resolución 98 de 2016 [Senasa]. Por la cual se resuelve la comercialización de antígenos/kits para diagnóstico de brucelosis.18 de marzo de 2016. Resolución 63 de 2013 [Senasa]. Por la cual se crea el Registro Nacional de Establecimientos Oficialmente Libres de Brucelosis Porcina. 28 de febrero de 2013. Resolución 246 de 2007 [Senasa]. Por la cual se aprueban los requisitos de bioseguridad para los laboratorios que se dediquen a la elaboración de productos destinados al diagnóstico y a la prevención de la Brucelosis Animal y la Tuberculosis Animal. 04 de mayo de 2007. Resolución 438 de 2006 [Senasa]. Por la cual de adopta el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis. 4 de agosto de 2006. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 69 �Resolución 736 de 2006 [Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos]. Por la cual se crea la Red Nacional de Laboratorios de Ensayo y Diagnóstico. 17 de noviembre de 2006. Resolución 79 de 2003 [Senasa]. Por la cual se aprueba el procedimiento para la supervisión de la aplicación de los tratamientos de fumigación oficial. 26 de enero de 2003. Resolución 1484 de 1993 [Senasa]. Por la cual se establecen las normas para la elaboración, fraccionamiento, distribución, expendedor para los reactivos destinados en el diagnóstico y prevención de la Brucelosis Animal. 28 de diciembre de 1993. Bibliografía consultada Alton, G.G., Jones, L.M., Angus, R.D. and Verger, J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis Laboratory. INRA, Paris. Angus, R.D. & Barton, C.E. (1984). The production and evaluation of a buffered plate antigen for use in a presumptive test for brucellosis. Dev. Biol. Stand. (56,349-356). Centro Panamericano de Zoonosis (1968). Técnicas e interpretación de sero-aglutinación para el diagnóstico de la brucelosis bovina. Nota Técnica Nº2. Ramos Mejía. Ciocchini A.E., Rey Serantes D. A., Melli L.J., Iwashkiw J.A., Elena S., Franco C., Nicola A.M., Feldman M.F., Comerci D.J., Ugalde J.E. (2014) A bacterial engineered glycoprotein as a novel antigenic target for diagnosis of bovine brucellosis. Vet Microbiol. 172 (3-4):455-65. Cortina M.E., Balzano R.E., Rey Serantes D.A., Caillava A.J., Elena S., Ferreira A.C., Nicola A.M., Ugalde J.E., Comerci D.J., Ciocchini A.E (2016). A bacterial glycoengineered antigen for improved serodiagnosis of porcine brucellosis. Journal of Clinical Microbiology. 54(6), 1448-1455. Gall D., Nielsen K., Forbes L., Cook W., Leclair D., Balsevicius S., Kelly L.,Smith P. & Mallory M. (2001). Evaluation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for detection of brucellosis in cervids. J. Wildl. Dis., 37,110-118. Gall D.,Nielsen K.,Forbes L.,Davis D.,Elzer P.,Olsen S.,Balsevicius S.,Kelly L., Smith P., Tan S. & Joly D. (2000). Validation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological tests for detection of serum antibody to Brucella abortus in bison. J. Wildl. Dis., 36, 469-476. Bagnat, Moras, Vibot, Samartino, T. De Echaide, Walsh, Diprodesa, Di Lorenzo, Nicola (2006). 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Joint Food And Agriculture Organization Of The United Nations/World Health Organization Expert Committee On Brucellosis. Technical Report Series 740, Sixth Report. Geneva. MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 71 �World Organisation for Animal Health (2022). Manual of standards for diagnostic test & vaccines. Brucellosis (infection with Brucella abortus, B. melitensis and B. suis). Wright P.F., Nilsson E., Van Rooij E.M.A., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1993). Standardisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev.sci.tech., (12, 435-450). Wright P.F., Tounkara K., Lelenta M. & Jeggo M.H. (1997). International reference Standards: antibody standards for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci. Tech. (3, 824-832). MANUAL DE PROCEDIMIENTO. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS 72 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual de procedimiento. Diagnóstico serológico de brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis) Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2025 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Coordinación de Bacteriología Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico Coordinación General de Comunicación Institucional Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Manual Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0177 Abstract A summary of the resource. El presente manual está dirigido a profesionales que se desempeñan en la Red de Nacional de Laboratorios del Senasa (Redlab) respecto a las técnicas relacionadas con el diagnóstico serológico de brucelosis. Técnicas reconocidas y recomendadas por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA) y el Senasa. Incluye nociones sobre medidas de bioseguridad y controles de calidad a aplicarse en los procedimientos técnicos de laboratorio. Table Of Contents A list of subunits of the resource. Introducción Objetivos Abreviaturas y definiciones Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio Principios de bioseguridad Prácticas operativas seguras y hábitos personales Limpieza y desinfección del laboratorio Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) Aseguramiento de la calidad en el laboratorio Control de calidad de insumos Equipos Sobre la enfermedad Descripción de la enfermedad Infección por Brucella en ganado bovino Infección por Brucella en ovejas y cabras Infección por Brucella en cerdos Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio o en libertad Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Técnicas de diagnóstico Pruebas serológicas Procedimientos de trabajo para el diagnóstico de brucelosis en el laboratorio de red Registro de entrada de muestras Características y condiciones de las muestras Condiciones de recepción de las muestras Condiciones de rechazo o demora del procesamiento de las muestras Informes de resultados Pruebas screening con antígeno tamponado en placa (BPAT y RBT) para la detección de anticuerpos contra Brucella spp Desarrollo Ejecución del ensayo de BPAT Ejecución del ensayo de Rosa de Bengala Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa Informes de resultados Pruebas de seroaglutinación lenta en tubo (SAT/2-ME) Desarrollo Ejecución del ensayo Incubación Lectura e interpretación de resultados Informes de resultados Preparación de soluciones para las pruebas de SAT/2-ME Prueba del anillo en leche (PAL o MRT) solo para bovinos Desarrollo Toma de la muestra Ejecución del ensayo Lectura Modificación de la prueba para tanques muy grandes Enzimoinmunoensayo indirecto (I ELISA) (para suero o leche) Etapas Desarrollo ELISA por competición / bloqueo Desarrollo Ensayo de polarización fluorescente para la detección de anticuerpos contra brucella en suero Desarrollo Ejecución del ensayo Lectura e interpretación Fijación de complemento Desarrollo Manejo y conservación de las muestras Condiciones del ensayo Ejecución Lectura de resultados Anexos Bibliografía Brucelosis Laboratorios https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/e2cb337bc99d48ac0b51f8a384949dd9.pdf 9983045d49c79284f0ffa7734f96734e PDF Text Text DECRETO N° 4830/73 RESUMEN: Decreto reglamentario de la Ley 20.466 BUENOS AIRES, 23 de mayo de 1973. VISTO el expediente N° 75.250/73 por el cual el MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA propone las normas reglamentarias de la Ley N° 20.466 que prescribe el contralor de la producción y comercialización de fertilizantes y enmiendas y CONSIDERANDO: Que es necesario fijar las normas a que deberá ajustarse la elaboración, distribución, fraccionamiento, importación, exportación, y venta de fertilizantes y enmiendas. Que corresponde establecer las características que deben reunir estos insumos y la forma en que se ha de realizar el contralor de los mismos, por considerárselo factores preponderantes para la economía agropecuaria. Que es imprescindible dictar las normas de orden técnico y administrativo, en salvaguardia de los intereses de los usuarios de fertilizantes y enmiendas. Que deben establecerse los aranceles a que estarán sujetas las solicitudes de inscripción, reinscripción, inspección y certificación de los productos antes mencionados. Por ello, de acuerdo a lo propuesto por el señor Ministro de Agricultura y Ganadería EL PRESIDENTE DE LA NACION ARGENTINA DECRETA: ARTICULO 1°.- EL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA será el órgano de aplicación de la Ley N° 20.466. ARTICULO 2°.