539 10 5453 https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/97aad843793a5fd77ad6ca5f4f3639a1.pdf 532b44c68a84b47313bc40c6365e5135 PDF Text Text GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR CAPRINOS DIRECCIÓN NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL COORDINACIÓN DE AGRICULTURA FAMILIAR UNIDAD DE PRESIDENCIA �Autoridades Méd. Vet. Jorge Horacio Dillon Presidente Ing. Agr. Guillermo Luis Rossi Vicepresidente Méd. Vet. Ricardo Maresca Dirección Nacional de Sanidad Animal Lic. Lucía González Espinoza Coordinación de Agricultura Familiar La Guía de sanidad animal para la agricultura familiar fue elaborada con los aportes de los profesionales y técnicos de la Dirección Nacional de Sanidad Animal del Senasa y ha sido consensuada en el marco de la Comisión de Agricultura Familiar del Senasa (Senaf). �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS ÍNDICE ACERCA DEL SENASA El Senasa y la agricultura familiar Muestreos oficiales Asesoramiento sanitario 05 05 06 06 ACERCA DE LA PRODUCCIÓN CAPRINA 07 ACERCA DE LAS ENFERMEDADES DE LOS CAPRINOS Prevención y control de las enfermedades de los caprinos Beneficios de prevenir y controlar las enfermedades en los caprinos ¿Cómo reconocer signos de enfermedad? Diagnóstico y tratamiento Enfermedades bajo control oficial del Senasa Medidas preventivas 08 10 12 12 14 17 26 DOCUMENTACIÓN Y TRÁMITES 27 NORMATIVA 29 BIBLIOGRAFÍA 31 ANEXO 32 Senasa • 3 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR Esta guía está destinada a productores familiares que se dedican a la crianza de caprinos. Contiene información útil sobre las enfermedades de los caprinos de mayor impacto en la producción y las que poseen consecuencias para la salud de las personas, con el objetivo de favorecer el desarrollo integral del emprendimiento familiar. 4 • Senasa �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS ACERCA DEL SENASA El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa) es el organismo dependiente del Ministerio de Agroindustria de la Nación encargado de prevenir, controlar y erradicar plagas y enfermedades de los animales y los vegetales que afectan a la produc­ción agropecuaria. Es responsable de fiscalizar y certificar productos y subproductos de origen animal y vegetal, sus insumos y residuos agroquímicos, con el fin de velar por la calidad e inocuidad de los alimentos para el consumo humano y animal desde el origen. El Senasa y la agricultura familiar Para acompañar el desarrollo, crecimiento y fortalecimiento de las producciones agropecuarias familiares, el Senasa cuenta con la Coordinación de Agricultura Familiar, cuyos objetivos son: Y construir, de manera participativa, nuevas normas que regulen la producción de alimentos y adecuar las vigentes, contemplando las características propias del sector de la agricultura familiar (AF); Y recomendar medidas preventivas y planes sanitarios a través de manuales de procedimientos específicos, tanto para la producción primaria agrícola y ganadera como para la elaboración de alimentos; Y difundir los conceptos básicos de las normas vigentes, para el ejercicio de buenas prácticas agrícolas, pecuarias y de manufactura. Además, el Senasa coordina la Comisión de Agricultura Familiar (Senaf) conformada por representantes del sector productivo y de Senasa • 5 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR las instituciones públicas vinculadas, con el fin de propiciar un trabajo conjunto y consensuado en beneficio de los productores. En el mismo sentido, cada centro regional del Senasa cuenta con referentes de agricultura familiar que participan en las Mesas Locales Interinstitucionales. Muestreos oficiales El Senasa realiza muestreos al azar (toma de muestras) en los establecimientos agropecuarios y plantas de procesamiento sin costo para el productor. El objetivo de estos muestreos es mejorar la condición sanitaria del país respecto a determinadas enfermedades de importancia para la salud, la producción y el comercio, y velar por la calidad e inocuidad de los alimentos. Los resultados obtenidos en estos estudios permiten planificar acciones para prevenir, controlar y erradicar las principales enfermedades que afectan a la producción agropecuaria. Si su establecimiento es incluido en el muestreo, colabore con el personal del Senasa, que luego le informará los resultados obtenidos. Asesoramiento sanitario El Senasa cuenta con más de 360 oficinas distribuidas en el territorio nacional, bajo la jurisdicción de 14 centros regionales. Si necesita asesoramiento sobre las enfermedades de los animales puede dirigirse a la oficina del Senasa más cercana o contactarse con los referentes regionales de agricultura familiar del Organismo. Por su parte, la Secretaría de Agricultura Familiar del Ministerio de Agroindustria (SAF-Minagro), cuenta con oficinas distribuidas en las distintas provincias del país asistidas por equipos de profesionales que brindan asesoramiento, capacitación y acompañamiento a los agricultores familiares. Además, el Senasa cuenta con un registro de técnicos y veterinarios acreditados, especializados por enfermedad y/o especie, y capacitados sobre la normativa vigente. Los productores pueden contactar a estos profesionales para recibir asesoramiento en el tratamiento y el control de las enfermedades de los animales. El listado de técnicos y veterinarios acreditados puede ser consultado en las oficinas del Senasa o a través de la página web del Organismo (www.senasa.gob.ar). 6 • Senasa �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS ACERCA DE LA PRODUCCIÓN CAPRINA La ganadería caprina en la Argentina está compuesta por más de 4 millones de caprinos en manos de productores familiares. La actividad productiva está orientada principalmente a la cría de cabritos mamones de 10 a 12 kilos para faena y, en menor medida, a la producción de leche, que se realiza en cincuenta tambos distribuidos en todo el país. La cría de caprinos puede realizarse en zonas que no son aptas para otras actividades agropecuarias, esto le permite a los pequeños productores y a sus familias contar con alimentos nutritivos como la leche de cabra y la carne de chivo, que se destinan al autoconsumo, a la elaboración de productos artesanales y/o al comercio. De la actividad caprina pueden obtenerse otros productos útiles para la vida de las personas como el estiércol para abonos, el cuero y –según la raza que se críe– fibras para textiles (Mohair y Cashmere) que actualmente se destinan a la exportación. ALIMENTOS Leche y carne derivados TEXTILES Mohair Cashmere ABONO DE CULTIVOS Estiércol Senasa • 7 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR ACERCA DE LAS ENFERMEDADES DE LOS CAPRINOS Las principales enfermedades de los caprinos son causadas por bacterias, virus, parásitos y otros agentes que se encuentran presentes en el medio ambiente o que pueden ser transmitidos por caprinos enfermos o animales de otras especies, incluidos los humanos y los insectos. Ciertas enfermedades se presentan con mayor frecuencia o únicamente en determinados momentos de desarrollo (edades) de los animales, y producir distintos niveles de daño. Algunas enfermedades están distribuidas en todo el país y otras se presentan en forma exclusiva o con mayor frecuencia en determinadas zonas o regiones, ya sea por razones climáticas, ambientales o porque han sido erradicadas. Transmisión y contagio de enfermedades a los caprinos BACTERIAS, VIRUS Y PARÁSITOS presentes en el medioambiente OTROS ANIMALES ENFERMOS O SUS FLUIDOS (leche, sangre, placenta, semen, otros) ROEDORES PIOJOS, ÁCAROS Y GARRAPATAS PERROS Y GATOS CONSUMO DE LECHE de animales enfermos o alimentos contaminados INGESTIÓN de agua o pasturas contaminadas MOSCAS MEDIDAS DE HIGIENE Y MANEJO INADECUADAS Es importante considerar que las enfermedades perjudican la producción –tanto de carne como de leche– y aumentan los costos para el productor por enfermedad y muerte. Además, algunas de las enfermedades que afectan a los caprinos son zoonosis, es decir, que se pueden transmitir y enfermar a las personas. 8 • Senasa �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS Algunas zoonosis se transmiten por contacto directo con los animales enfermos o con sus fluidos, por lo tanto constituyen un riesgo para la salud de los trabajadores. Otras se transmiten por el consumo de productos provenientes de un animal enfermo o portador, lo que implica un riesgo para la salud del consumidor de los alimentos. Para que los alimentos de origen animal sean seguros para el consumo, deben provenir de animales sanos. Además, antes de consumir leche de cabra y de elaborar productos lácteos derivados se deben someter a una pasteurización, de acuerdo a lo establecido por el ANMAT. En caso de no poder hacerlo, se deben seguir las recomendaciones de dicho organismo para el consumo de leche segura (*). (*) Puede acceder al documento ‘Consumo de Leche Segura’ del ANMAT en el siguiente link: http://www.anmat.gov.ar/Alimentos/Consumo_ Leche_Segura.pdf Es importante pasteurizar la leche antes de consumirla o de elaborar productos lácteos derivados. El ser humano también puede contraer enfermedades al consumir alimentos contaminados por una mala manipulación o medidas de higiene inadecuadas en el establecimiento. Por lo tanto, para obtener productos seguros y de calidad, además de provenir de caprinos sanos, se requiere la aplicación de buenas prácticas a lo largo de toda la cadena productiva: producción primaria, manufactura, transporte y comercialización. Senasa • 9 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR Para obtener alimentos seguros hay que aplicar buenas prácticas en toda la cadena productiva. Contacto directo con el animal o con sus desechos Consumo de alimentos contaminados Consumo de alimentos provenientes de un animal enfermo Transmisión de enfermedades entre los caprinos y los humanos Prevención y control de enfermedades de los caprinos Las enfermedades de los caprinos se pueden prevenir mediante la aplicación de vacunas, buenas prácticas agropecuarias y medidas de bienestar animal. Muchas de las enfermedades del ganado caprino cuentan con vacunas disponibles que son una buena inversión para el productor familiar, ya que evitan pérdidas económicas y aseguran una buena producción, que permite recuperar los costos asumidos. En el caso de los cabritos, la vacunación de las cabras preñadas permite inmunizar a través del calostro y preservar su salud durante el período de guachera. 10 • Senasa �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS Para conocer cuál es el plan de vacunación recomendado para los animales del establecimiento, consulte a un veterinario. Sin embargo, las vacunas no evitan en forma total la aparición de las enfermedades, sino que disminuyen el riesgo e impiden que se extiendan con facilidad entre los animales. Además, varias enfermedades importantes de los caprinos no cuentan con vacunas para prevenirlas ni tampoco tratamiento para su control por lo que, en caso de presentarse, se requiere aplicar estrategias para el saneamiento progresivo de la majada. En todos los casos, es necesario actuar antes que se presente la enfermedad sobre las principales formas de transmisión y contagio, procurando el bienestar de los animales y aplicando buenas prácticas agropecuarias (BPA). En este sentido, considerar el aspecto alimentario-nutricional es fundamental para asegurar buenas defensas en el animal ante agentes patógenos y prevenir la indigestión, enfermedades, abortos y muerte vinculados a la deficiencia o exceso de nutrientes importantes para su salud como el cobre, el yodo y el fósforo. Ante síntomas de enfermedad, consulte a un médico o diríjase al centro de salud más cercano. Cabe mencionar que para algunas de las enfermedades, el Senasa establece medidas que se deben cumplir en forma obligatoria, a fin de garantizar la salud de los caprinos y de los humanos. Senasa • 11 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR Vacunación Permite eliminar del establecimiento los focos de enfermedad (animales enfermos). Saneamiento progresivo del rodeo Bienestar animal + BPA Menos riesgos y más salud en los animales. Productos inocuos y de calidad. Beneficios de prevenir y controlar las enfermedades de los caprinos • • • • • • • Permite obtener productos inocuos y de calidad desde el origen. Aumenta la cantidad de cabritos nacidos vivos. Mejora la producción y la calidad de la leche y la carne. Disminuyen los costos asociados a enfermedades y mortandad. Aumentan los beneficios económicos de la actividad. Disminuyen los riesgos de zoonosis. Mejora la calidad de vida del trabajador y su familia. ALIMENTOS SEGUROS Y DE CALIDAD CABRITOS NACIDOS VIVOS MAS Y MEJOR PRODUCCIÓN 12 • Senasa COSTOS �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS ¿Cómo reconocer signos de enfermedad? Existen signos que mediante la observación permiten distinguir un animal enfermo de uno sano. Es importante conocerlos para: • tomar precauciones antes de comprarlos, de ponerlos a venta o destinarlos a la producción y/o reproducción; • tomar las primeras medidas de auxilio al animal; • evitar que la enfermedad se extienda a otros animales o enferme a las personas. Para poder realizar un seguimiento preciso de la salud, del desarrollo, de las vacunaciones y de los tratamientos aplicados en los caprinos es fundamental identificarlos y llevar un registro sanitario. Senasa • 13 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR A continuación se describen algunos signos en el cuerpo y el comportamiento del animal que indican deterioro de la salud y una posible enfermedad. SIGNOS DE ENFERMEDAD SIGNOS DE SALUD • • • • ADULTO • • • • • • • • • • CORDERO • • • • Las orejas se mueven siguiendo los sonidos Ojos brillantes, sin lágrimas Pelo suave y brilloso Nariz limpia, hocico húmedo Presencia de 6 dientes permanentes Flancos llenos, rumen con contracciones regulares Patas rectas, con buen apoyo Camina sin dificultad con pasos regulares Buen apetito Activo y atento al entorno Se mantiene junto al grupo Si está echado y nos acercamos, se para rápidamente Temperatura normal (39°39.8°) • • Ojos y nariz sin lágrimas ni lagañas Puede tomar leche solo (reflejo de succión) Ombligo sano y cicatrizado Articulaciones no inflamadas Temperatura normal (38,5° - 39°) • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Orejas caídas sin movimiento Ojos hundidos, con lágrimas o fluidos Nariz con moco, enrojecida o con costras Dientes gastados, sueltos o flojos Pelo seco y opaco, presencia de lastimaduras, gusanos, piojos o ácaros Flancos hundidos, rumen sin movilidad o con movimientos irregulares Patas con defectos, camina con dificultad o rengo Ubres inflamadas, con verrugas, con lastimaduras o deformadas Genitales inflamados Come poco o no come Se ve decaído o cambia el carácter Se aisla del grupo Si está echado y nos acercamos, no se para Fiebre (más de 40°C) Lágrimas y lagañas en los ojos Moco o fluidos en la nariz Ampollas y costras en el hocico, labios, interior de la boca. Dificultad para mantenerse parado o parálisis en patas traseras Dificultad para mamar Tos Ombligo con pus o sangre sin cicatrizar Articulaciones inflamadas Diarrea Fiebre (más de 39°) Los signos descriptos son válidos para todas las razas de caprinos 14 • Senasa �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS Ante signos de enfermedad, se debe separar los animales enfermos de la majada y consultar a un veterinario. Diagnóstico y tratamiento Es importante observar a los animales diariamente, comenzando el recorrido en las categorías más débiles (cabritos) y continuando con las más resistentes a las enfermedades (adultos). En caso de encontrar signos que indiquen enfermedad, se debe separar a los animales enfermos de la majada y recurrir a un veterinario. Como algunas enfermedades presentan signos similares, el veterinario evaluará la necesidad de realizar un análisis de laboratorio para luego determinar el tratamiento terapéutico a aplicar. Todos los medicamentos suministrados a los animales deben ser productos aprobados por el Senasa para uso en caprinos, y aplicarse según las indicaciones del veterinario. En caso de muerte sorpresiva de caprinos o abortos, debe notificarse en forma inmediata en la oficina del Senasa más cercana. A los animales muertos se les realizará una necropsia, que es una revisación para visualizar signos compatibles con enfermedades en los órganos y tejidos internos del animal. Senasa • 15 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR Ante mortandad sorpresiva de animales se debe notificar en forma inmediata en la oficina del Senasa más cercana. Es importante que el productor y los trabajadores del establecimiento conozcan los signos particulares de cada enfermedad, que son una señal de alarma para solicitar asesoramiento, aplicar las primeras medidas de control y minimizar los daños que puedan producir, prestando especial importancia a las zoonosis. A continuación se describen los signos visibles de las enfermedades más importantes que afectan a los caprinos, las formas de transmisión y las medidas a aplicar. En primer lugar se describen las enfermedades que se encuentran reguladas por normativa del Senasa, es decir, bajo control oficial. Posteriormente, se detallan enfermedades que, aunque no se encuentran reguladas por el Senasa, se recomienda controlar porque pueden provocar grandes daños a la producción, el comercio e incluso pueden enfermar a las personas. Cuando se presente un problema sanitario no deben entrar ni salir animales del establecimiento, hasta que se realice el diagnóstico y el saneamiento de la majada. 16 • Senasa ��GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR Enfermedades bajo control oficial del Senasa Nombre de la enfermedad ¿Cuáles son los signos visibles? ¿Cómo se transmite? ¿Qué medidas debo aplicar? Brucelosis • • Los animales enferman por contacto con los fluidos de un animal enfermo o el consumo de pasturas contaminadas con las bacterias. • Vacunación con ‘REV1’. Consulte en la provincia la existencia de planes de vacunación vigentes. • Ante signos similares, consultar a un veterinario. Se requiere análisis de laboratorio. • La presencia de la enfermedad debe ser informada en el Oficina del Senasa más cercana. Los humanos enferman por contacto con fetos, sangre, orina y fluidos vaginales de un animal enfermo y el consumo de lácteos no pasteurizados de animales enfermos. • Utilizar elementos de protección para asistir los partos. • Eliminar por incineración placentas, fetos y animales muertos para evitar su ingestión por otros animales. • Pasteurizar la leche antes del consumo y de elaborar productos lácteos derivados. • Ante síntomas de enfermedad, consulte a un médico o diríjase al centro de salud más cercano. Contacto con animales enfermos. La bacteria se encuentra en el aire exhalado por el animal enfermo e ingresa a un animal sano y al hombre a través de la respiración (vía aerógena). • Consultar en la Oficina del Senasa más cercana para ingresar al Plan de Control y Erradicación de TBC. • Tambos y cabañas deben cumplir con la Resolución Senasa N° 128/2012: Causada por la bacteria Brucella mellitensis, afecta diversas especies animales incluido el ser humano, provocando secuelas irreversibles en su salud. Tuberculosis (TBC) • • Causada por la bacteria Mycobacterium bovis, afecta diversas especies incluido el ser humano. • 18 • Senasa Los animales infectados presentan abortos en el último tercio de gestación, inflamación de articulaciones y de testículos en machos enteros (orquitis). En las personas se presenta fiebre intermitente o irregular de duración variable, dolor de cabeza, debilidad, sudoración, escalofríos, adelgazamiento y dolores generalizados. En los animales no siempre se presentan signos. Pueden presentar adelgazamiento a pesar de estar bien alimentados, deterioro progresivo, dificultad respiratoria, tos persistente y muerte. En el ser humano se presenta tos, fiebre, sudoración, cansancio, pérdida de peso, falta de apetito. • • • Consumo de leche o lácteos no pasteurizados procedentes de animales infectados. 1. realizar diagnóstico de tuberculosis a todos los caprinos del establecimiento (tuberculinización); 2. enviar a faena los caprinos con resultado positivo; 3. los ingresos y egresos de caprinos deben realizarse con certificado y análisis negativo. • La presencia de la enfermedad debe ser informada en el Oficina del Senasa más cercana. • Utilizar elementos de protección para el trabajo con los animales. • Pasteurizar la leche antes del consumo y de elaborar productos lácteos derivados (manteca, queso, etc.). • Ante síntomas de enfermedad, consulte a un médico o diríjase al centro de salud más cercano. �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS Nombre de la enfermedad ¿Cuáles son los signos visibles? ¿Cómo se transmite? ¿Qué medidas debo aplicar? Rabia paralítica o paresiante • • • Causada por el virus de la rabia, afecta a los animales de sangre caliente, incluso al ser humano. La enfermedad se presenta en forma más frecuente en bovinos, aunque también puede presentarse en los caprinos. • Actualmente, el virus que provoca la enfermedad se encuentra difundido en las provincias ubicadas al norte del paralelo 31° S. Hidatidosis (enfermedad de las bolsitas) Causada por un parásito de los perros (Echinococcus granulosus), que provoca la formación de quistes en las vísceras de varias especies de animales, incluido el hombre. Genera pérdidas económicas por el decomiso de vísceras en la faena. • • • El animal presenta excitación e inquietud, musculatura contraída, aumento de la salivación, pérdida de apetito y tendencia a aislarse. En las personas se presenta debilidad, malestar general, fiebre, dolor de cabeza, agitación. Muchos animales infectados se faenan antes de manifestar signos de enfermedad. • El humano se enferma al tomar contacto con saliva, lágrimas, ojos y tejido nervioso de los animales infectados, durante la faena, al suministrar medicamentos u otras actividades de manejo. Cumplir con la Resolución Senasa N° 25/2005: 1. denunciar rápidamente la presencia de animales con signos nerviosos en la Oficina del Senasa más cercana; 2. no manipular animales con signos nerviosos; 3. enterrar o incinerar los cadáveres; 4. informar al Senasa la sospecha de refugios de vampiros; 5. en caso de brote de rabia, vacunación obligatoria de todas las especies susceptibles del establecimiento (foco) y de la zona de perifoco (establecimientos ubicados a 10 km a la redonda) o según indicación del Senasa. • Se recomienda la vacunación anual de las especies animales susceptibles, en la zona de Rabia endémica (al norte del paralelo 31°). Puede ver en anexo el mapa con la dispersión de la Rabia paresiante en Argentina. • Los veterinarios y personas en contacto con animales sospechosos deben consultar en el centro de salud sobre la vacunación. Ante síntomas de enfermedad, consulte a un médico o diríjase al centro de salud más cercano en forma inmediata. • Materia fecal de perros. • No alimentar a los perros con vísceras crudas (especialmente hígado y pulmones). • Contacto con un perro infestado y mala higiene de manos (los perros al lamerse diseminan el parásito desde el ano hasta el resto del cuerpo). • Desparasitar los perros en forma sistemática con un antiparasitario a base de Praziquantel. Consulte al veterinario el modo y la frecuencia para realizarlo. • Faenar animales para consumo en lugares que eviten el acceso de los perros y permitan la eliminación de las vísceras (carnicería y pozo). Consumo de alimentos (verduras y agua) contaminados con las heces de perros infestados. • No dejarse lamer por los perros ni darles besos. • Lavarse siempre las manos con agua y jabón antes de comer. • Evitar que los perros ingresen a la zona de huerta o tengan acceso al pozo de agua. • Siempre lavar las frutas y verduras correctamente antes de comerlas. Disminución del crecimiento, de la producción de leche, carne y lana, y de la tasa de natalidad. Las personas desarrollan quistes principalmente en el hígado y los pulmones, pero pueden llegar a otros lugares del cuerpo. A través de la mordedura del vampiro común Desmodus rotundus infectado, que muerde a los animales para alimentarse de su sangre. • • Los perros se contagian consumiendo vísceras/ achuras crudas con quistes de ovejas, cabras, bovinos y cerdos. Senasa • 19 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR Nombre de la enfermedad ¿Cuáles son los signos visibles? ¿Cómo se transmite? ¿Qué medidas debo aplicar? Fiebre Q • Los animales pueden no presentar signos visibles. • • Ante signos similares, consultar a un veterinario. • En cabras provoca problemas reproductivos (abortos tardíos, muerte prenatal) y respiratorios. La bacteria sobrevive como espora en el ambiente, contamina el polvo y es transportada por el viento. • La presencia de la enfermedad debe ser notificada en la oficina del Senasa más cercana. Consumo de leche y lácteos derivados de animales enfermos o contaminados, sin pasteurizar. • Utilizar elementos de protección (guantes, botas, barbijos) para asistir los partos y tomar contacto con los animales. • Eliminar por incineración placentas, fetos y animales muertos para evitar su ingestión por otros animales. Contacto con placentas, fetos abortados, orina y heces de animales enfermos, o ambientes contaminados con estos desechos. • Limpiar y desinfectar los materiales que puedan estar contaminados. • Pasteurizar la leche antes del consumo y de elaborar productos lácteos derivados (manteca, queso, etc.). Causada por la bacteria Coxiella burnetii, que afecta a diversas especies animales incluidos los humanos. • Carbunclo bacteridiano o Anthrax Causada por la bacteria Bacillus anthracis, que afecta a los caprinos y otros rumiantes, siendo también transmisible al hombre. 20 • Senasa • • En el humano se presenta como una gripe con fiebre alta, dolor de cabeza, de músculos, articulación, náuseas, vómitos, diarrea y tos seca. Puede derivar en neumonía, hepatitis, fatiga crónica y muerte. Muerte súbita de animales sin signos previos, sangrado abundante por nariz, boca y ano. En las personas, según la forma de contagio, puede producir picazón y ampollas en la piel, estado similar a la gripe, dolor abdominal, diarrea, vómito con sangre, entre otros. • • • Inhalación de partículas con esporas de la bacteria. • Picadura de garrapatas. Las garrapatas con sus heces también contaminan el ambiente. • La bacteria resiste muchos años en el medio ambiente en forma de esporas y se transporta por el viento junto con el polvo. • Vacunación preventiva. • Ante signos similares, consultar a un veterinario. • La presencia de la enfermedad debe ser notificada en el oficina del Senasa más cercana. Contacto de heridas de la piel con animales enfermos, pieles, pelos, productos óseos y lana provenientes de animales infectados. • Eliminar los cadáveres de animales por incineración. • Limpiar y desinfectar los materiales que puedan estar contaminados. • • Inhalación de esporas del ambiente contaminado. • Consumo de carne contaminada. �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS Nombre de la enfermedad ¿Cuáles son los signos visibles? ¿Cómo se transmite? ¿Qué medidas debo aplicar? Leptospirosis • • • Vacunación preventiva. • Ante signos similares, consultar a un veterinario. • La presencia de la enfermedad debe ser notificada en la oficina del Senasa más cercana. • Utilizar siempre botas y guantes para realizar las tareas del establecimiento. • Realizar control de roedores, mantener la limpieza y el desmalezado del predio. • Limpiar los bebederos de los animales y recambiar el agua con frecuencia. • Vacunación con EG95. • Ante signos similares, consultar a un veterinario. • La presencia de la enfermedad debe ser notificada en el oficina del Senasa más cercana. • No hay tratamiento, las acciones a aplicar son preventivas. • Lavarse bien las manos después de tocar un perro. • Desparasitar a los perros cada 45 días con un antiparasitario como el Praziquantel. • No alimentar a los perros con carne cruda ni vísceras crudas. • Evitar que los perros y los animales ingresen a la zona de huerta y siempre lavar las frutas y verduras correctamente antes de comerlas. Causada por la bacteria Leptospira interrogans, que afecta la salud del ser humano y puede ser mortal. Hidatidosis (enfermedad de las bolsitas) Causada por un parásito de los perros (Echinococcus granulosus), que provoca la formación de quistes en las vísceras de varias especies de animales, incluidos los humanos. Genera pérdidas económicas por el decomiso de vísceras en la faena. • • • • Fiebre, problemas reproductivos (abortos). En las personas se presenta con síntomas similares a la gripe. Puede causar insuficiencia renal, hemorragias intestinales o pulmonares, entre otros. Muchos animales infectados se sacrifican antes de manifestar signos de enfermedad. Disminución del crecimiento, de la producción de leche, carne y lana; y de la tasa de natalidad. Las personas desarrollan quistes principalmente en el hígado y los pulmones, pero pueden llegar a otros lugares del cuerpo. • La bacteria se encuentra en la orina de roedores infectados que contaminan suelos, aguas dulces y otros materiales en los que se encuentran. Los animales y las personas se enferman por contacto a través de heridas, ojos, nariz y boca, consumo de agua contaminada, o inhalación de partículas con la bacteria. • Se presenta mayormente en época de lluvia e inundaciones. • Materia fecal de perros. • Contacto con un perro infestado y mala higiene de manos (los perros al lamerse diseminan el parásito desde el ano hasta el resto del cuerpo). • • Consumo de alimentos (verduras y agua) contaminados con las heces de perros infestados. Los perros se contagian consumiendo vísceras/achuras crudas con quistes de ovejas, cabras, bovinos y cerdos. Senasa • 21 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR Nombre de la enfermedad ¿Cuáles son los signos visibles? ¿Cómo se transmite? ¿Qué medidas debo aplicar? Leptospirosis • • • Vacunación preventiva de animales. Para más información consultar en la Oficina del Senasa más cercana. • La presencia de la enfermedad debe ser notificada en el Oficina del Senasa más cercana. • Realizar control de roedores y mantener desmalezado el predio. • Limpiar los bebederos y comederos de los animales y recambiar el agua con frecuencia. • Utilizar siempre botas, guantes, protección en boca y ojos para realizar las limpiezas en el establecimiento. • Evitar sumergirse en zonas inundadas. • Ante síntomas de enfermedad, consulte a un médico o diríjase al centro de salud más cercano. Causada por la bacteria Leptospira interrogans, afecta varias especies animales incluido el hombre. • Abortos, baja fertilidad, reducción en la producción láctea, color amarillento en ojos y mucosas (ictericia). En las personas, los síntomas más comunes son: ictericia (color amarillo en la piel y mucosas), inapetencia; decaimiento, fiebre; dolor de cabeza, hepático o renal, vómitos y hemorragias, dificultad respiratoria y tos. • • Orina u otros fluidos de roedores, perros, cerdos y otros animales infectados, que contaminan suelos, aguas dulces y otros materiales en los que se encuentran. Los animales y las personas se enferman por contacto a través de la piel, ojos, nariz y boca o consumo de agua contaminada. El riesgo de transmisión aumenta en zonas inundadas o con aguas estancadas, barro, vegetación contaminados. Enfermedades de control recomendado Nombre de la enfermedad ¿Cuáles son los signos visibles? ¿Cómo se transmite? ¿Qué medidas debo aplicar? Gangrena gaseosa y Tétanos • Decaimiento y parálisis de miembros. • • Vacunación preventiva. • Inflamación y coloración rojiza de la piel, fiebre. • Desinfectar heridas con agua oxigenada. • • Rigidez, temblores y postración. Observar y palpar al animal en zonas donde haya sufrido heridas o actos quirúrgicos. Si hay inflamación, consultar a un veterinario para aplicar un tratamiento antibiótico adecuado. • Infección generalizada y muerte. • Lavar y desinfectar los instrumentos a utilizar en los animales (esquiladora, bisturís y agujas). • Evitar la presencia de elementos cortantes en el corral. • Vacunación: a las madres 1 mes antes del parto, a las crías a los 4-6 meses de vida con revacunación a las 3-4 semanas y vacunación sistemática cada 6 meses a toda la majada. • Ante signos similares, consultar a un veterinario. Para determinar el diagnóstico se requiere necropsia y análisis de laboratorio. • La presencia de la enfermedad debe ser notificada en el oficina del Senasa más cercana. • Aplicar un manejo nutricional adecuado que evite la indigestión. Causada por bacterias del género Clostridium, que se encuentran en el medioambiente y cuando se dan las condiciones apropiadas (heridas, falta de oxígeno en los tejidos), se reproducen y generan toxinas que