- Los fertilizantes y enmiendas que se elaboren, fraccionen, vendan, importen o exporten estarán sujetos al requisito de la certificación de aptitud para su empleo como tales, registro y control de calidad, a cargo de los servicios técnicos del MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA, conforme lo establezca la reglamentación que este organismo dicte. Sin perjuicio de lo dispuesto precedentemente, los fertilizantes y enmiendas destinados a la exportación deberán ser inspeccionados y certificados previamente al otorgamiento de la respectiva autorización de embarque. Igualmente serán inspeccionadas y certificadas, previamente a su despacho a plaza, todas las partidas de fertilizantes y enmiendas que se importen. ARTICULO 3°.- Se considera FERTILIZANTE a toda sustancia o mezcla de sustancias que incorporada al suelo o aplicada sobre la parte aérea de las plantas, suministre el o los elementos que requieren los vegetales para su nutrición, con el propósito de estimular su crecimiento, aumentar su productividad y mejorar la calidad de las cosechas. �Estas sustancias podrán ser de carácter mineral u orgánico y deberán contener elementos nutrientes primarios: NITROGENO, FOSFORO, o POTASIO; o elementos nutrientes secundarios; CALCIO, MAGNESIO o AZUFRE o elementos menores o micronutrientes: BORO, CINC, COBRE, HIERRO, MOLIBDENO, MANGANESO, etc. susceptibles de ser aplicadas en forma capaz de ser asimiladas por los vegetales. Con la denominación de "Fertilizante Simple" se considera a aquel constituido por una sola sustancia aunque ésta posea uno o más elementos nutrientes en su molécula. Con la denominación de "Fertilizantes Compuestos" se considera a la mezcla de DOS (2) o más fertilizantes simples. Con la denominación de "Fertilizante Foliar" se consideran aquellas sustancias o mezclas de sustancias solubles en agua que posean elementos nutrientes susceptibles de ser asimilados y se apliquen directamente sobre la parte aérea de los vegetales. ARTICULO 4°.- Se considera "ENMIENDA" a toda sustancia o mezcla de sustancias de carácter mineral u orgánico, que incorporada al suelo modifique favorablemente sus caracteres físicos o físico químicos, sin tener en cuenta su valor como fertilizante, como ser: yeso, cales, azufre, dolomita, turba y toda otra sustancia o mezcla, que el MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA considere apropiado incluirla en esta denominación. ARTICULO 5°.- EL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA por intermedio de su Servicio especializado llevará el Registro Nacional en el cual deberán inscribirse las personas físicas o jurídicas que fabriquen, importen, exporten, fraccionen o distribuyan fertilizantes o enmiendas; dicho servicio también llevará el Registro Nacional de todos los productos que se fabriquen, importen, exporten, fraccionen o vendan, para de esta forma dar cumplimiento al artículo 3° de la Ley 20.466. ARTICULO 6°.- Las personas físicas o jurídicas que elaboren, importen o fraccionen fertilizantes inscriptos en el registro a que se refiere el artículo anterior, deberán contar con un servicio técnico a cargo de un Ingeniero Agrónomo matriculado, responsable del equilibrio de las fórmulas y valor agronómico de las mismas. ARTICULO 7°.- Para inscribir un producto es necesario presentar el certificado de aptitud, el cual será otorgado por el Servicio especializado del MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA previo análisis del producto sobre la muestra presentada a tal fin. ARTICULO 8°.- Las inscripciones de los productos deberán efectuarse anualmente y vencen el 31 de diciembre de cada año, pudiendo renovarse o reinscribirse indefinidamente a partir del 1° de enero al 30 de abril de cada año. �Al realizar la inscripción o reinscripción de cada producto se deberá presentar una muestra del mismo con el objeto de comprobar si su contenido responde a lo declarado. ARTICULO 9°.- La inscripción de los productos se hará con carácter de declaración jurada en la que se consignará: a) Composición química y/o bioquímica, expresada en porcentaje en peso. b) Estado de agregación, cuando corresponda. c) Origen. d) Instrucciones para su uso. e) Precauciones y restricciones para su empleo. f) Fecha de vencimiento si el producto fuera alterable. En caso que el producto sea un fertilizante se indicará además: 1°.