enferman al animal. Enterotoxemia • Causada por las toxinas de la bacteria Clostridium perfringens, que se encuentra presente en el tubo digestivo de los rumiantes. • 22 • Senasa Fiebre, inflamación del abdomen, diarrea, postración, convulsiones, incoordinación, parálisis y extensión de la cabeza hacia atrás (opistótonos) y pataleo. Es poco frecuente observar los signos. Es más frecuente encontrar los animales muertos en el campo. • • Esquila, descole, castración, golpes, heridas y otros actos quirúrgicos que permitan la falta de oxigenación de los tejidos y la multiplicación de las bacterias. Su aparición depende de factores desencadenantes, no se contagia entre animales. Malos pastos, cambio en la alimentación e indigestión, estrés por transporte y cambios de temperatura son elementos que predisponen a la enfermedad. �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS Nombre de la enfermedad ¿Cuáles son los signos visibles? ¿Cómo se transmite? ¿Qué medidas debo aplicar? Neumonía • • Ante signos similares, consultar a un veterinario. • Fiebre, depresión, pérdida del apetito. • Procurar la mejora de las condiciones de los animales en el establecimiento. • Dificultad para respirar. Está vinculada al manejo deficiente de la majada: alimentación inadecuada, exposición al frío, lluvia, calor, hacinamiento, edad y deficiente condición corporal. • Causada por agentes físicos, químicos o biológicos (virus, bacterias, parásitos y hongos). Descargas nasales serosas y purulentas. Colibacilosis • Materia fecal blanca amarillenta de consistencia cremosa a casi líquida. • Materia fecal. • • La falta de higiene, la falta de desinfección del cordón umbilical, el hacinamiento, el calor y la humedad excesiva predisponen a la enfermedad. Ante signos similares, consultar a un veterinario para confirmar el diagnóstico y aplicar tratamiento antibiótico oral. • Separar al animal con diarrea para no contaminar el ambiente y evitar enfermar al resto. • Suministrar agua potable a los cabritos para evitar la deshidratación. • Mantener buena higiene de los corrales. • Evitar el hacinamiento de animales, procurar lugares sombreados durante el día y reparados durante la noche, pero con acceso al sol. • Ante signos similares, consultar a un veterinario. Requiere análisis de laboratorio. • La presencia de la enfermedad debe ser notificada en la oficina del Senasa más cercana. • No hay tratamiento para la enfermedad, las acciones deben centrarse en la prevención. Causada por la bacteria Escherichia coli, que afecta a los cabritos durante la primera semana de vida y puede causar su muerte. Paratuberculosis Causada por la bacteria Mycobacterium avium, que afecta en forma crónica los intestinos de varias especies de mamíferos. Ectima contagioso Causada por un virus que afecta principalmente a los cabritos, durante la etapa de amamantamiento. • Mortandad de cabritos si no se aplica tratamiento. • Adelgazamiento grave, aunque el apetito es normal. • Ingestión de agua y alimento contaminados. • Fiebre baja o intermitente, depresión. • • Ocasionalmente diarrea o heces blandas. Leche y calostro de animales enfermos. • Ubres sucias de animales enfermos. • Excremento de animales enfermos. • El virus puede • mantenerse activo en las costras de- • secadas que caen al suelo durante 2 • meses. • • • Lesiones y costras en el hocico, labios, interior de la boca, ubre y patas. Los cabritos dejan de comer, tienen abundante saliva en la boca y fiebre. En adultos puede extenderse a las mamas, pezones, vagina y vulva, región perianal, escroto y glande. • La mala nutrición y la presencia de parásitos externos e internos propician la enfermedad. • Vacunación. Ante signos similares, consultar a un veterinario. Limpieza de lesiones con soluciones de yodo povidona y pomadas indicadas por el veterinario. Mantener la buena higiene de los corrales. Senasa • 23 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR Nombre de la enfermedad ¿Cuáles son los signos visibles? ¿Cómo se transmite? ¿Qué medidas debo aplicar? Coccidiosis • • • Causada por parásitos coccidios que no se ven a simple vista y afectan a los cabritos a partir del mes de vida. Diarrea de color verde, a veces con sangre o coágulos y mucus. Ante signos similares, consultar a un veterinario para confirmar el diagnóstico y aplicar un tratamiento específico. • Región perianal manchada de color oscuro. • Separar al animal con diarrea para no contaminar el ambiente y evitar enfermar al resto. • Suministrar agua potable a los animales para evitar la deshidratación. • Realizar un análisis de materia fecal al 10% del rodeo. Solo debe aplicarse antiparasitarios ante un resultado positivo y con asesoramiento veterinario. • Separar al animal con diarrea para no contaminar el ambiente y evitar enfermar al resto. • Suministrar agua potable a los animales con diarrea para evitar la deshidratación. • Cocinar la carne en forma adecuada y aplicar buenas prácticas en el establecimiento. • Ante signos, consultar al veterinario para aplicar el tratamiento antibiótico adecuado. • Respetar el horario de ordeñe. • El ordeñador debe tener las uñas cortas y limpias. • Lavarse las manos antes de ordeñar y todas las veces que sea necesario. Parásitos gastrointestinales Son diversos parásitos que ingresan al sistema digestivo de los caprinos a través de agua o pasturas contaminadas. Afectan la nutrición y algunos de ellos pueden enfermar a las personas. Mastitis Causada por bacterias que generan infección en las ubres de las cabras lecheras. Produce disminución de producción en los tambos y aumento de costos por enfermedad. 24 • Senasa • Ojos hundidos por la deshidratación y anemia (la parte interna de los párpados se ve blanca en vez de rosada). • Muerte súbita sin síntomas aparentes. • Debilidad, adelgazamiento, pelo duro y opaco, deshidratación, dificultad respiratoria y diarrea. • • • En las personas puede observarse dolor abdominal, pérdida de apetito, náuseas, diarrea y adelgazamiento. Primeros signos: ubres calientes, enrojecidas, leche con grumos. La cabra no se deja mamar u ordeñar. La infección aguda provoca ubres inflamadas, de color azulado-verdoso, pudiendo provocar la muerte si no se trata a tiempo. Los animales se infectan al ingerir huevos del parásito con las pasturas contaminadas. • Luego los parásitos son eliminados por materia fecal y contaminan el ambiente. • Pasturas contaminadas con heces de perros, gatos y otros animales infestados. • Agua contaminada con huevos de parásitos. • Por lo general son expulsados en la materia fecal contaminando el ambiente. • Las personas pueden enfermar a través del consumo de carne mal cocida o alimentos contaminados con materia fecal. • Mala higiene, alimentación y nutrición. • Rutina de ordeñe incorrecta, equipos de ordeñe en mal funcionamiento. • Tratamientos mal realizados o no terminados en tiempo y forma. • Heridas y golpes en el campo. �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS Nombre de la enfermedad ¿Cuáles son los signos visibles? ¿Cómo se transmite? ¿Qué medidas debo aplicar? Sarna • Costras amarillasnegruzcas en hocico y cara (hocico negro). • Contacto directo entre caprinos infestados y caprinos sanos. • Ante signos, consultar al veterinario para aplicar el tratamiento antisárnico adecuado. • Secreciones marrones en las orejas, engrosamiento y arrugas en la zona de la oreja, movimientos de cabeza (puede confundirse con lesiones de garrapatas). • Rascado en postes, troncos y bebederos donde previamente se rascó un animal enfermo. • Costras entre las pezuñas, alrededor del ano y el escroto. Piojos • • Ante signos, consultar al veterinario para aplicar el tratamiento parasitario adecuado. • La picazón provoca rascado y la molestia hace que el animal coma menos y pierda peso. Contacto directo entre caprinos infestados y caprinos sanos. • Son parásitos externos de las cabras, que chupan su sangre o mastican la piel y pelos. Presencia de individuos (piojos) entre los pelos. Garrapata de la oreja • Presencia de garrapatas en las orejas. • • Eliminación de garrapatas y tratamiento local. Parásito externo que se alimenta de la sangre y afecta a los animales domésticos y al hombre. Al situarse en las orejas de los caprinos, provoca secreción de cera y tapona el oído. • Gran cantidad de cera en las orejas. Contacto con animales con garrapatas. • Del medio ambiente. Gusano de la nariz • Abundante cantidad de moco y estornudos. • Presencia de moscas Oestrus ovis en el medio ambiente. • Ante signos, consultar al veterinario para aplicar el tratamiento parasitario adecuado. • Se recomienda aplicar un tratamiento anual en el otoño con antiparasitarios inyectables que permiten controlar las larvas y repetir el tratamiento en primavera. • Ante signos, consultar al veterinario para aplicar el tratamiento antiparasitario adecuado. Causada por ácaros que parasitan la piel de los caprinos. Según el ácaro involucrado puede afectar principalmente la cara, las orejas, las patas, el cuello, el tórax, los flancos y la zona perianal. Causada por la mosca Oestrus ovis, que coloca • sus larvas en los orificios nasales de las cabras y las ovejas, provocando irrita- • ción e inflamación. Si no se trata puede provocar la muerte del animal. • Mosca de los cuernos La mosca Haematobia irritans es un parásito externo que se alimenta de la sangre de los caprinos y otros rumiantes, y desarrolla su ciclo biológico en la materia fecal fresca. Su presencia irrita a los animales y afecta la producción. Pérdida de peso e irritación. • Las larvas tienen ciclos biológicos relativamente cortos en el verano, cayendo al suelo y convirtiéndose en nuevas moscas. En invierno se mantienen en el interior de la cabeza del animal. • Presencia de la mosca Haematobia irritans en el medio ambiente. Problemas respiratorios por congestión nasal. Algunas veces las larvas migran hacia el cerebro causando una encefalitis con síntomas nerviosos y muerte. • Presencia de gran cantidad de moscas en el cuerpo del caprino. • Las moscas generan estrés, irritación y pérdida de energía. • Alergia, prurito y úlceras. Senasa • 25 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR Medidas preventivas La aplicación de buenas prácticas agropecuarias y de bienestar animal, permiten prevenir enfermedades en las cabras, mejorar la producción y obtener alimentos seguros y de calidad desde el origen. A continuación se detallan las medidas básicas a considerar en el manejo de los animales y del establecimiento: AGUA Y ALIMENTO • Brindar agua fresca y limpia a toda la majada, incluso a los cabritos. • Suministrar alimento que cubra las necesidades nutricionales del animal, de acuerdo a su estado biológico y de desarrollo. A las cabras preñadas no les puede faltar alimento 45 días antes y después del parto. • En los cabritos, verificar la toma del primer calostro dentro de las primeras horas de vida. No alimentar a los cabritos con leche de animales enfermos. Si no hay alternativa, pasteurizarla antes. LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN • Lavar y desinfectar con frecuencia los bebederos y comederos. • Evira la presencia de basura, desechos y eliminar las malezas en las cercanías del establecimiento. • Eliminar mediante incineración placentas, fetos y animales muertos para evitar su ingestión por animales carnívoros. • Realizar control de plagas (roedores e insectos) con métodos amigables con el ambiente. • Limpiar y desinfectar pisos, instrumentos y materiales en forma frecuente. INSTALACIONES • Instalar cecados para contener a los animales, que impidan la entrada y salida del establecimiento, el contacto con otras especies y el ingreso a la zona de la huerta. • Brindar a los animales techo y reparo para cubrirse de la lluvia en los temporales, del frío en el invierno y del sol en el verano. • Destinar un lugar específico para el parto y para los cabritos recién nacidos. • Procurar que los accesos no tengan pozos ni zanjas profundas que provoquen tropiezos o caidas de los animales. • Los corrales deben instalarse en zonas elevadas, para que no se inunden. • Si se realiza ordeñe en el establecimiento, procurar un espacio techado, con reparo, con piso de concreto, que permita su limpieza frecuente. 26 • Senasa �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS ARREO • Tratar a las cabras con tranquilidad y respetar su paso. • La tranquilidad de las cabras disminuye la posibilidad de enfermarse. SERVICIO Y REPRODUCCIÓN • La selección de los animales reproductores es importante para favorecer la producción y la calidad de los productos obtenidos de los animales. • Para facilitar el manejo de la majada, es recomendable estacionar los servicios de monta: permite asegurar la disponibilidad de alimento adecuado, organizar las vacunaciones, favorecer el manejo sanitario y productivo en general. • Recortar los pelos de la cola de las cabras para evitar lastimaduras, infecciones, bicheras en el posparto. TRABAJADOR • Utilizar ropa exclusiva y elementos de protección para el trabajo con los animales ( botas, guantes, antiparras). Es preferible que las botas sean de plástico para suu fácil limpieza. • Cumplir con el plan de vacunación recomendado. • Ante síntomas de enfermedad, acudir a un médico. El trabajador enfermo no debe tomar contacto con los animales. REGISTRO SANITARIO • Identificar a los animales de acuerdo a la normativa vigente. • Llevar un registro de todas las prácticas de manejo llevadas a cabo en los animales (vacunas, análisis, tratamiento, ingresos, egresos). • Llevar un registro de todas las prácticas llevadas a cabo en el establecimiento (limpiezas, desinfecciones, control de plagas). Senasa • 27 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR DOCUMENTACIÓN Y TRÁMITES A continuación se detallan los principales trámites y la documentación requerida a los productores agropecuarios de escala familiar que se dediquen a la crianza de caprinos para desarrollar su actividad en el marco de la normativa vigente. Inscripción en el ReNAF El ReNAF es el Registro Nacional de la Agricultura Familiar de la Secretaría de Agricultura Familiar (SAF) del Ministerio de Agroindustria de la Nación (Minagro). Tiene como fin visibilizar y fortalecer el trabajo de los agricultores y agricultoras familiares en todo el país. El registro es voluntario, gratuito, permanente y de alcance nacional. Para registrarse hay distintas opciones de preinscripción: • A través de la internet en: www.agroindustria.gob.ar/renaf • En las delegaciones provinciales de la SAF o a través de sus técnicos de terreno. • Solicitando la preinscripción en alguna institución u organización habilitada (INTA, Senasa, y otros), municipios o a través de organizaciones de la Agricultura Familiar. Una vez verificados los datos, se otorga el alta definitiva dentro del padrón del ReNAF. Inscripción en el Renspa El Renspa es el Registro Nacional Sanitario de Productores Agropecuarios, actualmente reglamentado por la Resolución Senasa N° 423/2014. La inscripción es obligatoria para todos los productores agropecuarios del país. Este trámite se realiza en la oficina del Senasa correspondiente según la ubicación del establecimiento, presentando original y copia del Documento Nacional de Identidad (DNI), la Constancia Única de Identificación Laboral o Tributaria (CUIL o CUIT) y la documentación sobre el campo donde se realiza la actividad (en caso de que le sea solicitada). Para quedar enmarcado en las condiciones particulares del sector de la agricultura familiar, se debe presentar la inscripción en el ReNAF. Como constancia de la inscripción se entregará al productor una credencial Renspa, personal e intransferible, emitida por el sistema informático. 28 • Senasa �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS Identificación de los caprinos Los métodos de identificación para la especie caprina son establecidos a nivel provincial, excepto los animales bajo vigilancia epidemiológica oficial del Senasa, que son identificados con sistema de caravana. Para más información sobre los métodos de identificación y los trámites a realizar, consultar en la delegación municipal o provincial. Permiso de uso de suelo y/o habilitación del establecimiento Los municipios y/o las provincias establecen requisitos para obtener el permiso de uso de suelo y/o la habilitación del establecimiento productivo. Para obtener mayor información sobre los requisitos, consulte en la delegación municipal y provincial correspondiente. Emisión del Documento de Tránsito Electrónico (DTe) Los movimientos de caprinos de un establecimiento a otro, por cualquier motivo, deben realizarse con DTe. El DTe debe solicitarse antes del movimiento en la oficina del Senasa correspondiente al campo de origen de los caprinos, presentando la credencial del Renspa, el boleto de señal o identificación de los animales a nombre del titular y las existencias del establecimiento actualizadas. La emisión del DTe va a depender del origen, destino y condición sanitaria de los animales a transportar. Una vez que los animales arriban al destino, el productor debe “cerrar el movimiento” en la oficina del Senasa de destino, dentro de los cinco días hábiles. En caso que el movimiento se realice con motivo de veranada o trashumancia, se solicita un DTe especial que contempla dicha situación y el cierre del movimiento se realiza una vez que regresa al establecimiento de origen. Algunas provincias establecen requisitos adicionales para el traslado de animales, que deben ser consultados en la dependencia municipal o provincial correspondiente. Senasa • 29 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR NORMATIVA Disposición DNSA N° 12/2007. Aprueba el Plan de Vacunación de Brucelosis Caprina en la provincia de San Juan. Senasa. Buenos Aires, 19 de marzo de 2015. Disposición DNSA N° 2/2013. Aprueba el Plan de Vacunación obligatorio de Brucelosis Caprina en la provincia de Salta. Senasa. Buenos Aires, 28 de mayo de 2013. Disposición DNSA N° 1/2015. Aprueba el Plan de Vacunación de Brucelosis (Brucella Melitensis) en la Provincia de Catamarca 2012-2022. Senasa. InfoLEG. Buenos Aires, 19 de marzo de 2015. Resolución N° 899/2009. Aprueba el Plan de Vacunación de Brucelosis Caprina en la provincia de Mendoza. Senasa. Boletín Oficial de la República Argentina. Buenos Aires, 4 de diciembre de 2009. Resolución N° 128/2012. Aprueba el Plan Nacional de Control y Erradicación de la Tuberculosis Bovina en la República Argentina. Senasa. Boletín Oficial de la República Argentina. Buenos Aires, 21 de marzo de 2012. Resolución 459/12. Aprueba el Plan Marco de Control de la Hidatidosis en la República Argentina. Boletín Oficial de la República Argentina. Buenos Aires, 28 de septiembre de 2015. 30 • Senasa �Dirección Nacional de Sanidad Animal • Coordinación de Agricultura Familiar • CAPRINOS BIBLIOGRAFÍA Bedotti D. y Rossanigo C. (2011). Manual de reconocimiento de enfermedades del caprino. Diagnóstico de las enfermedades más comunes en la región centro oeste del país. La Pampa: Ediciones INTA. PROCAL II (Programa de Gestión de Calidad y Diferenciación de los alimentos) (2011). Caracterización del sector caprino en la Argentina [en línea]. PlaNet Finance. Consultado el 29 de septiembre de 2015 en <http://www.alimentosargentinos.gob.ar/contenido/ procal/estudios/04_Caprino/SectorCaprino_Argentina.pdf> PRODECO (Proyecto de Desarrollo del Centro Oeste) (2006). Manual para el Productor de Cabras. Formosa: Ministerio de Planificación, Inversión, Obras y Servicios Públicos de la Provincia de Formosa. Lanari, M.R. (2008). “Producción de fibras caprinas -Mohair y Cashmere- en Argentina”. Revista Argentina de Producción Animal, 28 (3), 255-259. Robles, C. A. (1998). Enfermedades clostridiales del ganado (1.a ed.). Bariloche: Grupo de Salud Animal-INTA. Trezeguet, M. (2010). Producción caprina. Santa Fe: edición del autor. Senasa • 31 �GUÍA DE SANIDAD ANIMAL PARA LA AGRICULTURA FAMILIAR ANEXO Distribución de la garrapata bovina en el territorio argentino Fuente: Programa de Rabia Paresiante - Senasa https://viejaweb.senasa.gov.ar/prensa/Home/PUBLICACIONES/FOLLETOS/RABIA%20PARESIANTE.pdf Fecha: 30/11/2015 32 • Senasa ��� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Guía de sanidad animal para la agricultura familiar: caprinos Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimenaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2016 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Dirección Nacional de Sanidad Animal. Coordinación de Agricultura Familiar Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0015 Abstract A summary of the resource. Esta guía está destinada a productores familiares que se dedican a la crianza de caprinos. Contiene información útil sobre las enfermedades de los caprinos de mayor impacto en la producción y las que poseen consecuencias para la salud de las personas, con el objetivo de favorecer el desarrollo integral del emprendimiento familiar. Table Of Contents A list of subunits of the resource. <div style="text-align: left;">ACERCA DEL SENASA</div> <div style="text-align: left;">El Senasa y la agricultura familiar</div> <div style="text-align: left;">Muestreos oficiales</div> <div style="text-align: left;">Asesoramiento sanitario</div> <div style="text-align: left;">ACERCA DE LA PRODUCCIÓN CAPRINA</div> <div style="text-align: left;">ACERCA DE LAS ENFERMEDADES DE LOS CAPRINOS</div> <div style="text-align: left;">Prevención y control de las enfermedades de los caprinos</div> <div style="text-align: left;">Beneficios de prevenir y controlar las enfermedades en los caprinos</div> <div style="text-align: left;">¿Cómo reconocer signos de enfermedad?</div> <div style="text-align: left;">Diagnóstico y tratamiento</div> <div style="text-align: left;">Enfermedades bajo control oficial del Senasa</div> <div style="text-align: left;">Medidas preventivas</div> <div style="text-align: left;">DOCUMENTACIÓN Y TRÁMITES</div> <div style="text-align: left;">NORMATIVA<br />BIBLIOGRAFÍA</div> <div style="text-align: left;">ANEXO</div> AGRICULTURA FAMILIAR Enfermedades de los Caprinos https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/171320ae3fd098c7f3a9be4124bab5a3.pdf b7bee07ed84f1d586b1873d82a860fe8 PDF Text Text BRUCELOSIS (B. abortus, B. melitensis, B. suis) 2019 Laboratorio de Referencia OIE/FAO para Brucelosis Coordinación de Bacteriología Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico �Brucelosis MANUAL DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO (B. abortus, B. melitensis, B. suis) Versión 4.0/2019 Elaborado por: Departamento Brucelosis (Laboratorio de Referencia para OIE/FAO) Ana M. Nicola, M.V., MSc. Sebastián Elena, M.V., MSc. Cristina Franco, Vet., MSc. Aprobado por: Bernardo Alonso, M.V. Coordinación Bacteriología Eduardo Maradei, M.V. Dirección Laboratorio Animal Carlos Zenobi, M.V., MSc. Dirección General de Laboratorios y Control Técnico �OBJETIVO El presente Manual tiene como objetivos: ▪ Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los Laboratorios que realizan el diagnóstico serológico de la Brucelosis en diferentes especies animales inscriptos en la Red de Laboratorios de SENASA. ▪ Proporcionar a la Red de Laboratorios de SENASA un instrumento que facilite el desarrollo adecuado, sistematizado y estandarizado de los procedimientos técnicos que se realizan en los laboratorios. ▪ Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de calidad que deben cumplirse, cuando se desarrolle un procedimiento técnico. ▪ Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de las actividades del laboratorio. Las técnicas diagnósticas descriptas en el presente Manual son las internacionalmente reconocidas y recomendadas por la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL (OIE) y EL SENASA. Página 2 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �INDICE Definiciones y Abreviaturas 4 Medidas Generales de Bioseguridad y Seguridad en el Laboratorio 5 Introducción Brucelosis 9 Procedimientos de Trabajo (ingreso/rechazo de muestras) 14 Prueba de screening con antígenos tamponados en placa (BPAT y RBT) 17 Prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT y 2-ME) 20 Prueba de anillo en leche 26 ELISA Indirecto 29 ELISA por competición / bloqueo 32 Ensayo de Polarización Fluorescente 35 Fijación de complemento 38 Normativa vigente 57 Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis 58 Anexo I Lavado y desinfección de manos 60 Anexo II Modelo de Planilla de emisión de resultados 62 Bibliografía 64 Página 3 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �DEFINICIONES / ABREVIATURAS � Ag: Antígeno � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � Biovariedad: bv BPAT (Buffered plate antigen test): Aglutinación con antígeno bufferado en placa CELISA: Enzimoinmunoensayo competitivo C’: Complemento de cobayo DILAB: Dirección General de Laboratorios y Control Técnico DLA: Dirección de Laboratorio Animal DNSA: Dirección Nacional de Sanidad Animal DT: Dilución de Trabajo ELISA: Enzimoinmunoensayo FCT: Fijación de Complemento test FPA: Ensayo de Polarización Fluorescente GR: Glóbulos Rojos IELISA: Enzimoinmunoensayo Indirecto IgG: Inmunoglobulina G IgM: Inmunoglobulina M LPS: Lipopolisacárido 2-ME: 2- Mercaptoethanol M: Molar mP: milipolarización MRT (PAL): Prueba de anillo en leche OIE: Organización Mundial de Sanidad Animal PAC: Poder anticomplementario RBT: Rosa de Bengala Test RENSPA: Registro Nacional Productor Agropecuario SAT: Seroaglutinación lenta en tubo SENASA: Servicio de Sanidad y Calidad Agroalimentaria SH: Sistema Hemolítico UI/ml: Unidades Internacionales por mililitro UIFCT/ml: Unidad Internacional fijadora del complemento Test por mililitro UA: Unidad de Antigeno UC: Unidad de Complemento UH: Unidad de Hemolisina Página 4 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �MEDIDAS GENERALES LABORATORIO DE BIOSEGURIDAD Y SEGURIDAD EN EL Se entiende por Bioseguridad: "La disciplina que trata el manejo seguro y la contención de microorganismos infecciosos y materiales biológicos peligrosos". La práctica del manejo seguro de microorganismos patógenos y sus toxinas en el laboratorio biológico se realiza a través de la aplicación de los principios de contención y la evaluación de riesgos. Principios de Bioseguridad: El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales infecciosos en el medio ambiente del laboratorio, donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos. La contención primaria, la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposición a agentes infecciosos, es provista tanto mediante buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de Equipos de Protección Personal (EPP) de seguridad adecuados. La aplicación de vacunas al personal cuando corresponda, puede brindar un mayor nivel de protección del personal. La contención secundaria, la protección del medio ambiente externo al laboratorio de la exposición a materiales infecciosos, se logra a través de una combinación del diseño de la instalación y prácticas operativas. Por lo tanto, los tres elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos. Prácticas y Técnicas de Laboratorio. El elemento más importante de la contención es el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas estándares. Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales, y también deben estar capacitados y ser expertos en las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura. El director o la persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitación adecuada del personal. Cada laboratorio está obligado a desarrollar o adoptar un manual de operaciones o de bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se debe alertar al personal acerca de los riesgos especiales y se le debe exigir que lea y cumpla las prácticas y procedimientos requeridos. El personal capacitado y bien informado acerca de las técnicas de laboratorio adecuadas, procedimientos de seguridad y riesgos asociados a la manipulación de agentes infecciosos debe ser el responsable de la conducción de los trabajos con cualquier agente o material infeccioso. Esta persona tiene la obligación de consultar a profesionales especializados en bioseguridad u otros profesionales de la salud y seguridad respecto de la evaluación del riesgo. Cuando las prácticas de laboratorio estándares no son suficientes para controlar los riesgos asociados a un agente o a un procedimiento de laboratorio particular, quizás sea necesario aplicar medidas adicionales. El director del laboratorio es responsable de seleccionar prácticas de seguridad adicionales, que deben guardar relación con los riesgos relacionados con el agente o procedimiento. Prácticas operativas seguras y hábitos personales ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ El acceso al laboratorio debe ser limitado o restringido. El laboratorio debe ser diseñado para que su limpieza sea sencilla. Las superficies de las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y ser resistentes al calor moderado y a solventes orgánicos, ácidos, álcalis y productos químicos utilizados para descontaminar la superficie de trabajo y los equipos. Los muebles de laboratorio deben tener la capacidad de soportar cargas y usos previstos. Los espacios entre las mesas de trabajo, gabinetes y equipos deben ser accesibles para su limpieza. Cada laboratorio debe contener una pileta para el lavado de manos. La iluminación debe ser adecuada para todas las actividades, evitando los reflejos y el brillo que puedan molestar la visión. Si el laboratorio tiene ventanas que se abren hacia el exterior, deben estar provistas de mosquiteros. Se debe usar ambos, delantales, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados durante la permanencia en el mismo. Se debe retirar y dejar esta ropa de protección en el laboratorio antes de dirigirse a otras áreas (por ejemplo, cafetería, biblioteca, oficinas administrativas), se debe usar además, calzado cerrado y cabello recogido. Página 5 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Se debe usar guantes cuando es probable que las manos entren en contacto con materiales infecciosos, superficies o equipos contaminados. Puede ser apropiado el uso de dos pares de guantes. Se deben descartar los guantes cuando están contaminados, y se retiran cuando se completa el trabajo con los materiales infecciosos o, cuando está comprometida la integridad del guante. Los guantes descartables no se lavan, no se vuelven a usar, ni se utilizan para tocar superficies “limpias” (teclados, teléfonos, picaportes, entre otros), y no se deben usar fuera del laboratorio. No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar alimentos para uso humano en áreas de trabajo. Se debe utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de microorganismos u otros materiales peligrosos. Las personas que usan lentes de contacto en laboratorios deben también utilizar antiparras o un protector facial. Las personas deben lavarse las manos luego de manipular materiales viables, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio. (Ver Anexo I). Los alimentos se almacenan fuera del área de trabajo en gabinetes o refrigeradores designados y utilizados con este único fin. Está prohibido pipetear con la boca; se debe utilizar dispositivos de pipeteo mecánicos. Se debe aplicar políticas para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes. Todos los procedimientos se llevan a cabo con precaución a fin de minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles. Las superficies de trabajo se descontaminan como mínimo una vez por día, luego de finalizar las tareas y ante todo derrame de material viable. Todos los cultivos, stocks y otros desechos reglamentados se descontaminan antes de ser desechados mediante un método de descontaminación aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato son colocados en un recipiente duradero, estanco y cerrado para su transporte desde el laboratorio. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de conformidad con las normas locales, estatales y federales aplicables antes de retirarlos del establecimiento de acuerdo a las indicaciones de la Ley 24.051 de Residuos Peligrosos. Hojas de seguridad: (en inglés, Material Safety Data Sheet o MSDS) es un documento que indica las particularidades y propiedades de una determinada sustancia para su uso más adecuado. El principal objetivo de esta hoja es proteger la integridad física del operador durante la manipulación de la sustancia. Esta hoja o ficha contiene las instrucciones detalladas para su manejo y persigue reducir los riesgos laborales y medioambientales. El laboratorio debe tener las hojas de cada sustancia química que utiliza en el Laboratorio impresas y capacitar al personal sobre las mismas. Limpieza y desinfección del Laboratorio Todo Laboratorio debe tener un programa con métodos de limpieza y desinfección bien definidos a fin de disminuir los riesgos de contaminación con materiales peligrosos acorde a las características del laboratorio y volumen de trabajo. La limpieza de los laboratorios incluye a los equipos, mesas de trabajo, heladeras, freezer, aberturas, etc. Dentro de la limpieza de los laboratorios se debe incluir control de insectos y roedores. Eliminación de residuos peligrosos (patológicos/químicos) El Laboratorio debe elaborar un procedimiento de la manipulación, clasificación y descarte de los residuos peligrosos. Los residuos peligrosos pueden causar daño, directa o indirectamente, a seres vivos o contaminar el suelo, el agua, la atmósfera o el ambiente en general. Se consideran residuos patológicos al material biológico de diversos orígenes que puede no tener características infecciosas pero sí de toxicidad. Un residuo se considera tóxico cuando es capaz de, a determinadas dosis, provocar una acción química o químico-física que cause daño en la salud, luego de estar en contacto con la piel o las mucosas o de haber penetrado en el organismo por cualquier vía. Los residuos serán acumulados en recipientes colocados convenientemente y en cantidad suficiente en el lugar de generación de los mismos. Los mismos se podrán tratar mediante los siguientes métodos: Incineración, enterramiento por relleno de seguridad, esterilización por autoclave, ya sea por el mismo laboratorio o por empresas dedicadas a ese fin. Se ajustará a la normativa establecida por la jurisdicción donde se encuentra el laboratorio. Página 6 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO Se debe cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (Buenas Prácticas de Laboratorio), requisitos particulares de SENASA y la Norma ISO/IEC 17025 (última versión vigente) según la categoría del Laboratorio. Para que los resultados del diagnóstico sean uniformes, confiables y trazables, deben efectuarse siguiendo técnicas estandarizadas, con operadores capacitados en la realización e interpretación de los resultados, utilizando equipos y reactivos controlados. Los procedimientos de laboratorio están sujetos a múltiples causas de error que deben ser detectados para poder aplicar acciones correctivas y /o preventivas. Los procedimientos se pueden monitorear mediante controles internos, con la utilización diaria de sueros controles internos con títulos conocidos y, el control externo que se refiere al realizado por un laboratorio de referencia. Este último se puede hacer mediante auditorías que revisen los métodos analíticos, la organización del trabajo del laboratorio y los procedimientos de control de calidad internos implementados y la realización de inter laboratorios. El control permanente de la calidad de los resultados junto a las buenas prácticas de laboratorio que incluye la utilización de técnicas evaluadas, personal capacitado y operaciones estandarizadas, garantizan el resultado confiable del diagnóstico. Control de calidad de insumos Todos los insumos y reactivos que se utilizan en el laboratorio deben estar establecidos con fórmulas y procedimientos detallados en manuales disponibles en el área de trabajo. La composición, tipo de envase, identificación y lugar de almacenamiento debe ser la indicada en los manuales. No introducir cambios que no estén registrados y autorizados por el responsable del laboratorio. Todos los insumos y materiales de referencia deben cumplir con las especificaciones registradas. Los reactivos biológicos que se emplean en las técnicas de ensayo, deben utilizarse de acuerdo a las especificaciones del Manual de Procedimientos Operativos, respetando las indicaciones para la conservación, almacenamiento y titulación. Los reactivos para el diagnóstico de Brucelosis que se comercializan en la República Argentina, deben cumplir la normativa vigente de SENASA y aprobar el control de calidad de cada lote o serie indicado en la estampilla correspondiente. Se debe llevar un registro de cada lote de antígeno/kit que se utiliza con la fecha de uso. En los laboratorios se requiere usar agua con mínimo de impurezas. Los requisitos de calidad o pureza se encuentran establecidos en base a diferentes normas o criterios, dependiendo de las instituciones u organismos internacionales que establecen las referencias. Entre éstas se encuentran la American Society for Testing and Materials (ASTM), British Standards Institution (BSI) y la International Organization for Standardization (ISO). Actualmente están definidos los diferentes niveles de pureza del agua en función de los parámetros físicos químicos, tales como conductividad eléctrica, resistividad, contenido de carbono, oxígeno o sílice. Clasificación del agua de acuerdo a su característica fisicoquímica. Especificaciones según ISO 3696 Página 7 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �CLASIFICACION DE LOS TIPOS DE AGUA SEGÚN NC- ISO 3696: 2004 Grado 1- Exenta básicamente de contaminantes constituidos por iones disueltos o coloidales y materias orgánicas. Es apropiada para los requisitos de análisis más exigentes, incluyendo la cromatografía líquida de alta definición. Se puede preparar por un tratamiento adicional del agua de grado 2 (por ejemplo osmosis inversa o desionización seguida de filtrado a través de una membrana con tamaño de poro de 0,2 µm para separar las partículas, o por redestilación en un aparato de sílice fundido). Grado 2- Con muy pocos contaminantes inorgánicos, orgánicos o coloidales. Es apropiada para análisis delicados, incluyendo la espectrometría de absorción atómica (EAA) y la determinación de componentes en cantidades mínimas. Se puede preparar por destilación múltiple o por desionización u osmosis inversa seguida de destilación. Grado 3- Apropiada para la mayoría de los trabajos de química en laboratorios por vía húmeda y la preparación de soluciones de reactivos. Se puede preparar mediante una sola destilación, por desionización o por osmosis inversa. Salvo indicación en contrario, se puede utilizar para el trabajo normal de análisis. Equipos El laboratorio debe tener inventario del equipamiento y un programa de control y mantenimiento de los equipos que emplea en el laboratorio. Página 8 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �INTRODUCCIÓN: BRUCELOSIS (Capítulo 3.1.4.- Manual Organización Mundial de Sanidad Animal -OIE)- versión 2016. http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/3.01.04_BRUCELL.pdf Brucelosis es el nombre genérico que se aplica a las infecciones, humanas o animales, causadas por distintas especies del género Brucella, principalmente Brucella abortus, B. melitensis y B. suis. La infección del ganado ovino por B. ovis se describe por separado en el Capítulo 3.7.7 Epididimitis ovina (Brucella ovis) del Manual de la OIE. Agente: Brucella (B. abortus, B. melitensis, B. suis) El género Brucella forma parte de la familia Brucellaceae, que a su vez forma parte del orden Rhizobiales, en la clase Alphaproteobacteria. Presenta una estrecha relación genética con ciertos agentes patógenos de las plantas y simbiontes de los géneros Agrobacterium y Rhizobium, así como con agentes patógenos de animales (Bartonella) y bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum). La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están estrechamente relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes en cuanto al tipo de hospedador y a la epidemiología, así como evidencias moleculares de variaciones genómicas, el Comité Internacional de Sistemática de Procariotas, Subcomité de Taxonomía de Brucella, adoptó en 2005 una decisión firme sobre el retorno a las posiciones anteriores a 1986 en lo relativo a la taxonomía de Brucella; la consecuencia de ese posicionamiento es la re aprobación de las seis especies de Brucella con sus biovariedades reconocidas. Los nombres clásicos relacionadas con las seis especies de Brucella están publicados en las Listas Autorizadas de Nombres de Bacterias de 1980, y las cepas típicas designadas aparecen asociadas a esos nombres publicados y validados: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las tres primeras se subdividen en biovariedades por sus características de cultivo y serológicas. En la última década se han aislado cepas de Brucella de mamíferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de las especies ya reconocidas. Hay estudios en curso destinados a establecer su posición en la taxonomía de este género y se ha propuesto que podrían clasificarse en dos nuevas especies, B. ceti y B. pinnipedialis. Recientemente se ha aislado una nueva cepa, denominada Brucella microti, en el topillo campesino (Microtus arvalis) y en zorros y suelo de Europa Central (Scholz et al., 2008). También se han descrito por primera vez ciertas cepas aisladas de infecciones humanas de implantes mamarios y de pulmón, aunque todavía no está claro cuál es el reservorio natural de las mismas. Aunque solo se han descrito dos cepas de cada nuevo tipo, formalmente se han publicado como décima y onceava especies de Brucella, B. inopinata y B. papionis, respectivamente (Scholz et al., 2010; Whatmore et al., 2014). Por último, las cepas aisladas de roedores, zorros y ranas se han caracterizado como cepas atípicas de Brucella claramente diferenciables de las especies descritas actualmente, pero todavía no se han aprobado como nuevas especies de Brucella. Descripción de la enfermedad Infección por Brucella en ganado bovino La infección por Brucella en el ganado bovino suele estar causada por biovariedades (bv.) de Brucella abortus. En algunos países, sobre todo del sur de Europa, África y Asia occidental, en los que el ganado bovino se cría en estrecha relación con ganado ovino o caprino, la infección también puede deberse a B. melitensis (Verger, 1985). En ocasiones, B. suis puede causar una infección crónica de la glándula mamaria del ganado bovino, pero no se ha observado que cause aborto ni que se transmita a otros animales. La infección por Brucella en ganado bovino se transmite a nivel mundial, pero varios países del norte y centro de Europa, así como Canadá, Japón, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres tanto de B. abortus como de B. melitensis. Esta enfermedad suele ser asintomática en animales de corta edad y en hembras no gestantes. Tras la infección por B. abortus o B. melitensis, las hembras adultas gestantes presentan placentitis, que suele dar lugar a aborto entre el quinto y el noveno mes de gestación. Incluso en ausencia de aborto, en la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales producen una profusa excreción del microorganismo. La glándula mamaria y los ganglios linfáticos relacionados también pueden resultar infectados, y es posible que se excreten microorganismos con la leche. Las siguientes gestaciones suelen llegar a término, pero la infección uterina y mamaria reaparece, con cantidades bajas de microorganismos Página 9 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �tanto en los productos del parto como en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo se encuentra presente en la mayoría de ganglios linfáticos principales del organismo. Los bovinos machos adultos pueden presentar orquitis / epididimitis y la brucelosis puede ser una causa de infertilidad en ambos sexos. Los higromas, que suelen afectar a las articulaciones de las extremidades, son un signo frecuente en caso de brucelosis en algunos países tropicales y pueden ser el único indicador manifiesto de infección; el líquido de los higromas suele estar infectado por Brucella. Infección por Brucella en ovejas y cabras La infección por Brucella en ovejas y cabras (excepto la infección por B. ovis) está causada principalmente por las biovariedades de B. melitensis. En ovejas y cabras se han observado infecciones esporádicas causadas por B. abortus o B. suis, pero estos casos son extremadamente infrecuentes. La infección por Brucella en ovejas y cabras es endémica en la región del Mediterráneo, pero se dan casos en todo el mundo. América del Norte (excepto México) se considera libre del agente, del mismo modo que el norte y el centro de Europa, el sudeste asiático, Australia y Nueva Zelanda. Patológica y epidemiológicamente, la infección por B. melitensis en ovejas y cabras es muy similar a la infección por B. abortus en ganado bovino. En la mayoría de los casos, las vías principales de transmisión de Brucella son la placenta, los líquidos fetales y las secreciones vaginales expulsadas por las ovejas y cabras infectadas, ya sea al abortar o al parir a término. La expulsión de Brucella también es frecuente en las secreciones de la ubre y en el semen, y puede aislarse Brucella de distintos tejidos, como los ganglios linfáticos de la cabeza, el bazo y los órganos asociados a la reproducción (útero, epidídimo y testículos), así como de lesiones artríticas (Alton et al., 1988). Infección por Brucella en cerdos La infección por Brucella en cerdos está causada principalmente por las biovariedades 1, 2 o 3 de B. suis. En cerdos también se han observado infecciones esporádicas por B. abortus o B. melitensis, pero estos casos son muy infrecuentes. La enfermedad tiene lugar en muchos países en los que se crían cerdos. En general, la prevalencia es baja, pero en algunas regiones, como América del Sur o el sudeste asiático, la prevalencia puede ser mucho más alta. En algunos países, la brucelosis porcina puede ser un problema grave, aunque actualmente no reconocido. Se ha observado infección por la bv 1 de Brucella suis en jabalíes de algunos estados del sur de EE.UU., así como de Queensland (Australia) y de otros países de Oceanía. En estos países, se han documentado varias infecciones humanas en personas que practicaban la caza y manipulaban material obtenido de jabalíes. En general, la enfermedad se transmite por la ingesta de alimento contaminado por productos del parto o de un aborto, o bien por secreciones uterinas. Los cerdos se comen de inmediato los fetos abortados y las membranas fetales. La transmisión durante la copula también es frecuente, y la excreción de B suis en el semen tiene implicaciones para el personal que lleva a cabo la inseminación artificial. En los cerdos, como en los rumiantes, tras la bacteriemia inicial, B. suis coloniza las células del tracto reproductor de ambos sexos. En las hembras, resultan invadidas la placenta y los fetos, mientras que en los machos la invasión tiene lugar en uno o más de los siguientes tejidos: testículos, próstata, epidídimo, vesículas seminales o glándulas bulbouretrales. En los machos, las lesiones, que suelen ser unilaterales, empiezan con una hiperplasia que puede avanzar a absceso; la fase final se caracteriza por esclerosis y atrofia. Pueden aparecer artritis en varias articulaciones, y a veces tiene lugar una espondilitis. En las cerdas, el signo más frecuente de brucelosis es el aborto en cualquier momento de la gestación, aunque es más habitual entre los días 50 y 110. La secreción vaginal no suele ser evidente y, en los rebaños infectados de forma crónica, el signo clínico más relevante es la infertilidad, no el aborto. En los machos, la brucelosis tiene más probabilidades de ser persistente, y ocasiona lesiones en el tracto genital que a menudo dan lugar a una interferencia con la actividad sexual, que puede ser temporal o irreversible. El verraco puede excretar Brucella con el semen sin ninguna anomalía aparente en los órganos sexuales ni interferencia con la actividad sexual. En ambos sexos puede aparecer una tumefacción articular y de las vainas de los tendones, cojera y, en ocasiones, parálisis posterior. Un porcentaje considerable tanto de cerdos como de cerdas se recupera de la infección, a menudo en un plazo máximo de 6 meses, pero muchos quedan infectados de por vida (Olsen et al., 2012). La infección causada por la bv 2 de B. suis difiere de la causada por la bv 1 y la bv 3 en cuanto a la gama de hospedadores, la distribución y la patogenicidad. Históricamente, la distribución geográfica de la bv 2 de B. suis ha sido un amplio territorio situado entre Escandinavia y los Balcanes. La prevalencia en jabalíes parece ser Página 10 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �alta en toda Europa continental (EFSA, 2009). En los brotes de Europa, los jabalíes intervienen como fuente de transmisión de la bv 2 a cerdos criados en el exterior, y se consideran el principal reservorio salvaje de esta infección (EFSA, 2009). La bv 2 de Brucella suis causa lesiones miliares, sobre todo en tejidos reproductivos, que a menudo se vuelven purulentas. Hasta la fecha, la bv 2 se ha documentado en muy pocos casos como causa de brucelosis humana. No obstante, sí se han observado infecciones por la bv2 en cazadores con inmunocompromiso que hayan estado excesivamente expuestos debido a prácticas como el destripado y despellejado de jabalíes o liebres. Asimismo, en ganado bovino y ovino de Europa expuesto a jabalíes infectados, se han observado casos, aunque muy infrecuentes, de infección por la bv 2 de B. suis sin signos clínicos. Infección por Brucella en otras especies: domésticas, salvajes en cautiverio, o salvajes en libertad. Se ha observado infección por B. abortus y B. melitensis en el dromedario (Camelus dromedarius) y en el camello (C. bactrianus), así como en camélidos de América del Sur: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama pacos), el guanaco (Lama guanicoe) y la vicuña (Vicugne vicugne), y se ha relacionado con el contacto con rumiantes grandes y pequeños infectados por B. abortus y B. melitensis. Asimismo, se ha observado brucelosis en el búfalo doméstico (Bubalus bubalis), el bisonte americano y el europeo (Bison bison y B. bonasus, respectivamente), el yak (Bos grunniens), el elk/wapiti (Cervus elaphus), el búfalo africano (Syncerus caffer) y varias especies de antílopes de África. Los signos clínicos de brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en el ganado bovino, ovino y caprino. La infección por Brucella melitensis en rumiantes salvajes puede tener lugar cuando estas especies se encuentran en estrecho contacto con ovejas y cabras de zonas enzoóticas. Los signos de la brucelosis en estos animales son similares a los que se observan en bovinos, ovinos y caprinos, pero en varias especies de rumiantes salvajes (como el rebeco [Rupicapra rupicapra], el íbex alpino [Capra ibex] y la cabra ibérica [Capra pyrenaica] salvaje), se ha observado artritis purulenta o calcificada y orquitis, así como uveítis y problemas neurológicos. Estas especies se consideran portadores terminales, que no pueden transmitir la enfermedad, la cual suele desaparecer de forma natural en cuanto la infección por Brucella se ha erradicado del ganado doméstico, a no ser que tengan lugar efectos antropogénicos. Existen dos tipos distintos de situación epidemiológica respecto a la infección por B. suis en otras especies no porcinas. En el primer caso, la infección por B. suis tiene lugar en animales que no son el hospedador natural de la infección concreta mediante la ingesta de materiales contaminados o por co-habitación con hospedadores naturales infectados. Por ejemplo, zorros y lobos del ártico pueden contraer la bv 4 de B. suis del reno; los perros y los roedores, como ratas o ratones, pueden contraer otras biovariedades de B. suis por cohabitación con hospedadores infectados; y el ganado bovino y los caballos pueden resultar infectados por cohabitación o interacción con porcinos infectados. Las bacterias infectantes pertenecen siempre a las biovariedades definidas de especies hospedadoras naturales. En el segundo caso, los hospedadores naturales de B. suis o microrganismos similares a B. suis son especies salvajes. Un ejemplo es la denominada brucelosis murina de la Comunidad de Estados Independientes (CIS) y los países bálticos, donde pequeños roedores resultan infectados por la bv 5 de B. suis. Una situación similar se ha observado en Australia, donde, a partir de roedores, se han aislado cepas parecidas a B. suis pero con características distintas; finalmente se ha considerado que son distintas de B. suis en base al perfil genético. Además del jabalí, la liebre común europea (Lepus europaeus) también se considera reservorio de la bv 2 de B. suis y se ha observado que interviene como posible fuente de transmisión al ganado doméstico. En la liebre común europea, la enfermedad se caracteriza por la formación de nódulos, de tamaños variables comprendidos entre el de una semilla de mijo y el de una cereza o incluso mayor; a menudo se vuelven purulentos. Estos nódulos pueden tener lugar en casi cualquier lugar, a veces en el tejido subcutáneo o intramuscular, en el bazo, el hígado o los pulmones y en los órganos reproductivos de ambos sexos. La condición corporal de la liebre puede quedar sorprendentemente intacta. Otras especies también pueden resultar infectadas por cohabitación con cerdos, jabalíes o liebres infectados por la bv 2 de B. suis. El destripado o despellejado de jabalíes en explotaciones bovinas podría ser una vía de transmisión al ganado bovino. La bv 4 de Brucella suis causa una zoonosis grave en renos salvajes o domesticados (Rangifer tarandus y sus distintas subespecies) en toda la región del Ártico, incluidos Siberia, Canadá y Alaska. Rangifer tarandus es muy susceptible a la infección por B. suis, que causa fiebre, abatimiento y distintos signos locales, como aborto, Página 11 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �retención de placenta, metritis, a veces con secreciones sanguinolentas, mastitis, bursitis y orquitis. La transmisión al ser humano puede tener lugar por contacto directo o por el consumo de leche cruda u otros productos cocidos de manera insuficiente procedentes del reno, especialmente la médula ósea. Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad La infección por Brucella es fácilmente transmisible al ser humano, en el que causa un proceso febril (fiebre ondulante) que puede avanzar a una forma más crónica y también producir complicaciones graves que afecten a los sistemas músculo esquelético, cardiovascular y al sistema nervioso central. Deben aplicarse medidas de precaución para prevenir la infección humana. La infección se contrae básicamente por vía oral, respiratoria o conjuntival, pero la ingesta de productos lácteos crudos constituye el principal riesgo para el público general en los lugares en los que la enfermedad es endémica. Existe un riesgo ocupacional en veterinarios, trabajadores de mataderos y ganaderos que manipulen animales/canales infectados y fetos abortados o placentas. La brucelosis también es una de las infecciones de laboratorio más fáciles de contraer, y todas las manipulaciones de laboratorio relacionadas con cultivos vivos o material que pueda estar infectado o contaminado deben realizarse a un nivel de bioseguridad y contención adecuado, que se determinará a partir de un análisis del riesgo biológico Se han realizado recomendaciones específicas relativas a las precauciones en materia de bioseguridad que deben aplicarse con los materiales infectados por Brucella (se ofrece más información en Alton et al., 1988; Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Brucelosis, 1986; OMS, 1953; OMS, 2004). Todos los abortos en el ganado deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberían investigarse. El cuadro clínico no es patognomónico, aunque la historia del rebaño puede servir de ayuda. El diagnóstico inequívoco de infecciones por Brucella solo puede hacerse por aislamiento e identificación de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el análisis bacteriológico, el diagnóstico puede basarse en métodos serológicos. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Pruebas serológicas No existe una prueba única que permita la identificación de Brucella. Normalmente se necesita una combinación de los métodos serológicos y bacteriológicos. Ninguna prueba serológica aislada es adecuada en todas y cada una de las situaciones epidemiológicas, presentando limitaciones en el análisis de animales individuales. Se deben considerar todos los factores que influyen en la relevancia del método de prueba y de sus resultados para una aplicación o interpretación diagnóstica específica. Los métodos serológicos que se describen en esté manual son métodos estandarizados y validados, con características de realización adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilización de reactivos diferentes. Sin embargo, los métodos y reactivos descritos en esté manual suponen un estándar de comparación respecto a la realización esperada del diagnóstico. Debe resaltarse que la prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de fijación de complemento (FCT) es más específica que la SAT para el diagnóstico y además posee un sistema estandarizado de unidades. Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el análisis las pruebas con antígeno tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinación tamponada en placa (BPAT), así como el Enzimoinmunoensayo (ELISA) y el Ensayo de Polarización Fluorescente (FPA). Las reacciones positivas deben volverse a analizar utilizando una estrategia confirmatoria adecuada. En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), camellos (Camelus dromedarius, C.bactrianus) y camélidos sudamericanos, la infección por Brucella sigue un curso similar al del ganado bovino. Para estos animales pueden utilizarse los mismos procedimientos serológicos, pero cada uno debe ser validado en el animal estudiado. Página 12 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Tabla 1. Métodos analíticos disponibles para el diagnóstico de infección por Brucella abortus, melitensis o suis. (Manual OIE 2016) Propósito Método Demostrar ausencia de infección en la población Demostrar ausencia de infección en animales individualesa Contribuir a las políticas de erradicaciónb Confirmar casos clínicos sospechososc Determinar la prevalencia de la infección – vigilancia en el rebaño / manada Determinar el estado inmunitario en animales individuales o en poblaciones tras la vacunación Identificación del agente Métodos de tinción - - - + - n/a Cultivo - - - +++ - n/a - - - +/++ - n/a d PCR Detección de la respuesta inmune BBAT (RBT o BPAT) +++ ++ +++ + +++ n/a FPA ++ ++ + ++ ++ n/a CFT ++ ++ +++ ++ +++ n/a I-ELISA +++ ++ +++ ++ +++ n/a C-ELISA ++ + + + ++ n/a BST ++ - + +++ ++ n/a SAT ++ + + - + n/a Pruebas basadas en el NH y proteínas del citosole - - + ++ - n/a Prueba en leche de tanquef IELISA en leche o prueba de anillo en leche +++ - +++ + +++ n/a Clave: +++ = método recomendado; ++ = método adecuado; + = puede utilizarse en ciertas situaciones, pero el costo, la fiabilidad u otros factores limitan su aplicación; - = no adecuado para esta finalidad; n/a = no aplicable. PCR = reacción en cadena de la polimerasa; BBAT = pruebas con antígeno tamponado de Brucella (es decir, RBT [rosa de bengala] y BPAT [prueba de aglutinación en placa tamponada]); CFT = fijación de complemento; I- o C-ELISA =enzimoinmunoanálisis indirecto de competición; FPA = prueba de polarización de la fluorescencia; BST = prueba de la brucelina; SAT = prueba de aglutinación en suero; NH = hapteno nativo a Solo aplicable a rebaños / manadas, países o zonas libres de la infección por Brucella. bp Para aumentar la eficiencia de las políticas de erradicación en rebaños/manadas, se recomienda combinar pruebas para aumentar la sensibilidad en cuanto al diagnóstico, es decir, al menos dos pruebas serológicas, como BBAT o FPA y CFT o IELISA. La sensibilidad aumenta aún más si se aplica simultáneamente serológica y BST. c En zonas de prevalencia baja o casi libres, el valor predictivo de los resultados positivos en las pruebas serológicas puede ser muy bajo. En tales situaciones, para confirmar casos clínicos suele ser necesario identificar el agente causal. En rebaños/manadas infectados, un resultado positivo en cualquier prueba serológica puede considerarse una confirmación de un caso clínico. Todo animal que dé positivo en cualquier prueba debe considerarse infectado, incluso en ausencia de signos clínicos. En zonas de prevalencia baja o casi libres, los resultados positivos aislados pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) o BST. En países o zonas libres, los animales sospechosos son los que dan positivo tanto en una prueba serológica de cribado como en una confirmativa (pruebas en serie) y pueden confirmarse mediante cultivo (o PCR) y/o BST. d Es posible que se obtenga falsos positivos. e En las zonas en las que se practica la vacunación subcutánea con S19 o Rev. 1, esta prueba puede ayudar a diferenciar entre los anticuerpos generados a partir de la vacunación y los generadores a partir de la infección. f Solo ganado lechero. Página 13 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �PROCEDIMIENTOS DE TRABAJO PARA EL DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSIS EN EL LABORATORIO DE RED REGISTRO DE ENTRADA DE MUESTRAS Todo laboratorio debe contar con un instructivo o procedimiento de recepción, manejo y rechazo de muestras. Es responsabilidad del veterinario acreditado que envía las muestras asegurarse la correcta identificación, embalaje y documentación que acompaña a las mismas. Los laboratorios deben contar con un registro de entrada de muestras (en papel o software con backup), en el que figure como mínimo la siguiente información: ▪ Fecha de recepción de muestras. ▪ Cantidad de muestras. ▪ Especie. ▪ Fecha de extracción de muestras. ▪ Procedencia: establecimiento, número de RENSPA. ▪ Localidad: Departamento, Partido, Provincia. ▪ Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), SENASA. ▪ Motivo del envío: • DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario), • MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica Para Mantenimiento del Estatus), • SAN (Saneamiento de Rodeo Bajo Plan), CSM (Certificado de Seronegatividad para el Movimiento), • Control Interno (Según Requerimiento de Veterinario Acreditado), • Re-muestreo, otros. CARACTERISTICAS Y CONDICIONES DE LAS MUESTRAS Condiciones de "recepción" de las muestras: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Sangre entera o suero refrigerados. Suero congelado. Leche para PAL refrigerada (No congelada) Leche para IELISA refrigerada/congelada Tubos con identificación clara, de preferencia sobre cinta de papel o similar adherida al tubo; otra opción es la marcación firme e indeleble en el cuerpo del tubo. Planillas/protocolo completas de toma de muestras (Anexo II, Resolución SENASA 67/2019). Condiciones de "rechazo" o demora del procesamiento de las muestras: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Falta de planillas/protocolo o planillas incompletas de toma de muestras (Anexo II, Resolución SENASA 67/2019). Falta de la firma del veterinario acreditado en la planilla de extracción, responsable de la toma de muestra. Sangre entera congelada. Leche para PAL congelada, contaminada. Sangre entera o suero, contaminados. Sueros hemolizados. Tubos no identificados. Volumen insuficiente. Página 14 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Los Laboratorios reconocidos y autorizados deben ser exigentes con la calidad de las muestras a procesar, como así también con la planilla de toma de muestra firmada por el veterinario acreditado actuante que debe acompañar a las muestras. Informes de resultados Los informes que elabore el Laboratorio deben ser precisos para poder desarrollar adecuadamente las acciones de saneamiento (Ver modelo Anexo II del presente Manual). En el informe de resultados debe constar: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Logo del Laboratorio/Dirección/Tel/email/ Nº de L N° de Protocolo interno. Fecha de extracción de muestras. Fecha de recepción de muestras. Fecha de informe o emisión de resultados. Cantidad de muestras. Especie. Procedencia: establecimiento, número de RENSPA. Localidad: departamento, partido, provincia. Remitente: Veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA), SENASA. Motivo del envío: DOES (Determinación Obligatoria del Estatus Sanitario), MuVe (Muestreo de Vigilancia Epidemiológica Para Mantenimiento del Estatus), SAN (Saneamiento de Rodeo Bajo Plan), CSM (Certificado de Seronegatividad para el Movimiento), Control Interno (Según Requerimiento de Veterinario Acreditado), Remuestreo. Columnas con la información del tubo/caravanas/edad/fecha de vacunación/pruebas utilizadas/Resultados con los valores obtenidos (SAT-2ME, ELISA, FCT, FPA), valor de corte e interpretación cuando corresponda. Información de los antígenos/kits utilizados. Firma del Director Técnico del Laboratorio. Observaciones. Paginación x de y. Que conste en todas las páginas N° del protocolo y N° de RENSPA. Página 15 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Figura 1: Diagrama de diagnóstico serológico de Brucelosis en la República Argentina Animales a examinar: Hembras vacunadas mayores de 18 meses Animales no vacunados mayores de 6 meses * * Solo en bovinos Página 16 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �PRUEBAS SCREENING CON ANTÍGENO TAMPONADO EN PLACA (BPAT y RBT) PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA Brucella spp Son pruebas tamiz de aglutinación en placa. Se fundamentan en la inhibición de las aglutininas inespecíficas a bajo pH. Detectan anticuerpos IgG y algunos IgM específicos. DESARROLLO Materiales ▪ ▪ ▪ ▪ Micropipetas de10-100 µl. Gradillas. Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa, provista de una placa de vidrio marcada con cuadrados de aproximadamente 4 cm de lado, que se apoya cerca de la parte superior de la caja de manera que pueda quitarse y ponerse fácilmente. La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente), de la mezcla de suero y antígeno. El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. Debe colocarse dentro del aglutinoscopio una pequeña cámara húmeda para evitar la evaporación de las muestras. Mezcladores de acero o plástico. Equipos ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). Freezer con temperatura controlada (-20ºC ± 5°C). Vórtex. Centrífuga. Timer. Reactivos ▪ ▪ Antígeno BPAT con volumen celular aprox. de 11%. Antígeno Rosa de Bengala, volumen celular aprox. de 8%. Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ±3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad. ▪ ▪ ▪ Suero control interno positivo. Suero control interno negativo. Cada Laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. EJECUCIÓN DEL ENSAYO DE BPAT ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. Llevar las muestras de suero y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. Garantizar la homogeinización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (No usar vórtex). Colocar sobre el aglutinoscopio (con cámara húmeda), la placa de vidrio (limpia y seca), se recomienda pasar papel absorbente embebido en alcohol 70º de ambos lados de la misma. Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 80 µl de suero, previo mezclado con vortex. Utilizar un tip o punta de pipeta para cada suero. Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota del suero, con la precaución de no tocar el suero para no contaminar con el tip el frasco de antígeno. Página 17 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �▪ ▪ Mezclar bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno abarcando una superficie circular aproximada de 3 cm de diámetro. Se retira la placa de vidrio y se imprimen 3 movimientos en forma rotativa hasta homogeinizar la mezcla. Se coloca la placa sobre el aglutinoscopio con cámara húmeda y se tapa, permaneciendo la luz apagada. Se efectúa una nueva rotación, pasados 4 minutos. A los 8 minutos, rotando de nuevo la placa y con la luz encendida, se procede a la lectura. Figura 2: Aglutinoscopio EJECUCIÓN DEL ENSAYO DE ROSA DE BENGALA ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Colocar la placa de vidrio sobre el aglutinoscopio, como se indicó en la prueba de BPAT. Con micropipeta automática apoyada sobre la placa de vidrio, se depositan 30 µl de suero. Utilizar un tip para cada suero. Con micropipeta descargar 30 µl de antígeno próximo a la gota de suero. Se mezcla bien, con mezclador de acero o plástico, el suero con el antígeno, abarcando una superficie circular de aproximadamente 2 cm. de diámetro. Se retira la placa de vidrio y se imprimen movimientos en forma rotativa durante 4 minutos a razón de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con rotadores diseñados especialmente. Finalizados los 4 minutos y rotando la placa sobre la caja de lectura o aglutinoscopio con la luz encendida, se procede a la lectura sobre fondo blanco. En el caso de muestras de sueros caprinos y ovinos, la OIE recomienda utilizar la prueba de Rosa de Bengala modificado (RBTm), el cual consiste en mezclar 75 µl de suero y 25 µl de antígeno. Lectura a los 4 minutos, como se detalle en la explicación anterior. Página 18 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Lectura e interpretación de resultados de las pruebas de screening con antígeno tamponado en placa Las reacciones se clasifican en: POSITIVAS: Cuando se forman grumos, aún siendo finos (no confundir con aglutinaciones inespecíficas producidos por impurezas, hemólisis, etc.). Estas muestras deben someterse a las pruebas confirmatorias de SAT/2-ME, FPA, CELISA o FCT. NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antígeno es de turbidez homogénea y sin grumos. Estas muestras se informan como negativas y no se realizan las pruebas complementarias. Figura 3: Lectura BPAT/RBT BPAT RBT Informe de resultados Se aceptan las siguientes expresiones de resultados en las planillas Positivo Negativo + - POS NEG P N Criterios de aceptación del resultado En paralelo a las muestras problemas se dispensan los sueros controles internos negativo y positivo. Para aceptar los resultados, ambos controles deben arrojar la lectura correspondiente. Si los controles no arrojan la lectura esperada, se debe revisar las posibles causas, calidad de los sueros controles, antígeno, calibración de pipetas, etc. Página 19 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �PRUEBAS DE SERO-AGLUTINACIÓN LENTA EN TUBO (SAT/ 2-ME) Las pruebas de seroaglutinación detectan la presencia de los anticuerpos IgM e IgG. Los anticuerpos IgM aglutinan más intensamente que los IgG ya que, al ser las moléculas pentavalentes, poseen un mayor número de sitios de unión. El título de un suero se determina por la inversa de la dilución más alta que causa un determinado grado de aglutinación y se expresa en unidades que corresponden al recíproco de esa dilución. La prueba de 2-Mercaptoethanol es una prueba selectiva que detecta solamente la presencia de IgG, se basa en que los anticuerpos IgM, con configuración de pentámero, se degradan en cinco subunidades semejantes por la reducción de enlaces disulfuro, debido a la acción de ciertos compuestos que contienen el radical tiol, tales como el 2- mercaptoethanol. Estas subunidades conservan sus características de antigenicidad, pero pierden la actividad de anticuerpo plurivalente y se comportan como univalentes. Aún cuando las subunidades están integradas por dos cadenas pesadas y dos livianas, al combinarse con el antígeno no originan complejos suficientemente grandes como para aglutinar, probablemente como consecuencia de algún impedimento estérico. Las moléculas de IgG, en cambio, no sufren un efecto obvio que altere su actividad para dar reacciones objetivas como la aglutinación. La prueba se usa, por lo tanto, como evidencia presuntiva de la presencia de anticuerpos de la clase IgG. DESARROLLO Materiales ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Micropipetas de10-100 µl. Gradillas. ▪ Caja de lectura o aglutinoscopio (aproximadamente de 45cm de largo x 35 cm de ancho x 15 cm de profundidad) con tapa. La caja debe estar iluminada de modo que la luz incida oblicuamente y por debajo (cubiertas parcialmente). El interior de la caja debe pintarse de negro opaco. Tubos de serología: tipo Wasserman de 13 por 100 mm o tubos de Khan de vidrio. Probetas (100ml y 1000ml). Pipetas 1, 2, 5 y 10ml. Recipientes de vidrio de volúmenes variados. Propipetas. Dispensador automático o pipetas graduadas de 1-10ml. Reactivos 1. Antígeno SAT, volumen celular aprox.4.5%. Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ±3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad 2. Suero control interno positivo. 3. Suero control interno negativo. Cada Laboratorio debe preparar sus sueros controles internos de trabajo positivo (determinar el título) y negativo, codificarlos, utilizarlos cada día de trabajo y registrarlos. Página 20 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Equipos: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Heladera con temperatura controlada (5 ± 3 ºC). Freezer con temperatura controlada (-20ºC ± 5°C). Estufa con temperatura controlada (37ºC ± 2). Balanza. Vórtex. Centrífuga. Timer. Termómetro calibrado. Drogas y Soluciones: (Tener copia impresa de la hoja de seguridad de cada droga) ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Cloruro de Sodio p.a. Fenol p.a. 2- Mercaptoethanol p.a. Solución salina al 0.85%. Solución salina fenolada al 0,5%. Ejecución del ensayo a) Consideraciones generales: ▪ ▪ Las muestras que resulten positivas a BPAT o RBT deben confirmarse por las técnicas de SAT y 2-Mercaptoethanol, CELISA, FPA o FCT. La existencia de hemólisis excluye el empleo del método de tubo y placa. La presencia de hemólisis en las muestras de suero interfiere en la prueba de aglutinación en tubo, no sólo porque la coloración puede enmascarar la reacción de aglutinación, sino porque se forma un precipitado como resultado de la acción del fenol que contiene la solución de antígeno sobre la hemoglobina libre. Es muy difícil distinguir esta falsa reacción, de la aglutinación específica de la unión antígeno-anticuerpo. b) Desarrollo: Ambas pruebas (SAT y 2-ME) se realizan simultáneamente procediendo de la siguiente manera: ▪ Descongelar y mezclar bien los sueros utilizando vórtex. ▪ Llevar las muestras de suero y de antígeno a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC al menos una hora antes de la ejecución del ensayo. ▪ Garantizar la homogeneización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos de 10 minutos (No usar vórtex). ▪ Por cada muestra de suero problema positivo a BPAT, colocar en una gradilla 1 hilera de 8 tubos de 13 x 100 mm o tubos de Khan. Identificar la gradilla con el número de protocolo. ▪ Identificar el primer tubo de cada hilera con el número correspondiente al suero problema. En los primeros 4 tubos se realiza la prueba de SAT; se deja un espacio libre y en los 4 tubos siguientes de la misma hilera, se realiza la prueba de 2-ME. ▪ Por cada muestra de suero debidamente identificada, se utilizan tubos en los cuales se dispensa con micropipeta 80 µl de suero en el fondo del primer tubo, 40 µl se distribuyen en el segundo tubo, 20 µl en el tercero y 10 µl en el cuarto. ▪ Repetir el procedimiento descripto para depositar las mismas cantidades de suero en los tubos de 2-ME. ▪ Incluir un suero control interno positivo (título conocido) y negativo y, un control de soluciones y antígeno sin suero. Página 21 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �▪ Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución de 2mercaptoethanol (0,1 M) en cada tubo del grupo de 2-ME y mezclar muy bien agitando la gradilla. ▪ Con un dispensador automático o con micropipeta de 1 ml, agregar 1 ml de solución salina fenolada al 0,5 % a cada uno de los tubos del grupo de SAT. ▪ Dejar las gradillas con las mezclas durante 45 a 60 minutos a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC y posteriormente, dispensar a cada tubo 1 ml de antígeno de SAT diluido al 2 % (0,09 %) en solución salina 0,85%. ▪ Mezclar bien agitando la gradilla y llevar a estufa. Incubación La incubación se realiza a 37 ± 2 ºC durante 40-48 hs. y tiene por objeto obtener en el tiempo más corto posible el máximo de aglutinación. Se recomienda tomar y registrar las temperaturas máximas y mínimas de la estufa durante el transcurso de las 40-48 hs. de la incubación, para verificar la estabilidad de la estufa. c) Lectura e interpretación de resultados Una vez finalizada la incubación de las muestras, se realiza la lectura de las pruebas contra el fondo negro opaco de la caja de lectura o aglutinoscopio, iluminada desde atrás con una fuerte luz que atraviese los tubos. La aglutinación del complejo antígeno-anticuerpo bajo la forma de grumos y su depósito en el fondo del tubo por gravedad, determina la clarificación de la columna de líquido en el tubo, manteniéndose los grumos firmes después de una leve agitación del tubo. La aglutinación es el resultado directo de la unión específica de los anticuerpos presentes en el suero, con las Brucellas inactivadas contenidas en el antígeno. Las determinaciones se deben basar tanto en la claridad/turbidez de las mezclas como en el grado de aglutinación y la firmeza de los grumos al agitar suavemente el tubo. El título se determina por la inversa de la dilución más alta donde se observa aglutinación en el tubo, en el que se presenta una disminución evidente de la turbidez, manteniéndose los grumos firmes a pesar de una agitación leve. Si esto ocurre, por ejemplo, en los 3 primeros tubos solamente, el título del suero (recíproco de la dilución) es de 100 UI/ml de aglutinación en SAT o en 2-ME. El grado de aglutinación en cada una de las distintas diluciones puede clasificarse como completo (+), incompleto (I) o negativo (-). Aglutinación completa es aquélla en que el líquido de la mezcla suero- antígeno aparece límpido, translúcido y la agitación suave no rompe los grumos. Aglutinación incompleta es la que muestra la mezcla suero-antígeno parcialmente turbia y una suave agitación no rompe los grumos. Negativa es aquélla en que la mezcla suero-antígeno no evidencia aglutinación, la columna líquida aparece turbia y una suave agitación no revela grumos. Fenómeno de zona En ciertas ocasiones, puede ocurrir que se encuentre aglutinación en las diluciones más altas, pero no en las diluciones más bajas. Esta inhibición de la aglutinación en las diluciones bajas es llamada “fenómeno de zona” y está asociado a un exceso en la concentración de anticuerpos en el suero en las diluciones más bajas, provocando una aglutinación no visible por estar fuera de la zona de equivalencia de la unión antígeno-anticuerpo. Página 22 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Figura 4: Esquema Prueba simultánea de SAT y 2-ME Página 23 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Informe de Resultados Ejemplo Negativo Neg I 25 25 1/25 I: Incompleto Tabla 2: Interpretación de los resultados para Hembras Bovinas mayores de 18 meses de edad vacunadas con vacuna Brucella abortus cepa 19 entre los 3 a 8 meses de edad BPAT SAT 2-ME INTERPRETACION - NH * NH NEGATIVO + ≤ 50 - NEGATIVO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - SOSPECHOSO + I 200 - SOSPECHOSO + 200 - POSITIVO + 25 a 50 I 25 NEGATIVO + ≤ 25 ≤ 25 NEGATIVO + ≥ I 50 ≥ I 50 POSITIVO * NH: No se hace Tabla 3: Interpretación de los resultados para animales no vacunados (Bovinos y otras especies) mayores de 6 meses de edad BPA SAT 2-ME INTERPRETACION - NH NH NEGATIVO + 25 - NEGATIVO + I 50 - SOSPECHOSO + 50 - SOSPECHOSO + I 100 - SOSPECHOSO + 100 - POSITIVO + 200 - POSITIVO + ≥ 25 ≥ 25 POSITIVO Página 24 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Preparación de Soluciones para las pruebas de SAT/2-ME SOLUCIÓN SALINA 0,14 M • • Cloruro de Sodio Agua destilada 8,5 g 1000 ml SOLUCIÓN SALINA FENOLADA Solución salina 0,14 M con la adición de 0,5 % de fenol. Conservar a temperatura ambiente por un plazo de 30 días. Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. SOLUCIÓN 2-MERCAPTOETHANOL 0,1 M • 2-Mercaptoethanol • Solución salina 0,14M. (No utilizar solución salina fenolada) 7,8ml 992,2ml El 2-Mercaptoethanol es sensible a la luz y al calor y se deteriora rápidamente por exposición al aire. Se debe conservar en frasco color ámbar herméticamente cerrado a temperatura ambiente (22ºC ± 4 ºC). Leer detenidamente la hoja de seguridad. Evitar la inhalación, manipularlo en lo posible con máscara de gases o en cabina de extracción. NUNCA pipetear con la boca. La solución de 2-Mercaptoethanol ya preparada se puede conservar por una semana a temperatura ambiente (22ºC ± 4 ºC). Se recomienda preparar el volumen necesario de trabajo diario o semanal. SOLUCIÓN DE ANTÍGENO SAT (WRIGHT) al 2% • • • Solución salina 0,14M (no utilizar solución salina fenolada) 98ml Antígeno SAT (Wright) (4,5%) 2ml • La solución de antígeno al 2% se puede conservar por una semana en heladera (5ºC ± 3ºC). Descartar toda aquella solución que presenten turbidez o signos de contaminación. Página 25 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE (PAL o MRT) solo para Bovinos La prueba se diseño para detectar la presencia de anticuerpos en leche de bovinos. Estos anticuerpos reaccionan con el antígeno coloreado con hematoxilina formando un complejo antígeno anticuerpo que queda adherido a la superficie de los glóbulos grasos y asciende con ellos a la superficie, formando una capa o anillo de crema de color púrpura azulada, de intensidad variable según el grado de la reacción. Paralelamente, desaparece parcial o totalmente la tinción de la columna de leche. Si la muestra no contiene anticuerpos específicos, el antígeno no se fijará a los glóbulos grasos y permanecerá uniformemente distribuido, coloreando la columna de leche, mientras que la capa de crema forma un anillo de color blanco natural. El porcentaje de grasa de la muestra influye en la prueba, ya que la formación del anillo de crema en la superficie dependerá del tenor graso. La prueba de anillo en leche se usa especialmente como diagnóstico presuntivo para detectar rebaños infectados. También se emplea en la vigilancia epidemiológica en áreas de control de la brucelosis. Los animales de rebaños positivos a la prueba de anillo en leche deben ser examinados por las pruebas serológicas para identificar los infectados. Materiales ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Tubos de serología: tipo Wassermann de 13 mm por 100 mm, o tubos de khan de vidrio claro y completamente limpio. Pipetas 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml. Micropipetas de 10 a 100 µl y 1 ml. Gradillas. Timer. Reactivos 1. Antígeno PAL con volumen celular aprox.4%. Conservar el Antígeno en la heladera a 5 ± 3 °C. No se debe congelar, lo cual lo inutiliza, ya que se modifica la sensibilidad 2. 3. 4. Muestras de leche refrigerada (No congelada) Solución de formalina 1%. Muestras de leche controles positivo y negativo. Equipos: ▪ ▪ ▪ Heladera con temperatura controlada (5ºC ± 3 ºC). Estufa con temperatura controlada (37 ºC ± 2ºC). Termómetro calibrado. Toma de la muestra La prueba se lleva a cabo con la muestra de leche de tanque. Si es necesario, las muestras se pueden pre tratar con un conservante (formalina al 0,1%) durante 2–3 días a 5°C ± 3°C antes de su utilización. En el campo, tan pronto se ha llenado el tarro y antes de que la crema suba, revolver bien el contenido y tomar unos 50 ml de leche. Si es necesario, agregar 1 ml de solución de formalina al 1% por cada 10 ml de leche. Las muestras, bien identificadas, se transportan refrigeradas hasta el laboratorio. Página 26 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Ejecución del ensayo Las muestras de leche se deben mantener en refrigeración a una temperatura de 5ºC ± 3 ºC hasta que hayan transcurrido no menos de 24 horas desde su recolección (preferiblemente, 48 a 72 horas). Las muestras de leche no deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitación violenta ni conservadas durante más de 72 horas. Llevar las muestras de leche y antígeno a temperatura ambiente (22 ± 4 ºC) como mínimo unos 45-60 minutos previos a la realización del ensayo. Mezclar cada muestra invirtiendo varias veces el recipiente (tubo o frasco). Garantizar la homogeinización del antígeno, agitando suavemente por inversión durante no menos 10 minutos (No usar vórtex). Colocar 1 ml de la muestra en un tubo de vidrio 13 x 100mm o tubo de khan. La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mínimo de 25 mm. Agregar 30 µl de antígeno a cada tubo. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces, sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antígeno sobre las paredes. Incubar en estufa a 37ºC ±2 ºC, durante una hora. Lectura - Anillo de crema, blanco; columna de leche, azul. + ++ +++ ++++ Anillo de crema y columna de crema, del mismo color, o casi igual. Anillo de crema de color más pronunciado que la columna de leche. Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche tiene aún un poco de color. Anillo de crema, azul oscuro; la columna de leche es blanca. Cualquier grado de + debe interpretarse como Positivo Observaciones El exceso o la escasez de crema dificultan la interpretación de la prueba. La agitación vigorosa dificulta la realización de la prueba. El calentamiento de la leche interfiere con los resultados; por lo tanto, la prueba no se puede efectuar con leches pasteurizadas. Cuando la prueba se efectúa el mismo día en que se ha recolectando la leche, se pueden obtener algunos resultados falsos positivos o dudosos. La leche de calostro puede dar resultados falsos positivos. La leche de vacas con mastitis también puede dar falsos positivos o impedir la interpretación de la prueba debido al descoloramiento del antígeno. La leche de vacas próximas a secarse puede dar resultados dudosos o falsos positivos. Hay vacas infectadas con Brucella que no eliminan anticuerpos por la leche. Estas vacas son positivas en las pruebas de sangre y negativas en la prueba del anillo. Página 27 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Modificación de la prueba para tanques muy grandes Para hacer más sensible la prueba, aumentar la cantidad de leche, manteniendo constante la cantidad del antígeno (30 µl). Cuando se ajusta la PAL para aplicarla a rebaños de gran tamaño (utilizándose 2 o 3 ml de leche), se añaden 0,1 ml de una mezcla de crema negativa no pasteurizada al tubo de ensayo y a continuación, 30 µl del antígeno de la prueba del anillo. Después de mezclar, la prueba se incuba y se lee de la misma forma que para la PAL no ajustada. La mezcla de crema negativa se recoge mediante la separación de la leche compuesta por varias muestras y sin pasteurizar correspondiente a un rebaño de 25 o más vacas que sean negativas a brucelosis. < 150 vacas 150 – 450 vacas 451- 700 vacas 1 ml de leche 2 ml de leche 3 ml de leche Figura 5: Prueba de vigilancia epidemiológica para muestras de pool de leche Página 28 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ENZIMOINMUNOENSAYO INDIRECTO (I ELISA) (Para suero o leche) Se realiza siguiendo el protocolo de los kits comerciales validados y aprobados para el diagnóstico oficial de la brucelosis en la República Argentina con el valor de corte establecido por SENASA. El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un método empleado habitualmente para la detección y/o cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se encuentran en concentraciones muy bajas. El método combina la especificidad de unión de los anticuerpos con la amplificación de "señal" que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. En la práctica clínica es la técnica inmunológica más empleada. Se utiliza para cuantificar, entre otras cosas, hormonas, marcadores tumorales, para determinar la presencia de antígenos microbianos y para la determinación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos totales o frente a algún antígeno en particular. ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: 1. Fijación insoluble del antígeno al soporte/placa, específico para los anticuerpos objeto de estudio (generalmente en los kits comerciales la placa ya está preparada con el antígeno pegado a la misma). 2. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados, solo si se indica en las instrucciones. 3. Adición de los sueros/leches controles y sueros/leche problemas, en la dilución indicada en el protocolo, de tal forma que si hay presencia de anticuerpos, estos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. 4. Incubación. 5. Lavado para eliminar los anticuerpos que no se hayan pegado al antígeno o uniones inespecíficas. Es importante que la placa no se seque, lo que podría incrementar la actividad inespecífica del ensayo. 6. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima (generalmente anti IgG de especie), los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. 7. Incubación. 8. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados (conjugado) que no hayan reaccionado. 9. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 10. Frenado. 11. Lectura colorimétrica de la placa. Página 29 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Figura 6: Esquema ELISA Indirecto Materiales y Equipamiento ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Lector de placas automático con filtros (405 nm, 414 nm, 450nm). Computadora. Agitador orbital de placas. Lavador manual o automático de placas. Heladera (5 ± 3 ºC) y freezer (-20 ± 5ºC). Estufa de incubación (37 ± 2 ºC). Vórtex. Sistema purificador de agua (mínima calidad de agua requerida: destilada o desionizada). Micropipetas monocanal de volumen variable (0,5 –10µl, 5 - 50 µl, 50 -200 µl, 200 - 1000 µl). Micropipetas multicanal de volumen variable (5 - 50 µl, 30 -300 µl). Propipetas. Dispensadores automáticos. Timer. Selladores de placas de acetato o parafilm. Cubetas plásticas para pipetas multicanales. Microtubos (para realizar las diluciones previas de los sueros), tubos o placas fondo en U. Crío tubos de polipropileno para el almacenamiento de los sueros. Gradillas. Material de vidrio (probetas, pipetas, erlenmeyers, etc. de distintos volúmenes). Toallas o papel absorbente. Página 30 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Reactivos Están incluidos en los kits comerciales autorizados por el SENASA, incluyen: • • • • • • • Buffer de lavado Buffer de dilución Conjugado Sustrato cromógeno Solución de frenado Sueros controles Placas o tiras de 8 pocillos con el Ag pegado A continuación se citan algunas precauciones a tener en cuenta para ejecutar la técnica de Elisa: � � � � � � � � � � � � Seguir expresamente las instrucciones del kit para la preparación de todos los reactivos Ambientar los reactivos del kit a temperatura ambiente por lo menos una hora antes de su utilización. No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes lotes o kits. Evitar cualquier contaminación de los reactivos. No utilizar los kits una vez superada la fecha de caducidad. Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra y reactivo. Utilizar agua desionizada o destilada para la preparación/dilución de los reactivos que se empleen en el ensayo. Corroborar que el lector de placas posee el filtro con el cual se debe leer la placa y seguir las instrucciones de uso del equipo. Se recomienda trabajar las muestras por duplicado, para verificar la repetibilidad del operador. Incluir sistemáticamente un control positivo y un control negativo siempre que se utilice el kit. El sustrato es extremadamente sensible a la luz y a las contaminaciones, por lo que, se recomienda retirar del frasco únicamente el volumen que se vaya a utilizar y nunca devolver el sustrato sobrante al frasco original. La solución de frenado es un ácido fuerte. En caso de contacto con la piel lavar inmediatamente con abundante agua. Figura 7: Placa de Elisa Página 31 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ELISA POR COMPETICIÓN / BLOQUEO La técnica consiste en la adsorción del antígeno lipopolisacárido liso (LPS-l) de Brucella sobre una matriz sólida (Microplaca de 96 pocillos). A continuación se añade la dilución de los sueros y el anticuerpo monoclonal, específico para un epitope de la cadena O del LPS-l. Se mezclan los dos junto con el antígeno adherido y se dejan incubar. Después de la incubación, se lava la microplaca y a continuación se añade el conjugado de anticuerpo anti-monocolonal conjugado con enzima. Es importante mencionar que el anticuerpo del conjugado ha sido previamente adsorbido con suero normal (no infectado) de bovino, equino y humano para reducir las reacciones inespecíficas entre especies. La etapa final de la prueba es la adición de la solución substrato / cromógeno. Después de un periodo de tiempo fijo, se frena la reacción y se mide fotométricamente. Entre cada uno de los pasos del ensayo la placa debe ser lavada debidamente. En la ausencia de anticuerpos anti Brucella en los sueros problemas (sueros negativos), el anticuerpo monoclonal se liga con el epítope de la cadena O del LPS-l, lo cual es indicado en la prueba por el desarrollo de color. En el caso que el suero problema contenga anticuerpos antiBrucella (suero positivo) estos compiten con el anticuerpo monoclonal por sitios del epítope e inhiben el enlace del anticuerpo monoclonal con la porción de cadena O del LPS-l, manifestándose por la ausencia de color en el ensayo. Los sueros con anticuerpos post vacunales por B. abortus cepa 19, compiten en menor grado con el anticuerpo monoclonal porque su afinidad, especificidad y concentración es baja, resultando usualmente en una reacción negativa (excepto los animales vacunados en los tres meses anteriores al sangrado). Diversos CELISA / bloqueo comerciales se encuentran disponibles en el mercado. En el caso del Elisa de bloqueo, sobre las placas con el LPS de Brucella abortus pegado, se depositan las muestras de suero, las cuales en el caso de contener anticuerpos específicos se unirán al antígeno. Tras eliminar el material no unido mediante lavados, se añade el anticuerpo monoclonal específico del LPS (epítope C) conjugado con una enzima. En el caso de que las muestras contengan anticuerpos frente a LPS, estos no permitirán la unión del conjugado, mientras que, si las muestras no contienen este tipo de anticuerpos, el conjugado se unirá libremente al antígeno de la placa. Tras sucesivos lavados para eliminar el material no unido, podremos revelar las reacciones acontecidas en la placa mediante la adición del sustrato adecuado el cual, desarrollará una reacción colorimétrica en presencia de la enzima (es decir en presencia del monoclonal conjugado con enzima). De este modo la aparición de una reacción coloreada, indicará que la muestra evaluada no contiene anticuerpos específicos del LPS de Brucella spp. y, la ausencia de color indicará que la muestra es positiva y contiene dichos anticuerpos. Materiales y equipamiento, reactivos, cuidados y precauciones, manejo y conservación de las muestras: Idem Elisa Indirecto. Figura 8: CELISA Página 32 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Tabla 4: Guía de problemas y soluciones en la técnica de ELISA Señal Posible causa Solución Color irregular 1.Error de pipeteo 2.Falta de mezcla de reactivos 3.Falta de lavados Práctica Mejorar técnica Precaución No hay color 1. Se omitió el substrato 2. Errónea concent. Substrato 3. Substrato con pH erróneo 4. Conjugado muy diluido 5. Se omitió el conjugado Revisar Revisar Controlar pH Revisar Revisar Color parejo en toda la placa 1. Conjugado muy concentrado 2. Falla en el lavado 3 Substrato contaminado Controlar Mejorar técnica Revisar 1. Reacción inespecífica 2. Material de vidrio sucio 3. Agua de mala calidad 4. Poco detergente (Tween 20) 5. Tampones contaminados Cambiar solución de lavado Mejorar lavado Controlar calidad Revisar Preparar soluciones nuevas 1. Substrato muy concentrado 2. Conjugado muy concentrado 3. Solución substrato con pH erróneo 4. Concent. Cromógeno errónea Revisar Controlar dilución Controlar Revisar 1. Substrato muy diluido 2. Conjugado muy diluido 3.Solución substrato con pH erróneo 4.Concentración Cromógeno errónea 5.Concent de Tween errónea Revisar Revisar dilución Revisar Revisar Revisar 1. Incubación despareja 2. Resecación por aire 3. Tampón de lavado residual Utilizar estufa Mantener la placa cubierta Eliminarlo Elevado color de fondo “background” Desarrollo de color muy rápido Desarrollo de color muy lento Efecto borde Página 33 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Figura 9: Modelo de protocolo de Trabajo ELISA Protocolo ELISA Brucelosis DIRECCIÓN DE LABORATORIOS Y CONTROL TÉCNICO Fecha: Temperatura ambiente: Analista: Marca del Kit: Tipo de Elisa: Competencia Matriz: Indirecto Suero Bloqueo Leche Otros Otros Número de Lote: Vencimiento: Fecha apertura kit: Nº Placa: Muestras: Protocolo N°…… 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Firma operador Página 34 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ENSAYO DE POLARIZACION FLUORESCENTE PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA Brucella EN SUERO El ensayo de Polarización Fluorescente (FPA) para la detección de anticuerpos contra Brucella tiene la capacidad de ser una prueba multi-especies, permitiendo el diagnóstico presuntivo en bovinos, porcinos, caprinos, ovinos, ciervos y bisontes. Este ensayo, validado para bovinos, tiene la capacidad de distinguir animales infectados con Brucella de los animales vacunados con B. abortus cepa 19 a partir de los 3 meses post vacunación aproximadamente, y de los animales con reacción cruzada con bacterias gram negativas en más del 90% de los casos. A diferencia de los enzimoinimunoensayos, el FPA es un ensayo homogéneo que no requiere la necesidad de varias etapas de lavado. Los reactivos son agregados secuencialmente en solución y el tiempo total de la prueba no excede los 5 minutos para cada muestra. En resumen, la prueba involucra la adición de una determinada cantidad de suero a una solución tampón de dilución en un tubo de vidrio. A continuación la muestra es equilibrada por aproximadamente cinco minutos, posteriormente se realiza una primera lectura en el analizador fluorescente para obtener una lectura blanco de referencia (auto fluorescente). A continuación el antígeno conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) es agregado a la solución y luego, la muestra es equilibrada nuevamente por un mínimo de dos minutos para permitir que el antígeno y el anticuerpo interactúen, a continuación la muestra es leída nuevamente en el polarizador. Si anticuerpos específicos contra Brucella están presente (suero positivo), el resultado será un valor alto de unidades de mili polarización (mP). En ausencia de anticuerpos anti Brucella (suero negativo), el resultado es un valor bajo en mP. El valor de corte para distintas especies animales para la República Argentina se ha determinado en: Bovinos: ▪ Animales negativos < 94 mP. ▪ Animales sospechosos: Los valores entre 94mP y 104 mP. ▪ Animales positivos: valores igual o mayor a 105 mP. Caprinos y Porcinos: ▪ Animales negativos < 85 mP. ▪ Animales positivos: valores igual o mayor a 85 mP. Ovinos (para el diagnóstico de B. melitensis, no para B. ovis): ▪ Animales negativos < 78 mP. ▪ Animales positivos: valores igual o mayor a 78 mP. Materiales y equipamiento: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Analizador de Polarización Fluorescente. Vórtex. Micropipetas monocanal de volumen variable (0,1– 10µl, 20 –200µl, 200–1000µl). Heladera (5 ± 3 ºC) y freezer (-20 ± 5 ºC). Tubos de vidrio: Tubos de borisilicato de 10 x 75 mm. Material de vidrio. Termómetro de temperatura ambiental. Computadora e impresora. Reactivos Están incluidos en los kits comerciales AUTORIZADOS por el SENASA, incluyen: • • • Buffer de dilución Sueros controles positivo y negativo Antígeno marcado con isotiocionato de fluoresceina Página 35 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �PREPARACION DE LA PRUEBA DE FPA Preparación de los Reactivos Se deben seguir las instrucciones del prospecto que acompaña al kit comercial. Preparación del equipamiento/instrumentos El usuario debe leer el manual de instrucciones y familiarizarse con los controles de los instrumentos, calibración y la solución de los problemas de todos los equipos previos a la ejecución del ensayo. Ejecución de la prueba En el día de la prueba preparar y analizar los sueros controles, siguiendo con lo especificado en los puntos indicados a continuación. Si el valor de mP de los sueros controles no se ajusta dentro de los límites especificados, el ensayo debe ser rechazado. Dejar a temperatura ambiente los reactivos, sueros controles y problemas por lo menos dos (2) hs. antes de su uso. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo Encender el equipo y seguir las instrucciones de uso. ▪ ▪ ▪ ▪ Para bovinos dispensar 990 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). Dispensar 10 µl de suero bovino (Dilución 1/100) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex evitando la formación de espuma. Para porcinos y caprinos dispensar 960 µl de la solución tampón de dilución de sueros en los tubos de vidrio de borosilicato (10x 75mm). Dispensar 40 µl de suero porcino o caprino (dilución 1/25) a analizar dentro de los tubos y mezclar bien con vórtex. ▪ ▪ Para ovinos (B. melitensis) dispensar 975 µl de la solución tampón de dilución de sueros. Dispensar 25 µl de suero ovino (dilución 1/40). ▪ ▪ ▪ ▪ Esperar como mínimo cinco minutos a que la solución suero-Buffer se estabilice. Continuado el período de equilibración, realizar la lectura blanco de las muestras. Dispensar 10 µl de antígeno conjugado con FITC determinado en cada tubo y mezclar bien con vórtex. Es importante evitar la formación de espuma en la muestra En caso de que el suero se vea contaminado con partículas en suspensión, dejar el suero equilibrarse por lo menos 10 minutos para asegurarse que estas partículas hayan sedimentado o centrifugar el mismo. Las partículas inespecíficas puedan interferir con la lectura de la muestra dado que, la misma se basa en el Peso Molecular de las partículas en suspensión ▪ ▪ Dejar que la muestra y el antígeno se equilibren por lo menos por dos minutos. Leer las muestras exactamente en el mismo orden que fueron blanqueadas. Página 36 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Figura 10: Esquema Ensayo de Polarización Fluorescente 10 µl de Suero Bovino + 990 µl de Buffer ANTIGENO 10 µl Esperar 5 min. Lectura Blanco en Polarizador Incubación 2-5 min Lectura Final en Polarizador Interpretación de los resultados Control del ensayo Los sueros controles del ensayo deben estar dentro de los límites especificados por el fabricante del kit utilizado según el control de calidad desarrollados durante la estandarización, optimización e implementación del ensayo. Los resultados de los sueros controles y problemas son expresados en unidades de mili polarización (mP) de la actividad del suero contra el antígeno. Se debe controlar y registrar en la planilla de trabajo la temperatura ambiente al momento del ensayo. Aceptación de los controles Si los valores de mP de los sueros controles están fuera de los límites especificados, la prueba será rechazada y los controles y las muestras deben ser repetidas. Página 37 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �FIJACIÓN DE COMPLEMENTO La fijación del complemento (FCT) es la prueba de referencia internacional para el diagnóstico serológico de la brucelosis bovina, ovina y caprina. La prueba permite la detección y cuantificación relativa de los anticuerpos específicos antibrucélicos ¨capaces de fijar¨ el complemento (IgG1 y algunas IgM específica), cuya presencia en determinados niveles posee una gran correlación con el estado de ¨Animal infectado¨. La FCT es una prueba confirmatoria ampliamente usada y aceptada pese a la complejidad de su realización y a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y mantener los reactivos adecuadamente. La técnica se desarrolla en dos etapas: en la primera el antígeno y el suero problema (cuyo complemento se destruyó previamente por calentamiento a baño maría) se incuba en presencia de complemento de cobayo. Después de dejar reaccionar la mezcla de reactivos, se mide en la segunda etapa la cantidad de complemento libre (que indica la ausencia o presencia de anticuerpos antibrucelares en suero y su cantidad) mediante la incorporación de un ¨sistema indicador¨ o ¨sistema hemolítico¨ formado por eritrocitos de carneros recubiertos de anticuerpos de conejo (hemolisina) como complejo antígeno-anticuerpo alternativo. La presencia de anticuerpos en el suero problema induce la formación de inmuno complejos en la primera etapa de la reacción que determina la activación del sistema complemento y el agotamiento de sus factores. En la segunda etapa de la reacción no existe complemento libre que pueda activarse ante la presencia del ¨sistema hemolítico¨. El resultado es la ausencia de hemólisis (resultado positivo). Alternativamente, la lisis de los eritrocitos (hemólisis) es indicadora de la existencia de complemento libre en la segunda etapa de la reacción, que no se agotó en la primera por no haberse formado inmuno complejos ante la ausencia de anticuerpos antibrucelares (resultado negativo). Se han propuesto varios métodos para FCT que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja (GR) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensión al 2%, 2,5% o al 3%). Los GR están sensibilizados con un volumen igual de suero anti-GR de conejo diluido (hemolisina) hasta contener varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentración mínima necesaria para producir un 100% de lisis de los GR en presencia de soluciones titulada de complemento de cobayo. Variantes para la prueba de FCT: ▪ ▪ La macrotécnica, se realiza en tubos de Khan a un volumen final de 1 ml. La microtécnica, se realiza en placas de polipropileno de 96 pocillos, con un volumen final de 100 µl. Equipos - Pipetas monocanales con rangos de 2 µl a 20 µl, 20 µl a 200 µl y 500 µl a 5000 µl. - Pipetas multicanales de rango 20 µl a 200 µl. - Centrifuga. - Centrífuga de placas. - Estufa con temperatura controlada (37ºC ± 2ºC). - Heladera con temperatura controlada (5 ± 3°C). - Freezer con temperatura controlada (-20 ± 5°C). - Agitador de microplacas. - Vórtex. -Baño térmico. - Espectrofotómetro. Materiales: -Tubos de ensayo. - Material de vidrio de volúmenes varios. - Gradillas. - Film para cubrir placas. - Puntas de pipetas (Tips). Página 38 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �- Placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U. - Cubetas o reservorios de plástico para reactivos. Reactivos Solución buffer: Ver Anexo FCT I Solución GR 2%: ver Anexo FCT II Titulación Hemolisina: Ver Anexo FCT III Sistema hemolítico Anexo FCT IV Titulación Complemento: Ver Anexo FCT V Titulación Antígeno: Ver Anexo FCT VI Sueros controles Suero control positivo bovino (SENASA suero patrón Nacional BR 01/05). Suero control negativo bovino (SENASA suero patrón Nacional BR 03/05). Manejo y conservación de las muestras - Conservar los sueros en heladera (5 ± 3ºC) no más de dos días, para períodos mayores, conservarlos a –20 ± 5ºC. - Evitar repetidos ciclos de congelamiento/ descongelamiento. - No usar sueros contaminados, que presenten precipitados o intensa hemólisis. - Homogeneizar con el uso de vórtex los sueros antes de usarlos. Inactivación de los sueros Sueros patrones - Suero BR 01/05: Reconstituir el suero control positivo bovino liofilizado con 1 ml de agua destilada estéril. Realizar una dilución 1/12,5 con SB e inactivar durante 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2ºC, luego alicuotar y conservar a -20 ± 5ºC. - Suero BR 03/05: Reconstituir el suero control negativo bovino liofilizado con 1 ml de agua destilada estéril. Inactivar durante 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2ºC, luego alicuotar y conservar a –20 ± 5º C. Muestras de suero Las muestras de suero se inactivan 30 minutos en baño termostático a 58 ± 2ºC para eliminar el complemento natural contenido en las mismas. La temperatura del baño termostático se controla mediante la introducción de un termómetro certificado en el agua durante todo el tiempo de exposición de las muestras. - Los sueros ovinos se inactivan por 30 minutos en baño termostático entre 60ºC – 63°C (en caso de que los sueros sean anticomplementarios, se recomienda realizar otro ciclo de inactivación de 30 minutos). - Las muestras podrán ser sumergidas en el baño termostático en tubos de ensayo tapados herméticamente, contenidos en gradillas, debidamente identificados. Volumen de suero sugerido a inactivar: 200 µl. - La inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del análisis. En este caso, una vez retiradas del baño termostático se dejan a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para luego conservar en heladera. Si el análisis se realiza después de las 24 hs, las muestras ya inactivadas se conservan a (-20 ± 5ºC). Página 39 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Condiciones del ensayo El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37 ± 2ºC) y se utilizan los siguientes reactivos en volúmenes de 25 µl: a. b. c. d. Diluciones en base 2, a partir de 1/2 de los sueros problemas en SB. Solución de complemento de cobayo en SB que contenga 2 UC (100%). Solución de antígeno en SB a la dilución de trabajo. Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales, de una solución de suero hemolítico en SB que contenga 2UH (100%) y de una suspensión de glóbulo rojos de carnero en SB al 2%. Ejecución Dependiendo del número de muestras a realizar, se podrá incluir los controles en la misma placa o utilizar una placa para los sueros y otra para los controles. a) Dilución de las muestras de suero - El procedimiento de dilución se realiza de forma general en placa fondo en U, mediante la - utilización de volúmenes de 25 µl. La secuencia de operaciones se detalla en la tabla 1. La homogeneización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 1 1/2 Suero 25 µl SB 25 µl 1/4 25 µl de la dilución 1/2 25 µl 1/8 25 µl de la dilución 1/4 25 µl 1/16 25 µl de la dilución 1/8 25 µl 1/32 25 µl de la dilución 1/16 25 µl 1/64 25 µl de la dilución 1/32 25 µl 1/128 25 µl de la dilución 1/64 25 µl 1/256 25 µl de la dilución 1/128 25 µl b) Sueros controles - Control positivo: El procedimiento de dilución se realiza mediante la utilización de volúmenes de 25 µl, siguiendo la secuencia de operaciones que se detalla en la tabla 2. La homogeinización de los dos componentes de cada dilución se realiza mediante 5 aspirado/dispensado con la micropipeta. Tabla 2 Suero positivo 01/05 SB - 1/12,5 1/25 25 µl 25 µl - 25 µl 1/50 25 µl de la dilución 1/25 25 µl 1/100 25 µl de la dilución 1/50 25 µl 1/200 25 µl de la dilución 1/100 25 µl 1/400 25 µl de la dilución 1/200 25 µl 1/800 25 µl de la dilución 1/400 25 µl 1/1600 25 µl de la dilución 1/800 25 µl Control negativo: El suero control negativo se diluye siguiendo el mismo protocolo de los sueros problema (1/2, 1/4, 1/8 etc.). c) Controles del ensayo • • Control de la ausencia de poder anticomplementario del antígeno: Se dispensa por duplicado en la placa 25 µl/pocillo de SB, 25 µl/pocillo de C y 25 µl/pocillo de antígeno Control sistema hemolítico con complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 50 µl/pocillo de SB y 25 µl/pocillo de C. Página 40 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �• Control sistema hemolítico sin complemento: Se dispensa por duplicado en la placa 75 µl/pocillo de SB. d ) Disposición de los sueros en la placa Los controles y muestras diluidas deben quedar dispuestas en la placa fondo en U (25 µl/pocillo) según indica la tabla 3. Tabla 3 A B C D E F G H 1 Control positivo 1/12,5 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 2 3 Control muestra negativo 1/2 1/2 1/4 1/4 1/8 1/8 1/16 1/16 1/32 1/32 1/64 1/64 1/128 1/128 1/256 1/256 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 c) Preparación y dispensado de las soluciones de antígeno y complemento - Preparar la solución de C según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todas las muestras. - Preparar la solución de antígeno según la dilución de trabajo establecida como óptima y dispensar 25 µl/pocillo de dicha solución en todos los pocillos salvo en la dilución 1/2 (muestras y control negativo) y 1/12,5 (control positivo) Fila A, las cuales actuarán como controles de poder anticomplementario (PAC) de cada suero. d) Primera incubación en caliente - Tapar y agitar la placa en agitador de placas durante 2-4 minutos. - Incubar a 37 ± 2ºC durante 30 minutos. e) Dispensado del sistema hemolítico - Quince (15) minutos antes de finalizar la primera incubación, preparar e incubar a 37 ± 2ºC durante 15 minutos el sistema hemolítico según el Anexo FCT IV. - Finalizada la primera incubación, dispensar 25 µl/ pocillo del sistema hemolítico en todos los pocillos de las placas incluida la placa de los controles. f) - Segunda incubación en caliente Tapar y agitar las placas en agitador de placas durante 2-4 minutos. Incubar a 37 ± 2ºC durante 30 minutos. g) Centrifugación de la placa - Finalizada la incubación, centrifugar la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos o bien dejarla en reposo en heladera durante una hora antes de su lectura. Página 41 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Expresión de resultados El grado de fijación del complemento se manifiesta por la presencia (negativos) o ausencia (positivos) de hemólisis del sistema hemolítico. La reacción positiva se cuantificará mediante la determinacion del título y su grado de hemólisis. Reacción positiva - Sedimento en grado variable de los glóbulos rojos en el fondo del pocillo. - El sobrenadante estará afectado por un cierto tinte rojizo en función de la hemólisis que se haya producido. Este grado de hemólisis debe cuantificarse y cosignarse mediante un sistema de cruces. Figura 11: Placa fijación de complemento 0 % de hemólisis Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad, en el fondo un deposito claro de 25% de hemólisis +++ GR Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de 50% de hemólisis ++ GR Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad, en el fondo un deposito muy 75% de hemólisis + tenue de GR 100% de hemólisis Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR ++++ Página 42 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Determinación del título del suero Será la inversa de la dilución mas alta que siga dando algún grado de sedimentación de los GR. Este grado de fijación será informado mediante el sistema de cruces descripto y convertido a UIFCT. - En el caso de los bovinos vacunados con Brucella abortus S19, para el diagnóstico de las Brucellas lisas (B. abortus), se considera un resultado positivo cualquier valor ≥40 UIFCT (1/8 ++). - Para animales no vacunados (bovinos, caprinos, ovinos y porcinos) se considera positivo cualquier valor ≥20 UIFCT (1/4 ++). Expresión de los resultados en unidades internacionales de fijación del complemento - El sistema de expresión de los resultados en UIFCT, ajustados al suero patrón internacional OIEISS (en el caso de las Brucellas lisas), usado a continuación, se basa en el Procedimiento IZS TE B2. 1.6 SOP 004 del Centro Internacional de Referencia OIE para Brucelosis Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Teramo. Italia y el Manual de Procedimiento del Laboratorio Agroalimentario. Gobierno de Aragón. España. Tabla 4. Tabla 4. Interpretación en UIFCT Dilución 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 % de Fijación del Complemento + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++ 1000 UIFCT (1/200) 16,6 20 23,2 26,6 33,2 40 46,4 53,2 66,4 80 92,8 106,4 132, 8 160 185,6 212,8 265,6 320 371,2 425,6 531,2 640 742,4 851,2 1062,4 1280 1484,8 1702,4 Página 43 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Controles del ensayo La aprobación del ensayo debe realizarse si los controles han dado los resultados esperados: Controles Suero control positivo Suero control negativo Control de poder anticomplementario de los sueros Control de ausencia de poder anticomplementario del antígeno Resultado Esperado 50 % de fijación (++) - en la dilución 1:200 que corresponde a 1000 UIFCT (Brucellas lisas) 100% de hemólisis en todos las diluciones, ausencia de fijación de complemento 100% de hemólisis ausencia de fijación del complemento en la dilución 1:2 (sin antígeno) 100 % hemólisis Control del sistema hemolítico sin C 0% de hemólisis Control del sistema hemolítico con C 100% de hemólisis Criterio de aceptación del análisis: El ensayo se debe considerar APROBADO / NO APROBADO a) APROBADO: • Los controles de antígeno, sistema hemolítico con y sin complemento dan los resultados pre-establecidos. • El control de suero positivo da el resultado pre-establecidos (1:200) con una variación máxima de (± 2 ++). • El control negativo da un resultado Negativo. b) NO APROBADO: si uno de los controles no da el resultado esperado, se repite el ensayo. La presencia de, al menos, un 25% de sedimento de eritrocitos (+) de la fila A (dilución ½) indica poder anticomplementario en la muestra. En este caso, se informa el resultado de PAC, lo que implica la solicitud de una nueva extracción de la toma de muestra. Página 44 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Para facilitar la lectura e interpretación de los resultados se puede preparar una escala visual del siguiente modo: En un tubo se coloca 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2% + 900 µl de SB 1X. En otro tubo colocar 100 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 2% + 700 µl de agua destilada, agitar para provocar la completa hemólisis de los GR (solución de hemoglobina), y agregarle 200 µl de SB 5X para mantener la presión osmótica. Estos dos tubos mantienen la misma relación de GR. intactos en el primer caso y de glóbulos lisados en el segundo, que el que el 0% de hemólisis y el 100% de hemólisis en la prueba. De esta manera mezclándolas en distintas proporciones podremos obtener la imagen que corresponde a los distintos grados de hemólisis, luego de centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm. PORCENTAJE DE HEMÓLISIS REACTIVOS 0% EN µl Solución 0 hemolisada Suspensión de 100 glóbulos rojos 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Página 45 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Anexo FCT I: Solución Buffer (SB) - Realizar una solución de stock de calcio/magnesio como indica la tabla 1, luego conservar en refrigeración durante 6 meses o eliminar si hay turbidez producto de contaminación. Solución de stock calcio 0,3M y magnesio 1 M Ca Cl2. 3,7g Mg Cl2. 9,5 g Agua destilada - 100 ml Añadir 1ml de solución stock a 1 litro de solución salina 0,85% (NaCl2 8,5 g/ agua destilada 1 litro). La solución de trabajo debe tener un pH de 7,3 – 7,4. Luego de su uso conservar en refrigeración por 7 días. Página 46 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Anexo FCT II: Preparación de la suspensión de GR 2 % a) Lavado de los GR Homogeinizar cuidadosamente el frasco que contiene los eritrocitos. En un tubo cónico re-suspender los eritrocitos en una proporción de 1 volumen de GR + 5 volúmenes de SB, luego homogeinizar cuidadosamente. Centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 5 minutos y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. Repetir la re-suspensión de los GR en SB, centrifugar de la misma manera anteriormente descripta y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. Realizar la última re-suspensión de los GR en SB y centrifugar aproximadamente a 1500 rpm durante 10 minutos. Luego de la última centrifugación descartar el sobrenadante el cual debe estar libre de hemólisis. b) El método para la estandarización de la suspensión de glóbulos rojos 2% se podrá realizar por medio de dos técnicas. • • Método espectrofotométrico. Método en cámara de Neubauer. Método espectrofotométrico: Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB (2%). Realizar un blanco de lectura en el espectrofotómetro dispensando 2,5 ml agua destilada en la celda o tubo del espectrofotómetro. Determinar la lisis 100% de los GR realizando una dilución 1/15 con agua destilada, agregando en un tubo que contiene 2,8 ml de agua destilada 0,2 ml de glóbulos rojos al 2%. Una vez lisados los eritrocitos, leer la densidad óptica (DO) a 545 nm. La DO esperada debe ser de 0.330 ± 0.05. El laboratorio debe determinar según el modelo de espectrofotómetro cual es la DO optima que indique la concentración de GR al 2 %. Método en cámara de Neubauer: - Tomar del tubo cónico 0,2 ml de GR ya lavados y diluirlo en 9,8 ml de SB (2%). Realizar una dilución 1/200 y hacer el recuento de glóbulos rojos en la cámara. La suspensión deberá tener 5,4(± 0,2) X 108 GR/ml. Página 47 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Anexo FCT III: Titulación Hemolisina Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina Se prepararán 15 diluciones de hemolisina (tabla 1). En cada tubo se dispensa los siguientes volúmenes de SB y de hemolisina. La solución se homogeniza mediante agitación en vórtex. Tabla 1: Preparación de las soluciones “madres” de hemolisina N° de tubo Dilución SB (ml) 1 1/50 4,9 2 1/100 2 3 1/150 7,45 4 1/200 1 5 1/250 12,5 Hemolisina 100 µl 2 ml T1 50 µl 1 ml T2 50 µl 6 1/500 1 1 ml T5 7 1/1000 6 2 ml T5 8 1/2000 1 1 ml T7 9 1/3000 2 1 ml T7 10 1/4000 3 1 ml T7 11 1/5000 4 1 ml T7 12 1/6000 5 1 ml T7 13 1/7000 3 0,5 ml T7 14 1/8000 3,5 0,5 ml T7 15 1/9000 4 0.5 ml T7 Preparación de las soluciones “hijas” de hemolisina - En la filas B, C, D, G y H de una placa fondo en U dispensar 25 µl/pocillo de SB excepto de las columnas 10, 11 y 12 de las filas A, B, C y D (tabla 2). - En la filas A (excepto las columnas 10, 11 y 12) y F de la placa dispensar 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de hemolisina preparadas en la batería de tubos de ensayo, según protocolo de la tabla 1. - Con una pipeta multicanal recoger 25 µl por pocillo de la fila A y pasar a la fila B. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se realiza mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensado de la pipeta. Recoger 25 µl/pocillo de la fila B y pasar a la fila C. Volver a homogenizar. Recoger 25 µl/pocillo de la fila C y pasar a la D. Homogeinizar y recoger 25 µl/pocillo y descartar. - De la misma forma, haga diluciones de la fila F sobre las filas G y H. - Las diluciones finales obtenidas se detallan en la tabla 3. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones ‘’madres’’ de hemolisina y SB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl A de T1 de T1 de T1 de T2 de T2 de T3 de T3 de T4 de T4 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl B de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB C 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl D de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB E 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl de T5 de T5 de T6 de T7 de T8 de T9 de T10 de T11 de T12 de T13 de T14 de T15 F 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl G de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl H de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB de SB Página 48 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Tabla 3. Diluciones finales de hemolisina 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/50 1/50 1/50 1/100 1/100 1/150 1/150 1/200 1/200 B 1/100 1/100 1/100 1/200 1/200 1/300 1/300 1/400 1/400 C 1/200 1/200 1/200 1/400 1/400 1/600 1/600 1/800 1/800 D 1/400 1/400 1/400 1/800 1/800 1/1200 1/1200 1/1600 1/1600 F 1/250 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/3000 1/4000 1/5000 1/6000 1/7000 1/8000 1/9000 G 1/500 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/6000 1/8000 1/10000 1/12000 1/14000 1/16000 1/18000 H 1/1000 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/12000 1/16000 1/20000 1/24000 1/28000 1/32000 1/36000 E Preparación y dispensado de la suspensión de glóbulos rojos - Se prepara una suspensión de GR al 2% según lo indicado anteriormente. En este ensayo se prepara una suspension de 5 ml. - Dispensar la suspensión (25 µl/pocillo) en los pocillos de la microplaca. - Cubrir y agitar la microplaca en un agitador de placas durante 30 minutos a bajas revoluciones. Esto proporciona la sensibilización de los GR (unión con los anticuerpos presentes en las diluciones de hemolisina). - Dispense 25 µl/pocillo de SB en las filas A, B, C, D, F, G y H. En los pocillos de la columna 1 se dispensar adicionalmente otros 25 µl (esta columna actúa como control del poder hemolítico de la hemolisina). Preparación y dispensado de una solución de complemento - El objeto es preparar una solución de complemento a una concentración tal que siempre haya reactivo disponible para detectar una posible unión de Ag (GR) – Ac (hemolisina diluida). - Para complementos (comerciales) que den un titulo (unidad de complemento) superior a 1/90, debe prepararse una solución de 1/30. Para complementos que den títulos inferiores, la solución a preparar será de 1/10 – 1/20 (tabla 4). Tabla 4: Dilución del complemento Solución de complemento 1/20 Solución de complemento 1/30 TV 5,7 ml 5,8 ml Complemento 0,3 ml 0,2 ml - Dispensar 25 µl/pocillo de la solución de complemento en las filas A, B, C, D, F, G y H, excepto en los pocillos de la columna 1. - Cubrir y agitar la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Incubación - Incubar a 37 ± 2° C, durante 30 minutos. Página 49 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Cálculos y expresión de resultados El resultado de la relación de cada pocillo se evalúa por el grado de hemólisis presente en el mismo y se consigna mediante un sistema de cruces. Tabla 5. Tabla 5: Expresión de resultados ++++ + Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR +++ ++ 0 % de hemólisis 25% de hemólisis 50% de hemólisis 75% de hemólisis 100% de hemólisis Los resultados de la lectura se emiten en la hoja de laboratorio correspondiente. Cálculos de los resultados - Se define la unidad de hemolisis (UH) como la dilución más alta que permita la lisis del 100% de los eritrocitos en el pocillo. - Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de hemolisis presentan un grado de hemolisis similar. - Se elige la UH de la dilución en la que se obtenga 100% de hemolisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (mayor concentración de hemolisina). - La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UH, es decir 2 UH 100%. - Ejemplo: Si la UH se ha establecido en 1/1000 - DT= 2 x 1/1000= 1/500 Los cálculos y las proporciones finales de reactivos se registran en hojas de trabajo. - Se podrá realizar una dilución 1/50 o 1/100 de la hemolisina en SB conservando a -20 ± 5ºC para luego diluirla al título de trabajo. Se registra el lote, fecha y cantidad de hemolisina diluida. Página 50 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Anexo FCT IV: Sistema hemolítico - - Para la preparación del sistema hemolítico, el volumen total del sistema depende del número de placas a utilizar (1 placa= 96 pocillos fondo en U). Ejemplo para dos placas: 2 placas x 2,4 ml = 4.8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en previsión de perdidas) Dispensar en un frasco 2,5 ml de GR 2% y luego 2,5 ml de hemolisina al título de uso agitando suavemente para homogenizar las dos suspensiones e incubar a 37° C ± 2° C, durante 15 minutos. Página 51 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Anexo FCT V: Titulación Complemento Se llama complemento al suero de cobayo completo, que contiene el sistema enzimático denominado ‘’sistema complemento’’, cuya función en la técnica de fijación del complemento es la de detectar uniones especificas antígeno-anticuerpo. En el caso que en dichas uniones una de las partes sean glóbulos rojos, es capaz de lisarla, como en el caso del sistema hemolítico que se utiliza en la reacción de fijación del complemento, donde los hematíes de carnero hacen el papel de antígeno y el suero de conejo (hemolisina) de anticuerpos. El complemento que sea objeto de titulación debe descongelarse dejándolo llevar a temperatura de laboratorio. Una vez reconstituido o descongelado se mantendrá en refrigeración y solo se sacara de la heladera en el momento de su utilización. Si se provee que se va a utilizar más de un vial se juntaran todos en uno y se titulará el conjunto. Preparación de las soluciones “madres” del complemento - Realizar 6 diluciones ‘’madres’’ del complemento, empleando para ello tubos de ensayo. Tabla 1 de este anexo. - En cada tubo se dispensan los siguientes volúmenes de SB y de complemento. La solución se homogeiniza perfectamente mediante un agitador. Tabla 1. Diluciones “madre” del complemento Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 SB µl 725 850 975 1100 1225 1350 C µl 25 25 25 25 25 25 Preparación de las soluciones “hijas” en placas de ensayo y dispensado del SB - En la filas B, C y D de una placa fondo en U dispense 25 µl/pocillo de SB (tabla 2). - En la filas A de la placa dispense 50 µl/pocillo de las diluciones “madres’’ de complemento por duplicado según protocolo descripto en tabla 1. - Con una pipeta multicanal recoja 25 µl/pocillo de la fila A y trasváselos a la fila B. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se propiciara mezclando mediante 5 golpes de aspirado y dispensación de la pipeta. Recoja 25 µl/pocillo de la fila B y páselo a la fila C. Vuela a homogenizar. Recoja 25 µl/pocillo de la fila C y páselo al D. Homogeinice y recoja 25 µl/pocillo y descártelos. - Las diluciones que han quedado preparadas en la placa se detallan en la tabla 3. - Dispense a continuación 50 µl/pocillo de SB en todas las filas de la placa. - Agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. Tabla 2. Planilla de localización de las diluciones “madres’’ de complemento y SB A B C D 1 50 µl de T1 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 2 50 µl de T2 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 3 50 µl de T4 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 4 50 µl de T2 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 5 50 µl de T5 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 6 50 µl de T6 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 7 50 µl de T1 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 8 50 µl de T2 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 9 50 µl de T4 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 10 50 µl de T2 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 11 50 µl de T5 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB 12 50 µl de T6 25 µl de SB 25 µl de SB 25 µl de SB E F G H Página 52 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Tabla 3. Diluciones finales del complemento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 1/30 1/35 1/40 1/45 1/50 1/55 B 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 C 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 1/120 1/140 1/160 1/180 1/200 1/220 D 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 1/240 1/280 1/320 1/360 1/400 1/440 E F G H - Cubra la placa para evitar evaporación excesiva e incube en estufa a 37 ±2 °C durante 15 minutos Dispensado del sistema hemolítico - El sistema hemolítico habrá sido preparado según procedimiento descripto anteriormente. - Finalizada la incubación de la placa, dispense 25 µl/pocillo del SH en todos los pocillos de la placa. - Cubra y agite la placa durante 2-4 minutos en agitador de placas. - Incube en estufa a 37 ±2 °C durante 30 minutos Centrifugación de la placa - Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y se consignará mediante un sistema de cruces: Tabla 4 ++++ + Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR +++ ++ 0 % de hemolisis 25% de hemolisis 50% de hemolisis 75% de hemolisis 100% de hemolisis Cálculos de los resultados - Se define la unidad de complemento (UC) o Unidad Hemolítica como la dilución más alta que permita la lisis del 100% de los eritrocitos en el pocillo. - Sobre la hoja del laboratorio se comprobará la respetabilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de complemento presentan un grado de hemolisis similar. - Se elige la UC la dilución más alta que de 100% de hemolisis. - La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UC. Ejemplo: supongamos que se necesite preparar una solución de complemento para utilizar en el análisis de 2 placas según el procedimiento descripto Ello supone un volumen total de solución de complemento de 2 placas x 2,4ml/placa = 4,8 ml = 5 ml (se prepara un volumen adicional en Página 53 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �previsión de perdidas) a. Supongamos que UC = 1/100 DT= 2 x UC= 2 x 1/100 = 1/50 Si en 50 ml de SB se dispensa 1 ml de C puro: En 5 ml de SB se dispensan x. x= 5/50= 0,1 ml b. Por tanto las proporciones será: 0,1 ml de complemento y 4,9 ml de SB. Control de 2 Unidades de complemento (2 UC) - Una vez obtenida la dilución de trabajo, se realizará diluciones del complemento que contengan 2 unidades, 1,5 unidades, 1 unidad. 0,75 unidades y 0,5 unidades. - Para ello trabajaremos según la siguiente secuencia. Tabla 5. Tabla 5: Diluciones del complemento Tubo 1 Tubo 2 (2 unidades) (1,5 unidades) C: 2 unidades (µl) 400 300 SB (µl) 0 100 - Tubo 3 (1 unidades) 200 200 Tubo 4 (0,75unidades) 150 250 Tubo 5 (0,5unidades) 100 300 Se dispensaran por duplicado 25 µl/pocillo de cada una de las diluciones en los correspondientes pocillos de una placa y luego se completan con 50 µl de SB. Tabla 6 Tabla 6. Unidades del complemento en la placa A B C D E F G H 1 2U 2U 2 1, 5U 1, 5U 3 1U 1U 4 0,75 U 0,75 U 5 0,5 U 0,5 U 6 7 8 9 10 11 - Cubra la placa para evitar evaporación excesiva, agite 2 – 4 minutos e incube en estufa a 37°C ± 2° C durante 15 minutos - Luego repita lo descripto agregando el SH Lectura del análisis: - Pocillo con 2 Unidades: 100% de hemolisis - Pocillo con 1,5 Unidades: 100% de hemolisis - Pocillo con 1 Unidades: 100% de hemolisis o traza de GR en suspensión - Pocillo con 0,75 Unidades: 0% a 75% de hemolisis - Pocillo con 0,5 Unidades: 0% a 50% de hemolisis CONTROL DE CALIDAD - El ensayo debe ser repetible: pocillos con diluciones iguales deben tener un grado de reacción similar. En caso contrario se repetira el análisis. - Debe observarse cada gama de reacciones posibles desde diluciones con el 100% (N) de hemólisis (las mas bajas), hasta diluciones con el 0 % (++++) de hemólisis (las mas alta). En caso contrario se repetira el análisis. - En el control de 2 Unidades de complemento deben dar los resultados preeestablecidos. El análisis debe informarse como APROBADO/NO APROBADO en el apartado de observaciones de la planilla de titulación del complemento. En caso de no aprobado, se repite el proceso. Página 54 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) 12 �Anexo FCT VI: Titulación Antígeno Se utiliza el antígeno de seroaglutinación en tubo (SAT) volumen celular aproximado de 4,5 % Se trata de determinar lo que se denomina UA (Unidad Antigénica) que corresponde para cada lote de antígeno y será la dilución óptima de uso para garantizar la unión con los anticuerpos presentes en los sueros problema, en la cantidad suficiente para fijar el complemento. El antígeno formará el complejo antígeno-anticuerpo con los anticuerpos presentes de los sueros problema y que serán capaces de fijar el complemento. Esta reacción requiere un título mínimo para que se lleve a cabo, es decir, se debe garantizar una concentración mínima de antígeno que reaccione con los anticuerpos y sea capaz de fijar el complemento. Preparación de diluciones “madre” de antígeno Se preparan tres diluciones previas en tubos, donde se dispensaran en un tubo 500 µl de SB y 10 µl de antígeno, en el segundo tubo 750 µl de SB y 10 µl de antígeno y en tercero 1250 µl de SB y 10 µl de antígeno lo que da una dilución de 1/50, 1/75 y 1/125 respectivamente. Preparación de las diluciones “hijas” de antígeno En una placa de fondo en U se dispensa 25 µl de SB en todos los pocillos salvo en la columna 1 y los pocillos A10, A11, A12. La fila C y F no se utilizaran hasta la columna 9 (Tabla 1). En la columna 1 se pondrá 50 µl de las soluciones madres del antígeno por duplicado y en los pocillos A10, A11, A12 de forma simple (tabla 1). Se diluye pasando 25 µl sucesivamente de estos pocillos a los siguientes consiguiendo diluciones al duplo del antígeno. Las diluciones se realizan de la columna 1 a la columna 9 y de los pocillos A10, A11, A12 hasta los pocillos H10, H11 y H12. Es decir se pasan 25 µl de la columna 1 a la 2, se homogeiniza y se pasa otros 25 µl a la columna 3 y así sucesivamente y se elimina los 25 µl que sobran en la columna 9 y lo mismo en vertical en las columna 10, 11 y 12. Tabla 1 Diluciones ‘’hijas’’ del antígeno 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/50 1/75 1/125 B 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/100 1/150 1/250 1/200 1/300 1/500 C D 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/400 1/600 1/1000 E 1/75 1/150 1/300 1/600 1/1200 1/2400 1/4800 1/9600 1/19200 1/800 1/1200 1/2000 1/1600 1/2400 1/4000 F G 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/3200 1/4800 1/8000 H 1/125 1/250 1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/6400 1/9600 1/16000 Dispensado de sueros controles positivo y negativo Seguidamente se dispensa 25 µl de suero control positivo en los pocillos de la fila A, B D E, G y H salvo en las columnas 10, 11, 12 donde se dispensan 25 µl de suero control negativo y servirá como control de hemolisis. El suero control positivo debe ir a una dilución igual al título conocido (1/200) en la reacción de fijación del complemento. Dispensado de una solución de complemento Posteriormente se dispensa 25 µl de complemento a todos los pocillos según el título obtenido previamente, Se agita la placa 2 - 4 minutos y se incuba durante 30 minutos a 37° C ± 2° C. Página 55 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Dispensado del sistema hemolítico Tras la incubación de la placa se procede a dispensar 25 µl de sistema hemolítico a todos los pocillos. Luego se agita la placa 2 - 4 minutos e incubará durante otros 30 minutos a 37 ° C ± 2° C. Centrifugación de la placa Finalizada la incubación, centrifugue la placa a una fuerza de 1000 RPM durante 3 minutos. Expresión de resultados El resultado de la reacción de cada pocillo se evaluará por el grado de hemolisis presente en el mismo y se consignara mediante un sistema de cruces. Tabla 2 ++++ + Sobrenadante translúcido, en el fondo botón de depósito de GR Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad, en el fondo un deposito claro de GR Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad, en el fondo un deposito tenue de GR Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad, en el fondo un deposito muy tenue de GR Negativo sobrenadante rojo cristalino, ausencia de depósito de GR +++ ++ 0 % de hemolisis 25% de hemolisis 50% de hemolisis 75% de hemolisis 100% de hemolisis Los resultados de la lectura se registran en la hoja de laboratorio correspondiente Cálculos de los resultados - Se define la unidad de antígeno (UA) como la dilución más alta que permita una fijación completa (0% de hemolisis) - Sobre la hoja del laboratorio se comprueba la repetibilidad del análisis, constatando que los pocillos que contengan la misma dilución de antígeno presentan un grado de hemolisis similar. - Se elige la UA a dilución en la que se obtenga el 0 % de hemolisis. Si existen dudas entre dos diluciones se elegirá la dilución más baja (de mayor concentración de antígeno). - La dilución de trabajo (DT) se establece multiplicando por 2 la UA. Ejemplo: supongamos que la UA se ha establecido 1/800: DT= 2 x UA= 2 x 1/800 = 1/400 Página 56 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �NORMATIVA VIGENTE Consultar en • • • http://www.senasa.gob.ar/normativas https://www.boletinoficial.gob.ar/ http://www.infoleg.gob.ar/ LEY 24.696: Declárase de interés nacional el control y erradicación de la enfermedad reconocida como Brucelosis (Brucella abortus) en las especies bovina, suina, caprina y otras en todo el Territorio Nacional. RESOLUCIÓN SENASA 67/2019: Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina en la REPÚBLICA ARGENTINA. Se aprueba el Plan Nacional de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina en la REPÚBLICA ARGENTINA, de aplicación obligatoria en todo el Territorio Nacional, excepto en la Provincia de TIERRA DEL FUEGO, ANTÁRTIDA E ISLAS DEL ATLÁNTICO SUR. RESOLUCIÓN SENASA 857-E/2017: Zona Libre de Brucelosis Ovina y Caprina a Brucella melitensis. RESOLUCIÓN SENASA 372-E/2017: Aprobación del Plan Nacional de Control de Brucelosis Caprina. RESOLUCIÓN SENASA 98/2016: Comercialización de antígenos/kits para diagnóstico de brucelosis. Los laboratorios elaboradores y/o importadores y/o sus distribuidores autorizados por el servicio nacional de sanidad y calidad agroalimentaria (Senasa), solo pueden efectuar ventas de antígenos/kits para diagnóstico de brucelosis a los laboratorios inscriptos en la red nacional de laboratorios del Senasa, que se encuentren debidamente habilitados para el rubro diagnóstico de brucelosis. RESOLUCIÓN SENASA 63/2013: Se aprueban los requisitos y procedimientos que deben cumplir los productores agropecuarios para que sus establecimientos obtengan la certificación oficial como libre de brucelosis porcina y para incorporar sus rodeos al Registro Nacional de Establecimientos Oficialmente Libres de Brucelosis Porcina. RESOLUCIÓN SENASA 246/2007: Requisitos de bioseguridad para los laboratorios que se dediquen a la elaboración de productos destinados al diagnóstico y a la prevención de la Brucelosis Animal y la Tuberculosis Animal. RESOLUCIÓN SENASA 438/2006: Adóptese el Sistema de Diagnóstico Serológico para el Programa de Control y Erradicación de la Brucelosis. Técnicas que lo conforman. RESOLUCIÓN 736/2006: Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos SANIDAD ANIMAL Y VEGETAL. Créase la Red Nacional de Laboratorios de Ensayo y Diagnóstico. Marco normativo para la inscripción en el Registro de la mencionada Red. Excepciones. RESOLUCIÓN SENASA 79/2003: Adoptar la Técnica de I-ELISA en Leche para el diagnóstico de Brucelosis Bovina en establecimientos lecheros RESOLUCIÓN SENASA 1484/1993: Normas para la Elaboración, fraccionamiento, distribución, expendedor para los reactivos destinados en el diagnóstico y prevención de la Brucelosis Animal. Página 57 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �INFORME DE LA SUBCOMISIÓN TÉCNICA DE LA COMISIÓN NACIONAL DE BRUCELOSIS para el cambio del título de corte de la prueba de 2-ME (2006) Integrantes: Dr. Eduardo Bagnat, SENASA; Dr. Eduardo Moras, Fac. Vet UBA; Dra. Marcela Martínez Vibot, Fac. Vet UBA; Dr. Luis Samartino, INTA; Dra. Susana T. de Echaide, INTA; Dra. Irene Walsh, AAVLD; Dr. Guillermo López, DIPRODESA; Dra. Cecilia Di Lorenzo, Coleg. Med. Vet, Bs. As; Dra. Ana M. Nicola, SENASA. CAMBIO DEL PUNTO DE CORTE DE LA PRUEBA 2- MERCAPTOETANOL Se decidió cambiar la interpretación oficial del resultado de la Prueba de aglutinación, del 2Mercaptoetanol para los bovinos. Será considerado Reactor Serológico Positivo a todo animal que en la Prueba de aglutinación del 2Mercaptoetanol, presente reacción de aglutinación en la dilución 1/50 (sea esta reacción completa o incompleta) o mayor siendo esta realizada conforme al Manual de Brucelosis de la DILACOTSENASA. Todo animal cuya reacción de aglutinación en la Prueba del 2-Mercaptoetanol se presente únicamente en la dilución 1/25, sea esta completa o incompleta, será considerado seroreactor Negativo. Datos analizados INTA Castelar Proporcionó a la subcomisión Técnica de Brucelosis el resultado del diagnóstico serológico sobre un total de 1672 sueros de diversos establecimientos que fueran remitidos a esa unidad de diagnóstico y a los cuales se le realizara las Pruebas de Fijación de Complemento, SAT y 2-ME. Siendo que se observaba, por parte de especialistas y profesionales de campo, reacciones que no superaban la dilución 1/25 en la Prueba del 2-Mercaptoetanol y muchas de las cuales no reaccionaban en la dilución 1/50 en la Prueba del SAT y que además ocurrían en animales de establecimientos cuya epidemiología no manifestaba indicios de presencia de la enfermedad, se consideró la necesidad de analizar el error de diagnóstico que se producía en este estrato reactor serológico tomando como referencia la Prueba de Fijación de Complemento (estándar deoro). Del total de 1672 sueros, 170 sueros (10%) reaccionaron sólo en la dilución 1/25 al 2-ME y fueron a su vez Negativos a la FC` y no superaron la dilución 1/50 al SAT. Por otra parte hubo 6 sueros (0,3%) con ese nivel de reacción al 2-ME y al SAT, que resultaron Positivos a la Fijación deComplemento. 170 sueros resultaron falsos positivos (FP), esto es reactores 1/25 al 2-ME y Negativos a la FC` y, 6 sueros resultaron Verdaderos Positivos (VP) (+ 1/25 al 2-ME y Positivos a la FC`). La relación FP/ VP fue de 35/1 EE INTA RAFAELA Sobre un total de 801 sueros 51 (6,3%) se encontraban en ese estrato reactor (FC` Negativo, SAT 1/50 o menos y 2-ME 1/25). Hubo 2 sueros (0,2%) FC` Positivo, SAT 1/50 o menos y 2- ME 1/25 51 sueros resultaron FP y 2 sueros resultaron VP La relación FP/VP fue 51/2= 25/1 Página 58 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Conclusión: La cantidad de Falsos Positivos que cuesta detectar (1) uno verdadero positivo, en el estrato de reactor estudiado, fue de 35 y 25 en cada estudio. Ello significa un costo muy elevado. Al cambiar el nivel de corte del 2-ME de la dilución 1/25 al de la dilución 1/50 (sea esta reacción completa o incompleta), el Verdadero Positivo pasará a ser un Falso Negativo. Por otro lado se observa que en el nuevo punto de corte, reactor en la dilución 1/50 (sea esta reacción completa o incompleta), hay predominio de los verdaderos positivos (FC` Positivos) respecto de los Falsos Positivos (FC` Negativos). Esta relación costo /beneficio justifica la modificación. Debe considerarse que esta modificación se refiere a la interpretación estándar oficial de la serología que se incorpora al Manual de Procedimientos de la Brucelosis de la DILACOT-SENASA. Ello debe distinguirse de la práctica particular de saneamiento donde el profesional sanitarista puede y debe interpretar los resultados serológicos con un CRITERIO EPIDEMIOLÓGICO adecuado al caso particular de aplicación. Asimismo debe tenerse presente para los procedimientos de certificación, que en aquellos casos en que el profesional encuentre discordancia de los resultados con la condición epidemiológica, podrá solicitar que sean consideradas sus discrepancias con la interpretación oficial para su caso, Res. SENASA 438/06. Ver tabla a continuación A partir de Diciembre 2006 TABLA DE DECISIÓN (Hembras vacunadas mayores de 18 meses) BPA WRIGHT 2-ME INTERPRETACIÓN - NSH NSH NEGATIVO + 50 UI - NEGATIVO + I 100UI - SOSPECHOSO + 100 UI - SOSPECHOSO + I 200 UI - SOSPECHOSO + 200UI - POSITIVO + I 50UI I 50 UI POSITIVO Referencias I=Incompleto NSH = No sehace UI = Unidades Internacionales =Positivo + =Negativo Página 59 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ANEXO I Lavado y desinfección de manos Una vez terminada la tarea, retirarse los guantes y siempre lavarse las manos después de cada actividad en el Laboratorio Página 60 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Página 61 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �ANEXO II Modelo de Planilla de emisión de resultados Página 62 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �Página 63 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 1) ALTON G.G., JONES L.M., ANGUS R.D. & VERGER J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis Laboratory. Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France. 2) ANGUS R.D. & BARTON C.E. (1984). The production and evaluation of a buffered plate antigen for use in a presumptive test for brucellosis. Dev. Biol. Stand., 56,349–356. 3) Centro Panamericano de Zoonosis – Nota Técnica Nº2. 4) CIOCCHINI A.E., REY SERANTES D. A., MELLI L.J., IWASHKIW J.A., ELENA S., FRANCO C., NICOLA A.M., FELDMAN M.F., COMERCI D.J., UGALDE J.E. A bacterial engineered glycoprotein as a novel antigenic target for diagnosis of bovine brucellosis. Vet Microbiol. 2014 Aug, 27; 172 (3-4):455-65. 5) CORTINA M.E., BALZANO R.E., REY SERANTES D.A., CAILLAVA A.J., ELENA S., FERREIRA A.C., NICOLA A.M., UGALDE J.E., COMERCI D.J., CIOCCHINI A.E (2016). A bacterial glycoengineered antigen for improved serodiagnosis of porcine brucellosis. Journal of Clinical Microbiology, 54(6), 1448-1455. 6) GALL D., NIELSEN K., FORBES L., COOK W., LECLAIR D., BALSEVICIUS S., KELLY L., SMITH P. & MALLORY M. (2001). Evaluation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for detection of brucellosis in cervids. J. Wildl. Dis., 37,110–118. 7) GALL D.,NIELSEN K.,FORBES L.,DAVIS D.,ELZER P.,OLSEN S.,BALSEVICIUS S.,KELLY L., SMITH P., TAN S. & JOLY D. (2000). Validation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological tests for detection of serum antibody to Brucella abortus in bison. J. Wildl. Dis., 36, 469–476. 8) MACMILLAN A.P., GREISER-WILKE I., MOENNIG V. & MATHIAS L.A. (1990). A competition enzyme immunoassay for brucellosis diagnosis. DtschTierarztl. Wochenschr., 97, 83–85. 9) Manual de procedimiento IZS TE B2.1.6 SOP012 – Instituto Zooprofilactico experimental del Abruzzo y del Molise “G. Caporale” Teramo, Italia. 10) Manual de Procedimientos Técnicas para el Diagnóstico de Brucelosis Humana 2008. Servicio de Brucelosis Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”, Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para América del Sur. 11) NIELSENK. (2002). Diagnosis of brucellosis by serology. Vet. Microbiol., 90,447–459. 12) NIELSEN K., GALL D., JOLLEY M., LEISHMAN G., BALSEVICIUS S., SMITH P., NICOLETTI P. & THOMAS F. (1996). A homogenous fluorescence polarization assay for detection of antibody to Brucella abortus. J. Immunol. Methods, 195,161–168. 13) NIELSEN K., KELLY L., GALL D., BALSEVICIUS S., BOSSE J., NICOLETTI P. & KELLY W. (1996). Comparison of enzymeimmunoassays for the diagnosis of bovine brucellosis. Prev. Vet. Med., 26, 17–32. 14) NIELSEN K., KELLY L., GALL D., NICOLETTI P. & KELLY W. (1995). Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis.Vet.Immunol.Immunopathol., 46,285–291. 15) Norma ISO/IEC 17025/2017. 16) Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). “Manual of standards for diagnostic test & vaccines”, Capítulo 3.1.4 : Infección por Brucella abortus, B. melitensis y B. suis.) Edición 2016. Página 64 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �17) Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). Código Terrestre. Capítulo 8.4: Infección por Brucella abortus, B. melitensis y B. suis. 18) SENASA. Manual de diagnóstico serológico de la Brucelosis Bovina. 2009. 19) SENASA. Manual de procedimientos de técnicas diagnósticas en Brucelosis.1998. 20) Silva Paulo, P.; Vigliocco, A.M., Ramondino, R., Marticorena, D., Bici, E., Briones, G., Gorchs, C., Gall, D., Nielsen, K. 2000. Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in Argentina. Clin. Diag. Lab. Immunol. 7:828-831. 21) Szyfres, B. 1983. El Diagnóstico de la Brucelosis Bovina en el Contexto de un Programa de lucha. Boletín Técnico Nº2. IICA/SENASA. 22) Vanzini, V., Aguirre, N., Lugaresi, C.I., de Echaide, S., de Canavesio, V.G., Guglielmone, A., Marchesino, M., Nielsen, K. 1998. Evaluation of an Indirect ELISA for the diagnosis of bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina. Preventive Vet. Med.36:211217. 23) Vanzini, V., Echaide, S., 1998. Brucelosis Enzimoinmunoensayo Indirecto para detectar anticuerpos anti-Brucella abortus en bovinos. Versión traducida y actualizada con datos obtenidos en la EEA Rafaela. 24) STACK J.A., PERRETT L.L., BREW S.D., MACMILLAN A.P. (1999). C-ELISA for bovine brucellosis suitable for testing poor quality samples. Vet. Record, 145, 735–736. 25) WORLD HEALTH ORGANIZATION (2009). WHO Manual técnico de referencia para la higiene de las manos. 26) WORLD HEALTH ORGANIZATION (2005). WHO Laboratory Biosafety Manual, Second Edition. WHO, Geneva, Switzerland. 27) WORLD HEALTH ORGANIZATION (1986). JOINT FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS/WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT COMMITTEE ON BRUCELLOSIS Technical Report Series 740, Sixth Report. WHO, Geneva, Switzerland 28) WRIGHT P.F., NILSSON E., VAN ROOIJ E.M.A., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1993). Standardisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis. Rev.sci.tech.Off.int.Epiz., 12, 435–450. 29) WRIGHT P.F., TOUNKARA K., LELENTA M. & JEGGO M.H. (1997). International reference Standards: antibody standards for the indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci. Tech., 3, 824– 832. Página 65 de 65 SENASA 2019- Brucelosis: Manual de diagnóstico serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) �BRUCELOSIS Manual de Diagnóstico Serológico (B. abortus, B. melitensis, B. suis) 2019 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Brucelosis (B. abortus, B. melitensis, B. suis): Manual de diagnóstico serológico Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2019 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Dirección de Laboratorio Animal Dirección General de Laboratorios y Control Técnico Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0016 Abstract A summary of the resource. El presente Manual tiene como objetivos: ▪ Colaborar con el mejor desempeño y competencia de los Laboratorios que realizan el diagnóstico serológico de la Brucelosis en diferentes especies animales inscriptos en la Red de Laboratorios de SENASA. ▪ Proporcionar a la Red de Laboratorios de SENASA un instrumento que facilite el desarrollo adecuado, sistematizado y estandarizado de los procedimientos técnicos que se realizan en los laboratorios. ▪ Contribuir a la aplicación de las medidas de bioseguridad y controles de calidad que deben cumplirse, cuando se desarrolle un procedimiento técnico. ▪ Contar con un instrumento que sirva de guía para la evaluación y monitoreo de las actividades del laboratorio. Las técnicas diagnósticas descriptas en el presente Manual son las internacionalmente reconocidas y recomendadas por la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL (OIE) y EL SENASA. Table Of Contents A list of subunits of the resource. <div style="text-align: left;">Definiciones y Abreviaturas</div> <div style="text-align: left;">Medidas Generales de Bioseguridad y Seguridad en el Laboratorio</div> <div style="text-align: left;">Introducción Brucelosis</div> <div style="text-align: left;">Procedimientos de Trabajo (ingreso/rechazo de muestras)</div> <div style="text-align: left;">Prueba de screening con antígenos tamponados en placa (BPAT y RBT)</div> <div style="text-align: left;">Prueba de seroaglutinación lenta en tubo (SAT y 2-ME)</div> <div style="text-align: left;">Prueba de anillo en leche</div> <div style="text-align: left;">ELISA Indirecto</div> <div style="text-align: left;">ELISA por competición / bloqueo</div> <div style="text-align: left;">Ensayo de Polarización Fluorescente <br />Fijación de complemento</div> <div style="text-align: left;">Normativa vigente</div> <div style="text-align: left;">Informe de la Subcomisión Técnica de la Comisión Nacional de Brucelosis</div> <div style="text-align: left;">Anexo I Lavado y desinfección de manos</div> <div style="text-align: left;">Anexo II Modelo de Planilla de emisión de resultados</div> <div style="text-align: left;">Bibliografía</div> Brucelosis Laboratorios https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/a0536af112ad52c021a705c370217b18.pdf 90e44e8a4f1293136c60122510239fcd PDF Text Text MANUAL DE DIAGNÓSTICO DE Brucella ovis Versión 1.0/2015 DIRECCION GENERAL DE LABORATORIOS Y CONTROL TECNICO DIRECCION NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis AUTORIDADES Ing. Agr. Diana Guillén Presidente M. V. Luis Carné Vicepresidente Dr. J.L. Ferro Director Nacional de Sanidad Animal Lic. Verónica Torres Leedham Directora General de Laboratorio y Control Técnico Dr. Jorge Rodríguez Toledo Director de Laboratorio Animal Página 2 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis OBJETIVO El presente Manual está dirigido a los Laboratorios veterinarios que realicen el diagnóstico serológico de la Brucelosis ovina. Contiene los requisitos técnicos necesarios para realizar las pruebas con carácter oficial. Las mencionadas técnicas son internacionalmente reconocidas y recomendadas por la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL (OIE) y EL SENASA. Versión 1.0/2015. Elaborado por: Miguel Trezeguet, M.V., MSc Ana M. Nicola, M.V., MSc Sebastián Elena. M.V., MSc Cristina Franco, Vet. Nicolás Venditti, Vet. Página 3 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis INDICE 1. Introducción 1.1 Etiología 1.2 Epidemiologia 1.3 Patogenia 1.4 Manifestaciones clínicas 2. Diagnóstico de Laboratorio 2.1 Medidas Generales 2.2 Aseguramiento de calidad 2.3 Control de calidad de insumos 2.4 Equipos 2.5 Registro de entrada de muestras 2.6 Características y condiciones de las muestras 2.6.1 Condiciones de recepción de las muestras 2.6.2 Condiciones de rechazo de las muestras 3. Diagnóstico de Brucella ovis 3.1 Identificación del Agente 3.2 Pruebas serológicas 3.3 Inmunodifusión en gel de agar 3.4 Fijación de complemento 4. Elisa indirecto 4.1 Equipos 4.2 Materiales 4.3 Guía de problemas y soluciones 5.Referencias 6 6 6 7 8 9 9 11 12 13 13 13 13 14 14 14 14 15 18 42 43 43 45 46 Página 4 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis ABREVIATURAS                   Ag: Antígeno C’: Complemento de cobayo DILAB: Dirección de Laboratorios y Control Técnico ELISA: Enzimoinmunoensayo FC: Fijación de Complemento IDGA: Inmunodifusión en gel de agar IELISA: Enzimoinmnnoensayo Indirecto LPS: Lipopolisacárido M: Molar OIE: Organización Mundial de Sanidad animal PA: Poder anticomplementario RENSPA: Registro Nacional Productor agropecuario UI/ml: Unidades Internacionales por mililitro UIFC: Unidad Internacional fijadora del complemento UC: Unidad de complemento UH: Unidad de hemolisina SH: Sistema hemolítico TV: Tampón veronal calcio- magnesio Página 5 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 1. INTRODUCCION La Brucella ovis es el agente causal de la “Epididimitis Ovina”; esta es una enfermedad infecciosa transmisible que afecta únicamente a ovinos. No es considerada una zoonosis. En los machos se caracteriza por epididimitis e infertilidad. La patogenicidad en la oveja es discutida, causa infertilidad, fundamentalmente en hembras de primer servicio, abortos tardíos y mortalidad neonatal. 1.1. Etiología   Género: Brucella Especie: Brucella ovis Es un cocobacilo Gram-negativo; inmóvil; no hemolítico; no esporulado; sin cápsula; microaerófilo (debe cultivarse en ambiente con 10% de CO 2 para su aislamiento); catalasa positivo; intracelular facultativo. B. ovis, así como las otras integrantes del género, resiste la decoloración por ácidos débiles, en la tinción de Ziehl-Neelsen modificada por Stamp, se observan cocobacilos rojos en fondo azul. El resultado debe ser siempre confirmado por el cultivo bacteriológico. B. ovis presenta inmunogenicidad cruzada con B. canis, ambas especies son las únicas integrantes del género Brucella que son morfológicamente de forma rugosa (cepas rugosas). 1.2. Epidemiología La epididimitis de los carneros producida por B. ovis ha sido diagnosticada prácticamente en todos los países donde se crían ovinos. Tanto machos como hembras pueden infectarse, pudiendo transformarse en portadores; pero, en la epidemiología de la enfermedad, el macho es quien adquiere un papel predominante debido a su capacidad de difundir la enfermedad a otras majadas; siendo la puerta de entrada de la infección al establecimiento libre, la introducción de animales enfermos. Es una enfermedad de carácter venéreo, el material de elección para la transmisión el semen, siendo la vía más importante la encarnerada. Un macho infectado lo transmite a una hembra sana que actúa como vector mecánico, transmitiendo la enfermedad a los machos que la cubren. Los carneros vasectomizados o retajos también pueden infectarse participando en la transmisión de la enfermedad. Página 6 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis La B. ovis se acantona en las vesículas seminales, epidídimos y también se elimina por la orina. Los contagios se producen con mayor frecuencia entre la pubertad y los 15 a 18 meses de edad. La prevalencia en machos reactores serológicos positivos y con manifestaciones clínicas de epididimitis, aumenta con la edad. En los machos jóvenes B. ovis es de menor importancia que otras bacterias (Actinobacillus seminis y Histophilus ovis) como agente etiológico de epididimitis. El agente se elimina por semen, secreciones vaginales, leche y orina, de forma intermitente. También, se ha comprobado, que la bacteria puede recuperarse de secreciones uterinas de ovejas hasta 10 días después del aborto. Aunque se ha descripto como vías de entradas al organismo animal por mucosas nasal, ocular y oral, estas parecen no tener la importancia que tiene la enfermedad provocada por otras especies del género Brucella que afecta a otras especies domésticas. 1.3. Patogenia Las vías más frecuentes de penetración de la bacteria es a través de las mucosas peneana, rectal o vaginal, donde puede permanecer por algún tiempo, para después migrar a los linfonódulos regionales. En estos se multiplica y va siendo liberada al torrente sanguíneo a medida que las células infectadas son destruidas. Esta constante eliminación de bacterias estimula el sistema inmune, que produce inmunoglobulinas G, cuya presencia es de importancia en el diagnóstico. Al final del segundo mes de infección se produce una bacteriemia y el agente se localiza preferentemente en el área genital. En el 90 % de los casos se ubica en la cola del epidídimo, donde provoca una reacción de edema intersticial e inflamación en los tejidos adyacentes a la capa basal del epitelio. Produce edema con llegada de polimorfonucleares y macrófagos, hiperplasia y degeneración vacuolar de epitelio tubular, con ruptura y extravasación del material seminal al intersticio, con la consecuente formación de un granuloma espermático. Durante estas primeras etapas hay un ligero aumento de tamaño y consistencia de la cola del epidídimo, que es prácticamente impalpable, pero en este momento ya existe serología positiva y alteraciones seminales. Las mayores lesiones no son debidas al agente, sino que son debidas al granuloma espermático. Estas alteraciones se desarrollan durante un periodo de meses, tiempo durante el cual se encuentran gran cantidad de microorganismos en el eyaculado. El granuloma espermático resultante semeja a un absceso y la cola puede estar agrandada de tamaño 4 ó 5 veces por la reacción fibrosa. Si el material seminal pasa a la cavidad vaginal causa una severa inflamación con fuertes adherencias. No se produce orquitis primaria, sino que la degeneración testicular es secundaria al estasis en los túbulos seminíferos, que a menudo lleva a calcificación. El órgano afectado es estéril. La Brucella ovis también puede provocar seminovesiculitis. En las ovejas la patogenicidad es baja, pudiendo darse placentitis a nivel trofoblástico, Página 7 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis llevando a isquemia y necrosis de los cotiledones, dando como consecuencia el aborto. 