- Contenido de nutrientes expresado en porcentaje en peso de elementos. 2°.- Si es neutro, formador de ácido o álcali y su respectivo índice. ARTICULO 10.- En los fertilizantes el contenido de elementos nutrientes primarios se permitirá expresarlo en grados, entendiéndose por grado el porcentaje en peso como elemento, en unidades y medias unidades de: NITROGENO total, FOSFORO asimilable y POTASIO soluble en agua. ARTICUTO 11°.- EL MINISTERIO DE COMERCIO no dará curso a las solicitudes de aprobación de marbete o impresión de fertilizantes y enmiendas de acuerdo a la Ley N° 20.466, su decreto reglamentario y disposiciones complementarias. Otorgase un plazo de UN (1) año a partir de la publicación del presente decreto, para dar cumplimiento a los requisitos de la Ley N° 20.466 y su reglamentación en lo que a marbete o impresión se refiere. ARTICULO 12°.- En fertilizantes "formadores de ácido", en el marbete o impresión debe constar el "índice de acidez" y en los "formadores de base o alcalinos" el "índice de basicidad". ARTICULO 13°.- En la comercialización de fertilizantes a granel, los envíos deberán ser comunicados al MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA con CINCO (5) días hábiles de antelación, con el objeto de proceder a la extracción de muestras y tomar las providencias necesarias para asegurar la calidad del producto hasta su destino, de acuerdo a las condiciones que se fijen por Resolución del MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA. ARTICULO 14°.- Para verificar el cumplimiento de los requisitos de la mencionada Ley, su decreto reglamentario y demás disposiciones, el MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA por intermedio de sus agentes autorizados tendrá acceso a cualquier predio público o privado durante las horas comerciales con el objeto de proceder a la extracción de muestras de fertilizantes y enmiendas, en todo el territorio de la República; el método de muestreo y demás modalidades se establecerán por resolución del MINISTERIO DE AGRICULTURA Y. GANADERIA. �ARTICULO 15°.- Los fertilizantes orgánicos como ser estiércol, compost, etc., y enmiendas orgánicas no sometidas a manipulación industrial quedan exentos del cumplimiento de los requisitos del presente decreto y su venta bajo análisis es optativa. No se podrá hacer referencia a su composición química o bioquímica o elementos nutrientes sin haberlos sometido a análisis previos. ARTICULO 16°.- Las personas jurídicas o físicas inscriptas en el Registro establecido en el Artículo 5° del presente decreto deberán informar bajo declaración jurada durante el mes de junio de cada año, al servicio especializado del MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA de acuerdo a las normas que para tal efecto se dicten, un resumen anual de la producción y comercio de fertilizantes y enmiendas. Los establecimientos frigoríficos, fábricas, depósitos, etc., que produzcan o vendan subproductos de la ganadería o agricultura o recolección de residuos, destinados a la preparación de fertilizantes o enmiendas o a su empleo como tales deberán cumplir con los requisitos exigidos en el apartado anterior. ARTICULO 17°.- De acuerdo al Artículo 8° de la Ley N° 20 466, por resolución del MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA se fijaran los márgenes de tolerancia para los alimentos, componentes y estado de agregación de los fertilizantes y enmiendas como así también para las sustancias nocivas que contengan. Asimismo se determinará la intervención que corresponda en caso de arbitraje. ARTICULO 18°.- EL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA podrá realizar ensayos con fertilizantes o enmiendas y estudios agrotécnicos que crea necesario para establecer su valor agronómico, en función del suelo, clima, cultivo y asesorar a los agricultores sobre el uso racional de estos productos. ARTICULO 19°.- EL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA adoptará las medidas necesarias para limitar y aun prohibir la aplicación de aquellos fertilizantes y enmiendas que se consideren no apropiados para determinadas regiones o cultivos. ARTICULO 20°.