1.4. Manifestaciones clínicas No existen manifestaciones clínicas generales. Solamente 1/3 de los carneros enfermos presentan lesiones palpables. Los casos agudos, son difíciles de detectar clínicamente, se ve en animales jóvenes con edema y aumento del tamaño del escroto, fiebre, depresión y anorexia, a los 3 a 5 días baja la inflamación pero las colas del epidídimo continúan agrandadas. En los casos crónicos la manifestación clínica característica de la enfermedad es una inflamación en la cola del epidídimo, que puede extenderse al cuerpo y cabeza del órgano, los epidídimos se palpan aumentados de tamaño, indurados y con menor elasticidad. En la mayoría de los casos las lesiones son unilaterales, pero pueden observarse ambos testículos afectados. En casos avanzados puede detectarse orquitis con aumento de tamaño o atrofia testicular y degeneración del testículo afectado, así como adherencias de las túnicas que lo envuelven. La fertilidad puede variar desde normal a nula dependiendo del grado de la lesión. En el espermograma se observan gran número de leucocitos, anomalías secundarias (cabezas sueltas y defectos de cola) y células en bote, que son células epiteliales que sufren necrosis; baja concentración espermática y motilidad de masa disminuida. También puede evidenciarse la presencia de microorganismos (no siempre). En las hembras puede observarse vaginitis y cervicitis post-servicio. También se observa aborto e infertilidad, especialmente en las borregas de primera cría. El aborto ocurre en el último tercio de la gestación y el porcentaje es reducido. Luego del aborto puede observarse retención de placenta y lesiones de la placenta fetal, que consisten en placas amarillo-grisáceas en los espacios intercotiledonarios. La infertilidad es temporaria, comportándose normalmente en la próxima época de servicios. También provoca nacimientos de corderos débiles que mueren al poco tiempo de nacidos. Página 8 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 2. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO 2.1 Medidas generales de bioseguridad y seguridad en el laboratorio Las personas que trabajan con agentes infecciosos o materiales potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales, y estar capacitados en las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura. El director o la persona a cargo del laboratorio es responsable de brindar u organizar la capacitación adecuada del personal. Cada laboratorio debe desarrollar o adoptar un manual con procedimientos de bioseguridad que identifique los riesgos que se encontrarán o puedan producirse, y que especifique las prácticas y procedimientos destinados a minimizar o eliminar las exposiciones a estos riesgos. Se debe alertar al personal acerca de los riesgos especiales y se les debe exigir que lea y cumpla las prácticas y procedimientos requeridos. El acceso al laboratorio debe ser limitado o restringido. El laboratorio debe ser diseñado para que su limpieza sea sencilla y contar con una pileta para el lavado de manos. Las superficies de las mesas de trabajo deben ser impermeables al agua y ser resistentes al calor moderado y a solventes orgánicos, ácidos, álcalis y productos químicos utilizados para descontaminar la superficie de trabajo y los equipos. Los muebles de laboratorio deben tener la capacidad de soportar cargas y usos previstos. Los espacios entre las mesas de trabajo, gabinetes y equipos deben ser accesibles para su limpieza. Si el laboratorio tiene ventanas que se abren hacia el exterior, deben estar provistas de mosquiteros. Se deben usar ambos, batas o uniformes de laboratorio de protección adecuados durante la permanencia en el mismo. Se debe retirar y dejar esta ropa de protección en el laboratorio antes de dirigirse a otras áreas (por ejemplo, cafetería, biblioteca, oficinas administrativas).Se debe usar además calzado cerrado y cabello recogido. Se deben usar guantes cuando las manos entren en contacto con materiales infecciosos, superficies o equipos contaminados. Puede ser apropiado el uso de dos pares de guantes. Los guantes se retiran al terminar el trabajo o se descartan y se hace cambio de guantes cuando estos entraron en contacto directo con el material Página 9 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis infeccioso o cuando está comprometida la integridad del guante. Los guantes descartables no se lavan, no se vuelven a usar ni se utilizan para tocar superficies “limpias” (teclados, teléfonos, entre otras), y no se deben usar fuera del laboratorio. Las personas deben lavarse las manos frecuentemente durante el trabajo en el laboratorio, luego de manipular materiales potencialmente viables, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio No está permitido comer, beber, fumar, usar lentes de contacto, maquillarse o almacenar alimentos para consumo personal en áreas de trabajo. Se debe utilizar protección ocular para los procedimientos en los que se puedan producir salpicaduras de material infeccioso u otros materiales peligrosos. La iluminación debe ser adecuada para todas las actividades, evitando los reflejos y el brillo que puedan molestar la visión. Está prohibido pipetear con la boca; se debe utilizar dispositivos mecánicos y aplicar procedimientos para el manejo seguro de objetos cortantes o punzantes. Todos los procedimientos se llevan a cabo con precaución a fin de minimizar la creación de salpicaduras o aerosoles. Las superficies de trabajo se descontaminan antes y después de finalizar las tareas y ante todo derrame de material viable. Todos los cultivos, stocks y otros desechos debidamente segregados se descontaminan antes de ser desechados mediante un método de descontaminación aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato son colocados en un recipiente duradero, estanco y cerrado para su transporte desde el laboratorio. Los materiales que se deben descontaminar fuera del laboratorio inmediato se embalan de conformidad con las normas locales, estatales y federales aplicables antes de retirarlos del establecimiento de acuerdo a las indicaciones de la Ley 24051 de Residuos Peligrosos. Agente: Brucella (B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. suis y B. ovis). El género Brucella clasificado por el “Manual de Bioseguridad en el Laboratorio de la OMS”, en el Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo) agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales Página 10 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. La brucelosis sigue siendo la infección bacteriana de laboratorio más comúnmente reportada. Tanto B. abortus, B. canis, B. melitensis como B. suis pueden provocar la enfermedad en personal de laboratorio atribuidos a la exposición directa o accidental a material infeccioso Hasta la fecha, no se han reportado casos humanos, provocados por B. ovis y es considerada como no zoonótica. Sin embargo, en las zonas donde coexiste infección de B. melitensis con B. ovis, se requiere especial cuidado al manipular muestras, que serán transportados al laboratorio en recipientes para sustancias infecciosas (6.2) Riesgos de laboratorio: El agente puede estar en sangre, en el fluido cerebroespinal, en el semen y, a veces, en la orina. La mayoría de los casos de laboratorio se han producido en instalaciones de investigación y producción y, se debieron a la exposición a las cepas de Brucella patógenas para el hombre, cultivados en grandes cantidades. También se han producido casos en el ámbito del laboratorio clínico por aspirar cultivos bacteriológicos. En estos casos, generalmente, ha habido contacto directo de la piel con los cultivos o con especímenes clínicos infecciosos de animales (por ejemplo, sangre, descargas uterinas). Los aerosoles generados durante los procedimientos de laboratorio, el pipeteo, las inoculaciones parenterales accidentales y los aerosoles hacia los ojos, nariz y boca también han provocado infecciones. Precauciones: Para toda la manipulación de cultivos de Brucella spp. y para estudios experimentales con animales, se debe trabajar con equipos de contención y en instalaciones del Nivel de Bioseguridad 3. 2.2. Aseguramiento de calidad en el Laboratorio Los laboratorios deberán cumplimentar la reglamentación vigente de acuerdo a las BPL (SENASA), Norma ISO/IEC 17025, OIE Quality Standard and guidelines for veterinary Laboratorios: Infectious diseases (2008) Para que los resultados del diagnóstico sean uniformes y confiables, deben efectuarse siguiendo técnicas estandarizadas, con operadores capacitados en la realización e interpretación de los resultados, utilizando equipos y reactivos controlados. Los procedimientos de laboratorio están sujetos a múltiples causas de error que deben ser detectados para poder aplicar acciones correctivas. Página 11 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Los procedimientos se pueden monitorear mediante el control interno, con la utilización diaria de sueros con títulos conocidos y el control externo con interlaboratorios con un laboratorio de referencia. El control permanente de la calidad de los resultados, junto a las buenas prácticas de laboratorio que incluyen la utilización de técnicas evaluadas, personal capacitado y operaciones estandarizadas, garantizan el diagnóstico. 2.3. Control de calidad de insumos Todos los insumos y reactivos que se utilizan en el laboratorio deben estar establecidos con fórmulas y procedimientos detallados en manuales disponibles en el área de trabajo. La composición, tipo de envase, identificación y lugar de almacenamiento debe ser la indicada en los manuales. No introducir cambios que no estén registrados y autorizados por el responsable del laboratorio. Todos los insumos y materiales de referencia deben cumplir con las especificaciones establecidas. El agua empleada en el laboratorio de diagnóstico debe ajustarse a las especificaciones recomendadas para cada uso. En general para el lavado del material de vidrio se usa agua de tipo III, purificada y con una conductividad específica máxima de 5.0 micromhs/cm, 0.2 mega Homs/cm de resistencia específica (mínima), 0.01 mg/l (como máximo) de silicatos y de metales pesados. En la preparación de soluciones para pruebas serológicas, soluciones tamponadas, medios de cultivo y colorantes se emplea agua purificada de tipo II. Admite como máximo una conductividad específica de 2.0 micromhs/cm, 0.5 mega Homs/cm (mínimo) de resistencia específica, 0.01 mg/l (máximo) de silicatos y de metales pesados. Para preparar reactivos y soluciones de referencia, realizar pruebas de ELISA y reconstituir liofilizados se utiliza agua de tipo I. Debe tener una conductividad específica de 0.1 micromhs/cm (máximo), una resistencia específica de 10.0 mega Homs/cm (mínimo) y el mismo límite de silicatos y metales pesados que los tipos anteriores. Los reactivos biológicos que se emplean en las técnicas, deben utilizarse de acuerdo a las especificaciones del Manual de Procedimientos Operativos, respetando las indicaciones para la conservación, almacenamiento y titulación. Los reactivos y kits diagnósticos que se utilizarán y comercializarán en el país, para diagnóstico oficial deberán ser debidamente registrados y aprobados ante el SENASA. Página 12 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 2.4. Equipos El laboratorio debe tener un inventario, programa de control y mantenimiento de los equipos que emplea en el diagnóstico. 2.5. Registro de entrada de muestras Los laboratorios deben contar con un registro de entrada de muestras, en el que conste como mínimo la siguiente información:  Fecha de recepción de muestras.  Cantidad de muestras.  Especie.  Fecha de extracción de muestras.  Procedencia: establecimiento, número de RENSPA.  Localidad: departamento, partido, provincia.  Remitente: veterinario acreditado, nombre y número de registro, otorgado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal (DNSA) SENASA.  Motivo del envío: saneamiento, traslado, importación, exportación y otros.  Fecha de emisión de los resultados. 2.6. Características y condiciones de las muestras 2.6.1. Condiciones de "recepción" de las muestras:  Sangre entera o suero refrigerados.  Suero congelado.  Tubos con identificación clara, de preferencia sobre cinta de papel o similar adherida al tubo; con marcación firme e indeleble en el cuerpo del tubo. 2.6.2. Condiciones de "rechazo" o demora del procesamiento de las muestras:  Falta de planillas protocolo o planillas incompletas.  Sangre entera congelada. Página 13 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis  Sangre entera o suero, contaminados.  Sueros hemolizados.  Tubos no identificados. Los Laboratorios deberán ser exigentes con la calidad de las muestras a procesar, como así también con la planilla de toma de muestra firmada por el veterinario acreditado actuante que debe acompañar a las muestras. Los informes que elabore el Laboratorio deberán ser precisos para poder desarrollar adecuadamente las acciones de saneamiento. 3. Diagnóstico de Brucella ovis 3.1 Identificación del agente: Lesiones clínicas (epididimitis y orqui-epididimitis) en carneros puede ser indicativo de la existencia de la infección, pero se requieren exámenes de laboratorio para confirmar la enfermedad. La confirmación de laboratorio puede basarse en métodos directos o indirectos. El diagnóstico directo se realiza mediante el aislamiento bacteriológico de B. ovis de muestras de semen o tejidos de carneros, o secreciones vaginales, la leche y los tejidos de ovejas, en medios selectivos adecuados. Brucella ovis es similar a las otras Brucella spp. en su morfología, propiedades de tinción y las características culturales, excepto que da reacciones negativas a las pruebas de oxidasa y ureasa. Los métodos moleculares se han desarrollado para la identificación complementaria basado en secuencias genómicas específicas. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede proporcionar medios adicionales de detección. Sin embargo, se prefiere el diagnóstico indirecto basado en pruebas serológicas para el diagnóstico de rutina. 3.2 Pruebas serológicas: La prueba de Fijación del Complemento (FC), la prueba de inmunodifusión en gel de agar (IDGA) y ensayos inmunoenzimáticos indirectos (I-ELISA) usando antígenos de superficie solubles obtenidos de la cepa B. ovis REO 198, se deben utilizar para el diagnóstico. La sensibilidad de la pruebas de IDGA y I-ELISA son similares y pueden ser más elevada que el FC. Una combinación en paralelo de la prueba IDGA y I-ELISA parece dar los mejores resultados en términos de sensibilidad, pero con respecto a la sencillez y el costo, la prueba IDGA es la prueba más factible para el diagnóstico de B. ovis en laboratorios no especializados. Sin embargo, debido a la falta de métodos normalizados reconocidos a nivel internacional para la IDGA y I-ELISA, la prueba prescrita para el comercio internacional sigue siendo la FC. Antígenos HS para su uso en pruebas serológicas deben ser preparados a partir de Brucella ovis cepa REO 198 es CO 2 y suero independiente. Página 14 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis El Suero Estándar Internacional anti-Brucella ovis (1985) es la referencia utilizada para comparar y estandarizar el resto de los patrones secundarios. Este estándar de referencia está disponible para los laboratorios de referencia nacionales y debe utilizarse para establecer los estándares secundarios o nacionales frente a los cuales puedan prepararse los estándares de trabajo que se utilizarán en el laboratorio de diagnóstico de forma sistemática en el día a día. 3.3. Inmunodifusión en gel de agar Materiales:     Micropipetas de 10-100µl. Placas de Petri (100mm de diámetro) / porta objetos Recipientes varios. Puntas de pipetas (tips). Equipos:         Centrífuga. Heladera. Freezer. Vortex. Sacabocado perforador de agar. Bomba de vacío. Cámara húmeda. Caja de lectura con fondo oscuro. Reactivos:  Antígeno HS preparado a partir de Brucella ovis cepa Reo 198 aprobado por SENASA. Conservar el Antígeno en el freezer a -20 ± 5° C, en envase de vidrio, No de poliestireno. No se debe conservar en la heladera.  Suero control positivo. Drogas y Soluciones:     Agar Noble o agarosa. Cloruro sódico. Ácido Bórico. Cloruro Potásico. Página 15 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis  Agua destilada. Preparación de tampón borato (preparado con ácido bórico [12,4 g]; cloruro potásico [14,5 g] y agua destilada [1.600 ml]; ajustado a pH 8,3 con una solución de NaOH (0.2 M), y llevado hasta 2.000 ml de volumen final con agua destilada). Para preparar el agar se disuelve 1g de agarosa (o agar Noble), 10 g de NaCl en 100 ml de tampón borato hirviendo mientras se agita continuamente. Se cubren los portaobjetos o placas de petri colocados sobre una superficie plana, con la cantidad necesaria del agar fundido para formar un lecho de 2,5 mm de espesor (aproximadamente 3,5 ml para los portaobjetos estándar y 13-14 ml en placas de Petri de 100 mm) Después de que el agar se haya solidificado (15–20 minutos) en una superficie nivelada, se recomienda dejar al menos una hora en heladera para asegurar que el agar este bien firme cuando se perfora, se recortan los pocillos utilizando un sacabocado para agar. Los pocillos deberán ser de 3 mm de diámetro y estar separados 3 mm entre ellos, y estar dispuestos según un patrón hexagonal alrededor de un pocillo central que también tendrá 3 mm de diámetro. Ejecución del ensayo: Descongelar y mezclar bien los sueros y el antígeno utilizando preferentemente vortex o invirtiendo el tubo (o envase) varias veces. Con micropipeta cargar los pocillos 2, 4 y 6 en forma individual con los sueros a procesar y en los pocillos 1, 3 y 5 el suero control positivo. Por último cargar en el pocillo central el antígeno. (Fig. 1) Los pocillos serán llenados completamente teniendo la precaución de no desbordar, ni dejar burbujas. A su vez ningún pocillo debe quedar sin cargar. Revisar bien las rosetas y descatar aquellas donde, por una mala perforación, el agar esté rajado y haya comunicación entre los pocillos. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente 22 ± 4 ºC, 48 horas. Realizar una primera lectura a las 24 hs y la lectura definitiva a las 48 hs. Página 16 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Fig. 1 Diagrama de siembra de sueros y antígeno Suero problemas: Pocillos 2, 4 y 6 Sueros controles: Pocillos 1, 3 y 5 Antígeno: Pocillo central 1 6 2 5 3 4 Lectura e interpretacion de resultados: La lectura se efectúa bajo haz de luz suave indirecta sobre un fondo oscuro revelando las bandas de precipitación. Antes de una lectura definitiva, si se observan líneas inespecíficas, se recomienda lavar las placas de agar durante una (1) hora en una solución en agua de citrato sódico al 5% para limpiar las líneas de precipitación inespecíficas. Las reacciones se clasifican en: POSITIVAS: Cuando se aprecia una banda o línea de precipitación definida entre el pocillo central (Ag) y los orificios de los sueros problemas, mostrando una identidad total o parcial con la del suero control positivo. También pueden aparecer líneas de precipitado que no den una identidad total y que pueden corresponder a componentes antigénicos minoritarios de los extractos HS (en las infecciones debidas a otras especies del género Brucella también pueden generarse con frecuencia anticuerpos frente a estos componentes). Estas reacciones también deben considerarse positivas. NEGATIVAS: Cuando no se aprecia ninguna banda de precipitación entre el orificio central (Ag) y los orificios de los sueros problema. Criterios de aceptación del resultado De no observar la presencia de la banda de precipitación de los controles positivo, la prueba será considerada como no válida y deberá ser repetida. Página 17 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 3.4 Fijación de complemento Materiales:  Material de vidrio de volúmenes varios.  Pipetas de : 1 ml, 2 ml, 5 ml y 10 ml.  Gradillas.  Parafilm para cubrir placas.  Puntas de pipetas (Tips).  Tubos de centrífuga cónicos.  Tubos de Khan.  Placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U. Equipos:  Estufa 37 ± 2°C.  Termo de nitrógeno líquido o freezer (- 70°C ± 10ºC).  Baño termostático 60-63°C.  Agitador de placas.  Espectrofotómetro (540nm).  Micropipetas automáticas monocanales y multicanales de rango 10 µl a 200 µl.  Termométros certificados.  Peachímetro.  Balanza. Reactivos:  Suspensión de glóbulos rojos 2% (GR 2%).  Hemolisina producida en conejo (H).  Complemento de cobayo (C).  Antígeno de Brucella ovis (Cepa Reo 198) (Ag). Sueros:  Suero control positivo.  Suero control negativo.  Sueros problemas a analizar. Soluciones (Anexo I):  Tampón veronal calcio magnesio 5X (TV 5X).  Tampón veronal calcio magnesio 1X , pH 7,3-7,4. (TV 1X). Página 18 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis EJECUCION DE LA PRUEBA (Microtécnica): Utilizar microplacas de 96 pocillos fondo en U. Presentar la microplaca de manera que las letras indiquen columnas (diluciones del suero) y los números indiquen las filas (sueros a analizar). De esta manera, en cada placa se incluyen 12 muestras de suero para análisis y a cada muestra se le realizan 8 diluciones en base 2 (1:2 a 1:256). El procedimiento se desarrolla en caliente (incubación en estufa a 37 ± 2°C) y utiliza los siguientes reactivos en volumenes de 25 µl: a) b) c) d) e) Tampón Veronal 1X. Sueros inactivados a 60 – 63°C Solución de complemento de cobayo en TV 1X que contenga 2 UC/ml. Solución de antígeno en TV 1X a la dilución de trabajo. Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales de una solución de hemolisina en TV 1X que contenga 2 UH/ml y de una suspensión de eritrocitos de carnero en TV 1X al 2%. Inactivación de los sueros Las muestras de suero se inactivan en baño termostático para eliminar el complemento natural contenido en las mismas. La temperatura del baño se controlará mediante la introducción de un termómetro certificado durante todo el tiempo de exposición de las muestras al agua. Los sueros se inactivan por 30 minutos en baño termostático a 60ºC – 63°C (en caso de que los sueros sean anticomplementarios, se recomienda realizar otra ciclo de inactivación de 30 minutos). Las muestras podrán ser sumergidas en el baño termostático de la siguiente forma:  En tubos de khan tapados herméticamente, contenidos en gradillas, debidamente identificados. La inactivación de las muestras podrá realizarse un día antes del análisis. En este caso, una vez retiradas del baño termostático se dejarán a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para luego conservar en heladera. Si el análisis se realizaría después de las 24 hs, las muestras ya inactivadas se conservaran a -20 ± 5° C. Página 19 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Controles utilizados Sueros controles:  Control positivo o o o  Pre-diluir el suero control positivo 1/12,5 con TV 1X, inactivar, alicuotar y conservar a –20 ± 5 º C. Dispensar 25 µl/pocillo de TV 1X en la fila 1 de la placa control desde 1G hasta la 1A. Dispensar en el pocillo H1, 50 µl del suero control positivo diluido previamente 1/12,5 con TV 1X, tomar 25 µl de suero del pocillo H1 y pasarlo al pocillo G1, homogeneizar bien los dos componentes, luego pasar 25 µl al siguiente pocillo F1, y repetir la misma secuencia hasta el pocillo A1. Tabla 1 Control negativo Se realiza una dilución en base 1:2 de la siguiente manera: o Dispensar 25 µl/pocillo de TV 1X en la fila 2 de la placa control desde 2H hasta la 2A, o Dispensar en el pocillo H2, 25µl del suero control negativo, homogeneizar bien, tomar 25 µl del pocillo H2 y pasarlo al pocillo G2, homogeneizar bien los dos componentes, luego pasar 25 µl al siguiente pocillo F2, y repetir la misma secuencia hasta el pocillo A2. Tabla 1  Control de la ausencia de poder anticomplementario del antígeno o o o o  Dispensar por duplicado (H3 y G3) en la microplaca de los controles 25 µl/pocillo de la solución de antígeno 25 µl/pocillo de TV 1X 25 µl/pocillo de C Controles del sistema hemolítico Sin complemento: Dispensar 75 µl de TV 1X por duplicado (H4 y G4) en la placa de controles. Con complemento: Se dispensa en H5 o 50 µl/pocillo de TV 1X o 25 µl/pocillo de C Página 20 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Tabla 1: Placa de controles C B A Control de SH con C’ D Control del SH sin C' E Control de ausencia de ant. delAg 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 25µl 50 µl Suero POS 1:2 Dilución suero control negativo F Dilución suero control positivo G H 1:12,5 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 1 25µl TV 1:4 25 µl Suero 25µl puro NEG 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 2 25µl 25µl TV 25µl Ag 25µl C’ 25µl TV 25µl Ag 25µl C’ 75µl TV 75µl TV 4 50µl TV 25µl C’ 50µl TV 25µl C’ 5 3 Dilución de las muestras de sueros problemas En otra placa,  Dispensar en cada pocillo 25 µl de TV 1X, de acuerdo a la cantidad de sueros a procesar.  Dispensar 25 µl de suero en el pocillo H1, homogeneizar bien los dos componentes con pipetas monocanal o multicanal, luego pasar 25 µl del pocillo H1 al G1, homogenizar y pasar 25 µl al pocillo F1, luego repetir la misma secuencia hasta el pocillo A1.  La secuencia de operaciones se detalla en la Tabla 2. Las diluciones se realizarán con pipetas monocanal o multicanal. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se mezclan mediante el pipeteo por cinco veces consecutivas como mínimo. Página 21 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Preparación de la solución de antígeno y complemento y su distribución en la microplaca de los sueros controles positivo y negativo y en los sueros a analizar.    Se preparan las soluciones de C y Ag según la dilución de trabajo establecida como óptima.(Ver Anexo II) Una vez diluidos los sueros con la TV 1X, dispensar la solución de antígeno a razón de 25 µl /pocillo, en todos los pocillos excepto en la columna H de la dilución 1:2 que actuarán como controles de poder anticomplementario (AC) de cada suero. A continuación dispensar 25 µl/pocillo de la solución de C en todos los pocillos de la microplaca. Tabla 3. Primera incubación en caliente  Cubrir y agitar las microplacas en agitador de placas durante 2 – 4 minutos  Incubar las microplacas en estufa a 37 ± 2°C durante 30 minutos. Página 22 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Tabla 2: Distribución de las muestras problemas a analizar en una microplaca de 96 pocillos fondo en U (12 sueros × 8 diluciones) 25µl suero 6 25 µl TV 25µl suero 7 25 µl TV 25µl suero 8 25 µl TV 25µl suero 9 25 µl TV 25µl suero 10 25 µl TV 25µl suero 11 25 µl TV 25µl suero 12 25 µl TV 1:8 1:16 1:32 1:64 A 25µl suero 5 25 µl TV 1:4 B 25µl suero 4 25 µl TV C 25µl suero 3 25 µl TV D 25µl suero 2 25 µl TV E 25µl suero 1 25 µl TV F 25 µl G H 1:2 1:128 1:256 25µl 1 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 25µl TV 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 En la columna H con la dilución 1:2 se evalúa la actividad anticomplementaria de cada suero a analizar. En lugar del antígeno se debe completar el volumen final con 25 µl solución TV 1X. Agregado del sistema hemolítico  Finalizada la primera incubación, dispensar el sistema hemolítico a razón de 25 µl en todos los pocillos de las placas. Tabla 3 Segunda incubación en caliente (ídem anterior) Centrifugación/reposo de la microplaca  Finalizada la segunda incubación, centrifugar las microplacas a 2000 rpm durante 5 minutos o bien dejar en reposo en heladera durante una hora antes de su lectura. Página 23 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Tabla 3: Distribución final de los reactivos por pocillo de la placa H G F E D C B A 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 25µl TV 25µl Ag 25µl C’ 25µl TV 25µl Ag 25µl C’ 25µl suero 1 50 µl TV 25µl C’ 25µl TV 25µl Ag 25µl C’ 25µl TV 25µl Ag 25µl C’ 25µl TV 25µl Ag 25µl C’ 25µl TV 25µl Ag 25µl C’ 25µl TV 25µl Ag 25µl C’ 1 1ºincubación 25µl SH 25µl SH 25µl SH 25µl SH 25µl SH 25µl SH 25µl SH 25µl SH 2ºincubación Cálculos y expresión de los resultados El grado de fijación del complemento se manifiesta por la presencia o ausencia de hemólisis del sistema hemolítico. Se expresa en forma de UIFC (unidades internacionales fijadoras del complemento) según el título o dilución de la muestra (1:4,1:8, etc) seguido de 1, 2, 3 o 4 cruces según el grado de fijación de complemento en dicha dilución. El título menor que se cuantifica es 1:4 + (16,6 UIFC) y el rango de trabajo esta comprendido entre 1:4 + y 1:256 ++++ (16,6 a 1702,7 UIFC). El poder anticomplementario de los sueros se controla en la columna H, dilución 1:2. La presencia de al menos un 25% de sedimento de eritrocitos (+) en la fila H (dilución 1:2) indica que el suero problema puede tener poder anticomplementario. En tal caso se informa el resultado ¨PA¨, y se solicitará una nueva extracción de suero para repetición del ensayo. El resultado de la reacción será “positivo” o “negativo”. En el primer caso la reacción positiva se cuantificará mediante la determinación del título y su grado de hemólisis o fijación del complemento. Reacción positiva:  Sedimentación en grado variable de los eritrocitos en el fondo del pocillo. Página 24 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis  El sobrenadante estará afectado por un cierto tinte rojizo en función de la hemólisis que se haya producido. ++++ +++ ++ + 0% de hemólisis o 100% fijación del complemento (completa) Sobrenadante translúcido, en el fondo de la placa un botón de depósito de eritrocitos 25% de hemólisis o 75% de fijación del complemento Sobrenadante rojizo en un 25% de intensidad; en el fondo un depósito claro de eritrocitos 50% de hemólisis o 50% de fijación del complemento Sobrenadante rojizo en un 50% de intensidad; en el fondo un depósito tenue de eritrocitos 75% de hemólisis o 25% de fijación del complemento. Sobrenadante rojizo en un 75% de intensidad; en el fondo un depósito muy tenue de eritrocitos Reacción negativa: 100% de hemólisis con ausencia de depósito de eritrocitos. Interpretación de los resultados Existe un sistema de unidades basado en el Estándar Internacional para el Suero antiBrucella ovis (Estándar Internacional 1985). Este suero contiene 1000 UlFC/ml. Si este suero se analiza con un método determinado y da, por ejemplo, un título de 100, entonces el factor para un suero desconocido analizado mediante ese método se puede hallar a partir de la fórmula: 1.000/100 × título del suero problema = número de UIFC (unidades internacionales de FC) de anticuerpo en el suero problema por ml. Los resultados deben expresarse siempre en UIFC, calculados con relación a aquellos obtenidos en una titulación en paralelo con un suero patrón nacional, que a su vez ha sido estandarizado con el suero Estándar Internacional. Se considerara la muestra positiva cualquier valor ≥50 UIFC/ml (1/8 ++++). Para la expresión de los resultados se puede utilizar la formula con el suero patrón antes mencionada o emplear una tabla establecida (Tabla 4) basada en el presente manual en el Procedimiento IZS TE B2. 1.6 SOP 004 del Centro Internacional de Referencia OIE para Brucelosis Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell ”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Teramo. Italia Página 25 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Dilución % de fijación del C UIFC + 16,6 ++ 20 +++ 23,2 ++++ 26,6 + 33,2 ++ 40 +++ 46,4 ++++ 53,2 + 66,4 ++ 80 +++ 92,8 ++++ 106,4 + 132, 8 ++ 160 +++ 185,6 ++++ 212,8 + 265,6 ++ 320 +++ 371,2 ++++ 425,6 + 531,2 ++ 640 +++ 742,4 ++++ 851,2 + 1062,4 ++ 1280 +++ 1484,8 ++++ 1702,4 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 Tabla 4. Interpretación de los resultados expresada en UIFC Página 26 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Lectura de los controles El ensayo es satisfactorio si los controles han dado los resultados esperados: Controles Resultado Esperado 50 % de fijación (++) Suero control positivo en la dilución 1:200 que corresponde a 1000 UIFC 100% de hemólisis Suero control negativo en todos las diluciones, ausencia de fijación de complemento 100% de hemólisis Control de poder anticomplementario de los sueros ausencia de fijación del complemento en la dilución 1/2 (sin antígeno) Control de ausencia de poder anticomplementario del antígeno 100 %hemólisis Control del sistema hemolítico sin C 0% de hemólisis Control del sistema hemolítico con C 100% de hemólisis En el caso que los controles no se encuentren dentro de los límites aceptables, el ensayo será considerado como no válido y la prueba deberá ser repetida. Página 27 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 3.4.1. ANEXO I Preparación de soluciones Tampón Veronal Calcio magnesio (TV) Solución madre (5X) NaCl Na 5-5 dietil barbiturato Ácido clorhídrico 1 N (*) Solución concentrada de Ca++ y Mg++ Agua destilada c.s.p. 83 g 10,19 g 34,58 ml 5 ml 2000 ml a) En un matraz aforado de 2000 ml, disolver el NaCl y el barbiturato de sodio en 500 ml de agua destilada. b) Agregar el ácido clorhídrico 1N. c) Agregar 5 ml de la solución concentrada de Ca++ y Mg++, la cual se prepara de la siguiente manera: CaCl 2 .2 H 2 O Mg Cl 2 .6 H 2 O Agua destilada 4,4 g 20,3 g 100 ml d) Completar el volumen hasta 2000 ml con agua destilada y mezclar. Solución de trabajo 1X (pH 7,3 -7,4) Realizar una dilución 1:5 con agua destilada de la solución madre 5X. Conservar en heladera 5 ± 3°C Tiempo de validez: 5 días. Página 28 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 3.4.2. ANEXO II Metodología para la preparación estandarización de la suspensión de glóbulos rojos de carnero al 2% Materiales:  Cámara de Neubauer.  