- EL MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA asesorará sobre el carácter de fertilizante o enmienda a los efectos de la liberación de los derechos de importación de los productos que se introduzcan al país, destinados exclusivamente a ser utilizados como tales. ARTICULO 21°.- Toda persona que importe, exporte, elabore, o distribuya productos fertilizantes y/o enmiendas abonará los siguientes aranceles en concepto de: INSCRIPCION DE LA PERSONA FISICA O JURIDICA Certificado de aptitud de un fertilizante $200.Certificado de aptitud de una enmienda $160.Inscripción de un fertilizante o enmienda $100.- $400.- �Reinscripción de un fertilizante $ 80.Reinscripción de una enmienda $ 50.Inspecciones, exportación e importación...... $ 40.Análisis por servicios particulares por determinación $ 20.Todos los análisis serán realizados por el MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA. ARTICULO 22°.- Los gastos que demanden los análisis de verificación o fiscalización de los productos inscriptos están incluidos en el arancel de inscripción del producto. Todo otro análisis realizado a pedido de personas, productores, o expendedores con el objeto de conocer la composición de determinada muestra o producto estará sujeto al arancel fijado en el artículo anterior. ARTICULO 23°.- Todas las infracciones al presente decreto o a las disposiciones establecidas en los mismos serán reprimidas de acuerdo al Artículo 13 de la Ley N° 20.466. ARTICULO 24°.- El presente decreto comenzará a regir, a partir de la fecha de la publicación. ARTICULO 25°.- Derógase el Decreto N° 14.407 de fecha 9 de setiembre de 1955, y los demás en cuanto se opongan al presente decreto. ARTICULO 26°.- Comuníquese, publíquese, dese a la Dirección Nacional del Registro Oficial y vuelva al MINISTERIO DE AGRICULTURA Y GANADERIA, DECRETO N° 4830 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Decretos Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Decreto N° 4830/1973 Description An account of the resource Fiscalización de fertilizantes y enmiendas. Reglamentación de la Ley N° 20466 Source A related resource from which the described resource is derived <a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=200202">Decreto N° 4830/1973</a> Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource Miércoles 23 de mayo de 1973 Abstract A summary of the resource. Los fertilizantes y enmiendas que se elaboren, fraccionen, vendan, importen o exporten, estarán sujetos al requisito de la certificación de aptitud para su empleo como tales, registro y control de calidad, a cargo de los servicios técnicos del Ministerio de Agricultura y Ganadería, conforme lo establezca la reglamentación que este organismo dicte. Is Replaced By A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource. <strong>Abrogada por el Art. 11 del <a href="https://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=409638">Decreto N° 101/2025 del Poder Ejecutivo Nacional</a></strong> Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Decreto https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/5b5bbb1b837ae9d40e3373f9f8d94467.pdf 6e233efc1a0bf67307a3f822a1d42644 PDF Text Text ����� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Secretaría de Agricultura y Ganadería Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Resolucion SAyG N° 1352/1967 Description An account of the resource Reglamenta el Decreto 9244/63 en lo referente a frutas secas. Creator An entity primarily responsible for making the resource Secretaría de Agricultura y Ganadería Source A related resource from which the described resource is derived <a href="http://servicios.infoleg.gob.ar/infolegInternet/verNorma.do?id=157438">Resolucion SAyG N° 1352/1967</a> Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource Martes 14 de Noviembre de 1967 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Resolución Abstract A summary of the resource. Aprueba, como reglamentación del Decreto-Ley N° 9.244/63, en lo referente a frutas secas destinadas al mercado interno y a la exportación, el texto anexo. Is Replaced By A related resource that supplants, displaces, or supersedes the described resource. <strong>Abrogada por el Art. 18 de la <a href="https://biblioteca.senasa.gob.ar//items/show/4423#?c=0&amp;m=0&amp;s=0&amp;cv=0">Resolucion N° 22/2025 de la Secretaria de Agricultura, Ganaderia y Pesca&nbsp;</a></strong>