Material de vidrio de volúmenes varios.  Pipetas de: 1 ml, 2 ml, 5 ml y 10 ml.  Gradillas.  Tips.  Tubos de centrifuga graduado.  Micropipetas de 10 – 200 µl. Equipos  Se utilizan los mismos equipos descriptos en 3.4 (ensayo de FC). Soluciones  Tampón veronal 1X pH 7,3-7,4.  Glóbulos rojos de carnero (adquiridos comercialmente) Drogas  Cloruro de Sodio.  5-5 dietilbarbiturato de sodio.  Cloruro de Magnesio.  Cloruro de Calcio.  Ácido Clorhídrico.  Citrato de Sodio. Preparación de los Glóbulos rojos a) Lavado de glóbulos rojos:      Filtrar la sangre a través de una gasa y depositar en un tubo cónico de centrífuga graduado en 10 ml. Centrifugar la sangre aproximadamente a 2000 rpm durante 5 minutos. Descartar el sobrenadante, tratando de arrastrar los leucocitos que forman una capa amarillenta en la parte superior de la columna de hematíes. Suspender los eritrocitos en TV 1X en una proporción 1 volumen de GR + 5 volúmenes de TV 1X, homogeneizar cuidadosamente. Centrifugar aproximadamente a 2000 rpm durante 5 minutos y luego eliminar el sobrenadante con una pipeta. Página 29 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis  Repetir la suspensión de los eritrocitos y la centrifugación dos veces más. Luego de la última centrifugación descartar el sobrenadante. b) Estandarización de glóbulos rojos al 2%: El método para la estandarización de la suspensión de glóbulos rojos se puede realizar por medio de dos técnicas:   Método espectrofotométrico. Método en cámara de Neubauer. Método espectrofotométrico: Preparar la concentración de GR al 2%(0,2 ml GR + 9,80 ml de TV 1X). Tubo 1: blanco de lectura para el espectrofotómetro. Agregar en un tubo: 5,6 ml de agua destilada + 0,4 ml de TV 1X.  Dispensar 2,5 ml en cada cubeta del espectrofotómetro (dependerá del modelo de espectrofotómetro utilizado). Tubo 2: Para determinar la lisis 100% de los GR Realizar una dilución 1:15, con agua destilada: 0,2 ml de glóbulos rojos al 2% + 2,8 ml de agua destilada.  Una vez lisados los eritrocitos, se lee la densidad óptica (DO) a 540nm contra el blanco.  La DO esperada es de 0.330 ± 0.05 (Esto deberá ser determinado según el modelo de espectrofotómetro utilizado en el laboratorio). Método en cámara de Neubauer:  Determinar el volumen de la columna de glóbulos y calcular la cantidad de solución TV 1 X necesaria para hacer una suspensión al 2%aproximadamente (0,2 ml GR + 9,80 de TV).  Realizar el recuento de glóbulos rojos en la cámara.  La suspensión deberá tener 5,4 X 108 GR/ml. Página 30 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 3.4.3. ANEXO III Determinación de la dilución de trabajo óptima del complemento y hemolisina Se realiza previamente al ensayo. Se busca determinar en conjunto el valor de sensibilización de la hemolisina para los GR de carnero expresado como UH (Unidades Hemolíticas) y la concentración de uso del complemento en la reacción de fijación del complemento expresado como UC (unidad complemento). Reactivos y Soluciones  Suspensión de glóbulos rojos al 2%.  Hemolisina: se conservará según instrucción del fabricante. Se titulará cada lote recibido, previa dilución 1:100 con agua destilada (dilución ¨madre¨), que se conservará a -20º C ± 5ºC hasta el momento de su uso, en cantidades suficientes para un día de trabajo.  Complemento de cobayo: conservado a (-70ºC) o en nitrógenos líquido a (186°C).  Tampón veronal calcio 1X.  Tampón veronal 5X. Condiciones de realización Trabajar a temperatura de laboratorio22°C ± 4°C. Las incubaciones del ensayo se realizarán en estufa a 37°C ± 2º C.  La titulación simultánea del complemento y la hemolisina se debe realizar cada vez que un nuevo lote de complemento, hemolisina y/o glóbulos rojos son producidos.  El control de 2 Unidades de C debe ser realizado cada día antes del ensayo usando GR 2%.  El complemento que sea objeto de titulación debe descongelarse a temperatura de laboratorio. Una vez descongelado se mantendrá en refrigeración y solo se sacará de la heladera en el momento de su utilización. Si se prevee que se va a utilizar más de un vial se mezclan y se titula el pool. Tras su uso diario se guardará a una temperatura de (-70º C) o en nitrogeno líquido a (– 186° C.) Página 31 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Preparacion de las diluciones Dilución del complemento:  Preparar una dilución 1:10 de complemento en TV 1X (130µl de complemento + 1170 µl de TV 1X) y conservar en una caja con hielo durante la titulación. Realizar las siguientes diluciones de complemento a partir de la dilución 1:10 (Tabla 5) y conservar en caja con hielo durante la titulación Tabla 5. Diluciones del complemento Dilución Complemento 1/10 TV 1X 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 200 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 400 µl 300 µl 400 µl 500 µl 600 µl 700 µl 900 µl 550 µl 650 µl 750 µl 1150 µl 1350 µl  Dilución de hemolisina:  Hemolisina 1:100 en TV 1X o 10 µl de hemolisina o 990 µl de TV 1X  Hemolisina 1:500 en TV 1X o 500 µl de (hemolisina 1:100) o 2000 µl de TV 1X A partir de la dilución de hemolisina 1:500 preparar en tubos las siguientes diluciones (Tabla 6 ) Página 32 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Tabla 6. Dilución de hemolisina Hemolisina Tubo Dilución 1/500 TV 1X 1 2 3 4 5 6 7  500 µl 500 µl 250 µl 125 µl 250 µl 250 µl 250 µl 1/1000 1/1500 1/2000 1/4000 1/6000 1/ 8000 1/10000 500 µl 1000 µl 1000 µl 1500 µl 2500 µl 3500 µl 4500 µl Preparación del sistema hemolítico o Preparar y enumerar un set de 7 tubos, uno por cada dilución de hemolisina. o Agregar en cada tubo 500 µl de hemolisina de cada dilución. o Agregar 500 µl de glóbulos rojos estandarizados al 2 % en todos los tubos que contienen las diluciones de hemolisina. o Incubar en estufa a 37º ±2 °C durante 15 minutos. Titulación cruzada en microplaca del complemento y la hemolisina (Tabla 9) a) Distribución de TV 1X  Desde la fila A hasta la fila G de la microplaca agregue 50 µl/pocillo de TV 1X. b) Distribución del Complemento  Agregue 25 µl/pocillo de cada dilución del complemento en todos los pocillos de la microplaca excepto en la fila H como se muestra en la Tabla 7. Tabla 7. Distribución de las diluciones del complemento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 B 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 C 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 D 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 E 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 F 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 G 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/100 1/120 1/140 1/160 1/240 1/280 H Página 33 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis c) Distribución del Sistema Hemolítico  Finalizada la incubación de las diluciones del sistema hemolítico distribuir 25 µl/pocillo del sistema hemolítico en la misma microplaca según el esquema indicado en la tabla 8 Tabla 8. Distribución de las diluciones de la hemolisina 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 B 1500 1500 1500 1500 1500 1500 1500 1500 1500 1500 1500 1500 C 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 D 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 4000 E 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 6000 F 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 8000 G 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 10000 H CSH c/C 1000 CSH s/C 1000 CI GR Tabla 9 Complemento Hemolisina 1000 A 1500 B 2000 C 4000 D 6000 E 8000 F 10000 G H 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 240 280 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CSH c/C 1000 CSH s/C 1000 CI GR d) Distribución de los controles  Control del sistema hemolítico con complemento (CSH c/C)  Dispensar en el pocillo H1:  50 µl de TV 1X  25 µl de complemento dilución 1:30  25 µl del sistema hemolítico 1:1000  Control del sistema hemolítico sin complemento (CSH s/C)  Agregar en el pocillo H2:  75 µl de TV 1X  25 µl del sistema hemolítico 1:1000  Página 34 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis  Control de integridad de glóbulos rojos (CI GR)  Agregar en el pocillo H3:  75 µl de TV 1X  25 µl de glóbulos rojos al 2 % e) Incubación: Ídem explicación de la técnica de complemento (3.4). f) Centrifugación/reposo de la placa: Ídem explicación de la técnica de complemento. (3.4). Expresión de resultados: Ídem explicación de la técnica de complemento (3.4). Lectura de controles. Ídem explicación de la técnica de complemento (3.4). Lectura de la titulación  Título del complemento: Es la mayor dilución del complemento donde se observa un 100 % de hemólisis con la mayor dilución de la hemolisina. Esto representa 1 unidad de complemento (UC), pero para la ejecución del ensayo se usará 2 unidades de complemento (2UC)  Título de la hemolisina: Es la mayor dilución de hemolisina donde se observa un 100 % de hemólisis con la mayor dilución del complemento. Esto representa 1 unidad de hemolisina (UH), pero para el ensayo principal se usará 2 unidades de hemolisina (2UH). Cálculo de la dilución de trabajo (DDT) Supongamos que UC = 1/120(según el desarrollo en el presente procedimiento). DDT 2 x UC = 2 x 1/ 120 = 1/60 Para calcular la dilución de trabajo de la hemolisina se procede de la misma manera: Supongamos que UH = 1/2000 DDT 2 x UH = 2 x 1/2000 = 1/:1000 Control de 2 Unidades de complemento (2 U) Una vez obtenida la dilución de trabajo se realizará el control de 2 UC y 2 UH, también se chequeará las diluciones de complemento 1/50 y 1/70 y para la hemolisina la dilución 1/1000 y 1/2000; esto nos permitirá seleccionar la dilución óptima de trabajo. Página 35 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis La prueba se efectuará por duplicado utilizando 4 pocillos por cada dilución de complemento. a) Preparación de sistema hemolítico:  Preparar dos tubos con 1000 µl de las diluciones de hemolisina 1/1000 y 1/2000  Agregar a los tubos 1000 µl de glóbulos rojos estandarizado al 2%  Agitar e incubar en estufa a 37º C ±2 °C 15 minutos. b) Preparación del complemento:  Preparar 3 diluciones de complemento (1/50, 1/60, 1/70) c) Distribución en la microplaca  Dispensar 25 µl/pocillo de TV 1X en las columnas según el esquema indicado en la Tabla 10. Tabla 10. Distribución de TV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl C D 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl  En la misma placa dispensar 50 µ/pocillo de complemento de la diluciones 1/50, 1/60 y 1/70 en las columna 1, 5 y 9 respectivamente como se indica en la Tabla 11. Página 36 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Tabla 11. Distribución del complemento 1 2 3 4 5 6 1/50 1/60 7 8 9 10 1/70 A B 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl C D 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl 50µl 11 12  Con la pipeta multicanal pasar 25 µl /pocillo de la columna 1 a la columna 2. La homogenización de los dos componentes de cada dilución se realizará mezclando mediante la acción de pipetear durante 5 veces. Recoger 25 µl/pocillo de la columna 2 y pasar a la columna 3, volver a homogeneizar, recoger 25 µl/pocillo y pasar a la columna 4, homogeneizar y recoger 25 µl/pocillo y descartar. Repita la misma operación con las diluciones que se encuentran en la columna 5a 8 y 9 a 12  Las diluciones del complemento quedarán dispuestas en la microplaca como muestra la Tabla 12 Tabla 12. Diluciones del complemento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 25µl 2UC 25µl 1UC 25µl 1UC 25µl 2UC 25µl 1UC 25µl 2UC 25µl 1UC C 25µl 2UC 25µl 1UC 25µl 2UC 25µl 1UC 25µl 2UC 25µl 1UC D 25µl 2UC 25µl 1UC 25µl 2UC 25µl 1UC 25µl 0,25 UC 25µl 0,25 UC 25µl 0,25 UC 25µl 0,25 UC 25µl 1UC 25µl 1UC 25µl 0,5 UC 25µl 0,5 UC 25µl 0,5 UC 25µl 0,5 UC 25µl 2UC 25µl 2UC 25µl 0,25 UC 25µl 0,25 UC 25µl 0,25 UC 25µl 0,25 UC 25µl 2UC B 25µl 0,5 UC 25µl 0,5 UC 25µl 0,5 UC 25µl 0,5 UC 25µl 2UC 25µl 1UC 25µl 0,5 UC 25µl 0,5 UC 25µl 0,5 UC 25µl 0,5 UC 25µl 0,25 UC 25µl 0,25 UC 25µl 0,25 UC 25µl 0,25 UC  Dispensar 50 µl de TV 1X en todos los pocillos.  Agregar 25 µl/pocillo de SH 1/1000 (previamente incubado 15 min a 37º ± 2 °C) en la fila A y B y 25 µl /pocillo de SH 1/2000en la fila C y D. d) Incubación: Ídem explicación de la técnica de complemento (3.4) e) Centrifugación/reposo de la placa: Ídem explicación de la técnica de complemento (3.4) Página 37 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Lectura y elección de la dilución de trabajo La dilución del complemento y hemolisina que se aceptará deberá dar como resultado Resultado Esperado En la primera y segunda dilución (2 UC y 1UC) 100% de hemólisis En la tercera dilución (0,5 UC) 50 % de hemolisis En la cuarta dilución (0,25 UC) 0 % de hemolisis Página 38 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 3.5.4. ANEXO IV Titulación del Antígeno La titulación tiene como objeto determinar la dilución de trabajo óptima del antígeno que debe emplearse en la cuantificación de anticuerpos para el serodiagnóstico de brucelosis. Este procedimiento se aplicará para cada lote de antígeno que vaya a emplearse como reactivo en dicho ensayo. Está reacción requiere de un título mínimo para que la misma se lleve a cabo, es decir, se debe garantizar una concentración mínima de antígeno que reaccione con los anticuerpos y sea capaz de fijar el complemento. Para garantizar esta concentración se realizará esta titulación de antígeno. Realización 1. Dilución e inactivación de los sueros controles positivos y negativos. Inactivar por 30 minutos en baño maría (60°C– 63°C). Una vez inactivado realizar las siguientes diluciones del suero positivo con TV 1X: 1/150, 1/175, 1/200, 1/225, 1/250. 2. Se prepara en tubos las siguientes diluciones del antígeno Brucella ovis con TV 1X: 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640. Tabla 13. Distribución de los sueros controles y del antígeno Antígeno Sueros A C++ 1/150 B C++ 1/175 C C++ 1/200 D C++ 1/225 E C++ 1/250 F C- Neg. 1 2 3 4 5 6 7 8 1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/16 0 1/32 0 1/64 0 9 10 11 12 G H     Dispensar 25 µl de cada dilución del suero control positivo en el pocillo correspondiente según la tabla 1 (fila A a E), desde la columna 1 a la 8. Dispensar 25 µl del suero control negativo desde la fila F1 hasta F8. Distribuir 25 µl de la dilución de trabajo de complemento en los pocillos que contiene las diluciones de trabajo de suero control positivo y suero negativo. Agregar 25 µl de la dilución correspondiente de antígeno según la tabla 1. Página 39 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis Primera incubación en caliente   Cubrir y agitar las microplacas en agitador de placas durante 2 – 4 minutos. Incubar las microplacas a 37 ± 2°C durante 30 minutos. Agregado del sistema hemolítico  Finalizada la primera incubación, dispensar el sistema hemolítico a razón de 25 µl en todos los pocillos de la placa. Segunda incubación en caliente   Cubrir y agitar las microplacas en agitador de placas durante 2 – 4 minutos Incubar las microplacas a 37 ± 2°C durante 30 minutos. Centrifugación/reposo de la microplaca  Finalizada la incubación, centrifugar las microplacas a 2000 rpm durante 5 minutos o bien dejar en reposo durante una hora antes de su lectura en heladera. Lectura de la titulación El nuevo lote de antígeno debe presentar un título en el cual el suero control positivo arroja un resultado de ++ en 1:200 y negativo en 1:250, título que corresponde a 1000 UIFC/ml de suero. El suero negativo debe arrojar resultado negativo (100% de hemólisis). Página 40 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 3.4.6. ANEXO V Preparación de la escala visual para la interpretación de los resultados En un tubo de ensayo se coloca 1 ml de la suspensión de glóbulos rojos al 2% + 9ml de TV 1X. En otro tubo de ensayo colocar 1ml de la suspensión de glóbulos rojos al 2% + 7ml de agua destilada, agitar para provocar la completa hemólisis de los GR. (solución de hemoglobina), y agregarle 2ml de TV (5x) para mantener la presión osmótica. Estos dos tubos mantienen la misma relación de GR. intactos en el primer caso y de glóbulos lisados en el segundo, que el que el 0% de hemólisis y el 100% de hemólisis en la prueba. De esta manera mezclándolas en distintas proporciones podremos obtener la imagen que corresponde a los distintos grados de hemólisis, luego de centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm (Tabla 14). Tabla 14. PORCENTAJE DE HEMÓLISIS REACTIVOS EN µl 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Solución de hemoglobina 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Suspensión de glóbulos rojos 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Página 41 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 4. Enzimoinmunoensayo Indirecto (I ELISA) Se realizará siguiendo el protocolo de los kits comerciales validados y aprobados para el diagnóstico oficial de la brucelosis ovina con el valor de corte establecido por SENASA. El enzimoinmunoensayo (ELISA) es un método empleado habitualmente para la detección y/o cuantificación de sustancias, generalmente proteínas, que se encuentran en concentraciones muy bajas. El método combina la especificidad de unión de los anticuerpos con la amplificación de "señal" que brindan las reacciones catalizadas por enzimas. En la práctica clínica es la técnica inmunológica más empleada. Se utiliza para cuantificar, entre otras cosas, hormonas, marcadores tumorales, para determinar la presencia de antígenos microbianos y para la determinación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos totales o frente a algún antígeno en particular. ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: • 1. Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio (generalmente en los kits comerciales la placa ya está preparada con el antígeno pegado a la misma) 2. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. 3. Adición de los controles y sueros problemas, en la dilución indicada en el protocolo, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. 4. Incubación 5. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. •Es importante que la placa no se seque, lo que podría incrementar la actividad inespecífica del ensayo. 6. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. 7. Incubación 8. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. • 9. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 10. Frenado Página 42 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 11. Lectura colorimétrica del producto final coloreado. 4.1 Equipos:          Heladera con temperatura controlada (5 ±3 ºC) Freezer con temperatura controlada (-20 ±5 ºC) Vortex Centrífuga Timer Fotómetro de placas automático con filtros (405 nm, 414 nm, 450nm) Agitador orbital de placas Peachímetro (rango de 0 a 14 ± 0,01 pH). Lavador de placas 4.2 Materiales:             Micropipetas monocanal de volumen variable (0,5 a 10 µl, 5 a 50 µl, 50 a 200 µl y 200 a 1000 µl). Micropipetas multicanal de volumen variable (5 a 50 µl y 50 a 250µl). Dispensadores automáticos. Timer o reloj de laboratorio. Propipetas. Selladores de placas de acetato o parafilm. Cubetas plásticas para pipetas multicanales. Microtubos o microplacas (para realizar las diluciones previas de los sueros). Criotubos de polipropileno para el almacenamiento de los sueros. Gradillas. Material de vidrio (probetas, pipetas, erlenmeyers, etc. de distintos volúmenes). Toallas o papel absorbente. Modelo de Distribución de los sueros controles y muestras problemas en la placa de 96 pocillos B C D E F G H 1 C++ C++ C+ C+ CCCc Cc 2 1 1 2 2 3 3 4 4 3 5 5 4 9 9 5 13 13 6 17 17 7 21 21 8 25 25 9 29 29 10 33 33 11 37 37 12 41 41 44 44 Página 43 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis A continuación se citan algunas precauciones a tener en cuenta para ejecutar la técnica de Elisa:           Seguir expresamente las instrucciones del kit para la preparación de todos los reactivos Mantener los reactivos a temperatura ambiente antes de su utilización. No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes lotes o kits. Evitar cualquier contaminación de los reactivos. No utilizar los kits una vez superada la fecha de caducidad. Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra y reactivo a analizar. Incluir sistemáticamente un control positivo y un control negativo. Utilizar agua desionizada o destilada para la preparación/dilución de los reactivos que se empleen en el ensayo. Corroborar que el lector de placas posee el filtro con el cual se debe leer la placa y seguir las instrucciones de uso del equipo Se recomienda trabajar las muestras por duplicado, para verificar la repetibilidad del operador. Página 44 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 4.3 Guía de problemas y soluciones Señal Posible causa Solución Color irregular 1.Error de pipeteo 2.Falta de mezcla de reactivos 3.Falta de lavados Práctica Mejorar técnica Precaución No hay color 1. Se omitió el substrato 2. Errónea concent. Substrato 3. Substrato con pH erróneo 4. Conjugado muy diluido 5. Se omitió el conjugado Revisar Revisar Controlar pH Revisar Revisar 1. Conjugado muy concentrado 2. Falla en el lavado 3 Substrato contaminado Controlar Mejorar técnica Revisar 1. Reacción inespecífica 2. Material de vidrio sucio 3. Agua de mala calidad 4. Poco detergente (Tween 20) 5. Tampones contaminados Cambiar solución de lavado Mejorar lavado Controlar calidad Revisar Preparar soluciones nuevas 1. Substrato muy concentrado 2. Conjugado muy concentrado 3. Solución substrato con pH erróneo 4. Concent. Cromógeno errónea Revisar Controlar dilución Controlar Revisar 1. Substrato muy diluido 2. Conjugado muy diluido 3.Solución substrato con pH erróneo 4.Concentración Cromógeno errónea 5.Concent de Tween errónea Revisar Revisar dilución Revisar Revisar Revisar 1. Incubación despareja 2. Resecación por aire 3. Tampón de lavado residual Utilizar estufa Mantener la placa cubierta Eliminarlo Color parejo en toda la placa Elevado color de fondo “background” Desarrollo de color muy rápido Desarrollo de color muy lento Efecto borde Página 45 / 46 �Manual de Diagnóstico de Brucella ovis 5. REFERENCIAS  Alton, G.G.; Jones, L.M; Angus, R.D.; Verger, J.M. 1988. Serological methods. Techniques for the Brucellosis laboratory. Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France, pp. 157-167.  Blasco J.M. (1990). Brucella ovis. In: Animal Brucellosis, Nielsen K. & Duncan J.R., eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 351–378.  GALL D., NIELSEN K., VIGLIOCCO A., SMITH P., PEREZ B., ROJAS X. & ROBLES C. (2003). Evaluation of an indirect enzyme-linked immunoassay for presumptive serodiagnosis of Brucellaovis in sheep. Small Rumin. Res., 48, 173–179.  IstitutoZooprofilatticoSperimentaledell”Abruzzo e del Molise G. Caporale. Procedimiento IZS TE B2. 1.6 SOP 004 del Centro Internacional de Referencia OIE para Teramo. Italia  Nielsen K., Gall D., Kelly W., Vigliocco A, Henning D and Garcia M. (1996).Immunoassay Development. Aplication to Enzyme Immunoassay for the diagnosis of Brucellosis. ISBN 0662-24163-0. Agriculture and AgriFoodCanada.  Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres. 2009. Capítulo 2.7.9.SéptimaEdición. Volumen 2 SENASA, Manual de diagnóstico serológico para Brucelosis Bovina. 2009  VIGLIOCCO A.M., SILVA PAULO P.S., MESTRE J., BRIONES G.C., DRAGHI G., TOSSI M. & NIELSEN K. (1997). Development and validation of an indirect enzyme immunoassay for detection of ovine antibody to Brucella ovis. Vet. Microbiol., 54, 357–368. Página 46 / 46 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual de diagnóstico de Brucella ovis Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria. Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2015 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Dirección Nacional de Sanidad Animal Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0017 Abstract A summary of the resource. El presente Manual está dirigido a los Laboratorios veterinarios que realicen el diagnóstico serológico de la Brucelosis ovina. Contiene los requisitos técnicos necesarios para realizar las pruebas con caracter oficial. Las mencionadas técnicas son internacionalmente reconocidas y recomendadas por la OIE y SENASA. Table Of Contents A list of subunits of the resource. 1. Introducción 1.1 Etiología 1.2 Epidemiología 1.3 Patogenia 1.4 Manifestaciones clínicas 2. Diagnóstico de Laboratorio 2.1 Medidas Generales 2.2 Aseguramiento de la calidad 2.3 Control de calidad de insumos 2.4 Equipos 2.5 Registro de entrada de muestras 2.6 Características y condiciones de las muestras 2.6.1 Condiciones de recepción de las muestras 2.6.2 Condiciones de rechazo de las muestras 3. Diagnóstico de Brucella Ovis 3.1 Identificación del Agente 3.2 Pruebas serológicas 3.3 Inmunodifusión en gel de agar 3.4 Fijación de complemento 4. ELISA indirecto 4.1 Equipos 4.2 Materiales 4.3 Guía de problemas y soluciones 5. Referencias Enfermedades de los Ovinos Laboratorios https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/34ce43feeb86937bb632314deba34637.pdf df7160fe8f1c813f539a794f5df43494 PDF Text Text SENASA DIRECCION NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL (VNO) Abril de 2006 �VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL (VNO) Este trabajo está destinado a presentar una recopilación de la información disponible en el mundo sobre la enfermedad denominada VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL (VNO), que puede afectar a los animales y a los seres humanos, de reciente hallazgo y diagnóstico en nuestro país en 2 (dos) equinos nativos de la República Argentina. �VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL Sinonimia - Enfermedad del Oeste del Nilo (EON) Enfermedad del Nilo Occidental Encefalitis del Oeste del Nilo Fiebre del Nilo Occidental West Nile Fever (OIE) West Nile Encephalitis (OIE) �VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL Definición Es una enfermedad infecciosa aguda de origen viral, transmitida por mosquitos, que afecta principalmente a aves y que puede transmitirse a equinos y a seres humanos Características • Flavivirus del Complejo de la Encefalitis Japonesa. • Enfermedad Transmitida por Mosquitos Vectores. • Ciclo enzoótico. • Las aves silvestres son reservorio natural, infectando a mosquitos que infectan a su vez a los vertebrados. �VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL Etiología Familia: Flaviviridae Género: Flavivirus - virus RNA, cadena simple - sentido positivo - icosaédrico–envuelto (40-60 nm) - secuencia genómica total de 11.029 nucleótidos: Genoma viral: 5´ - 96 nucleótidos no codif. – 97 a 10.302 nucleótidos codif. (Proteínas estructurales: Cap, PrM, M, E; Proteínas no estructurales: NS1, NS2a / NS2b, NS3, NS4a / NS4b, y NS5)– 631 nucleótidos no codificantes – 3´ �Representación esquemática del VNO CDC Centers for Disease Control and Prevention �VNO: Micrografía Electrónica Fotografía cedida por CDC – U.S. Pergamino 2003 �Árbol filogenético del VNO Modificado de: Lanciotti et al. 1999. Origen del VNO responsable de un brote de encefalitis en el Noreste de los Estados Unidos [Science 286:2333-337.] �VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL Especies afectadas • • • • Aves Equinos Seres humanos Otros Mamíferos �Fuentes potenciales de ingreso del virus a un país/región ‹ ‹ Aves domésticas y/o silvestres infectadas. Mosquitos portadores en medios de transporte (terrestres, aéreos y/o acuáticas). �VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL Ciclo epidemiológico �VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL Factores predisponentes El VNO se presenta en forma endémica y epidémica. La lluvia intensa, la alta humedad relativa ambiente, los encharcamientos y las temperaturas elevadas conforman nichos ecológicos que facilitan la reproducción de mosquitos vectores. �VNO: Ciclo de Transmisión Huéspedes incidentales Virus Fotografía cedida por CDC – U.S. Pergamino 2003 �Criterios para calificar como vector del VNO Densidad poblacional suficiente ‹ Competente ‹ De vida larga ‹ Ornitofílico ‹ Foto: Dr. Steve Higgs �Fotografía cedida por CDC – U.S. Pergamino 2003 Culex pipiens ciclo de vida �1999 – 2000 Detección de VNO en EUA Aspirando mosquitos Culex mientras hibernan, Ciudad de New York, enerofebrero 2000 Fotografía cedida por CDC – U.S. Pergamino 2003 �Algunas especies de mosquitos de las cuales se aisló el virus en los EUA – Culex pipiens – Cx. pipiens/restuans – Cx. restuans/salinarius – Cx. pipiens/restuans/salinarius – Aedes vexans �Detalle sobre la distribución en la República Argentina de los distintos géneros y especies de mosquitos de importancia en Medicina Veterinaria y/ o Salud Pública, potenciales vectores del VNO (Culicidae : Diptera : Insecta). Sobre los trabajos de Sabattini, M.S., Monath, T.P., Mitchell, C.J. y col. 1985, Schweigmann, N. y Boffi, R., 2002 y Almirón, W.R. y col. 2002. Provincia de Santa Fe: Variación porcentual registrada en la estación de primavera: Culex (Culex) ....... 33,2 % Mansonia spp. ....... 30,6 % Variación porcentual registrada en la estación de verano: Culex (Culex) ....... 52,2 % Mansonia spp. ....... 44,5 % Variación porcentual registrada en la estación de otoño: Culex (Culex) ....... 64 % Anopheles spp. ....... 20 % Provincia de Corrientes: Variación porcentual registrada en la estación de otoño: Anopheles spp. ....... 28,8 % Mansonia spp. ....... 29,9 % Psorophora spp. ...... 25,8 % Culex (Culex) ...... 7,2 % Provincia del Chaco: Variación porcentual registrada en la estación de otoño: Culex (Culex) ....... 43,4 % Culex (Melanoconion) ....... 30,6 % Mansonia spp. ...... 29,8 % Anopheles spp. ...... 16,8 % �Detalle sobre la distribución en la República Argentina de los distintos géneros y especies de mosquitos de importancia en Medicina Veterinaria y/ o Salud Pública, potenciales vectores del VNO (cont.) Provincia de Buenos Aires: ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ Aedeomyia (Aedeomyia) Aedeomyia) squamipennisa Aedes (Stegomyia (Stegomyia)) aegyptia Anopheles (Nyssorhynchus) Nyssorhynchus) albitarsisa Anopheles (Nyssorhynchus) Nyssorhynchus) argyritarsis Anopheles (Nyssorhynchus (Nyssorhynchus)) triannulatus Culex (Culex) Culex) apicinus Culex (Culex) Culex) bidens Culex (Culex) Culex) brethesi Culex (Culex) Culex) chidesteri Culex (Culex) Culex) coronator Culex (Culex) Culex) dolosus Culex (Culex) Culex) hepperi Culex (Culex) Culex) lahillei Culex (Culex) Culex) maxi Culex (Culex) Culex) mollis Culex (Culex) Culex) pipiens (C. pipiens pipiens y C. pipiens quinquefasciatus) quinquefasciatus) Culex (Culex) Culex) spinosus Culex (Melanoconion) Melanoconion) intrincatus �Detalle sobre la distribución en la República Argentina de los distintos géneros y especies de mosquitos de importancia en Medicina Veterinaria y/ o Salud Pública, potenciales vectores del VNO (cont.) ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ Mansonia (Mansonia) indubitans Mansonia (Mansonia) titillans Ochlerotatus (Ochlerotatus) albifasciatusa Ochlerotatus (Ochlerotatus) scapularisa Psorophora (Grabhamia) confinnis Psorophora (Grabhamia) varinervis Psorophora (Janthinosoma) albipesa Psorophora (Janthinosoma) cyanescens Psorophora (Janthinosoma) discrucians Psorophora (Janthinosoma) feroxa Psorophora (Janthinosoma) varipes Psorophora (Psorophora) ciliata Psorophora (Psorophora) holmbergii Psorophora (Psorophora) pallescensa Uranotaenia (Uranotaenia) apicalis Uranotaenia (Uranotaenia) lowii Uranotaenia (Uranotaenia) natalie Uranotaenia (Uranotaenia) pulcherrima Wyeomyia (Menolepis) leucostigma �Criterios para calificar como Huéspedes Reservorios ‹ Expuestos ‹ Competentes ‹ Residentes �VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL Distribución geográfica mundial �Distribución geográfica de los flavivirus del complejo de la Encefalitis Japonesa (Situación hasta 1999) �Epidemias recientes de VNO en seres humanos • Rumania • Rep Checa • Rep del Congo • Rusia • Estados Unidos • Islas Caimán • Islas Bahamas • Canadá • México 1996 al 1997 (393 casos clínicos con una mortalidad del 4%) 1997 1998 1999 (500 casos clínicos con mortalidad del 6%) 1999 al 2006 2001 2003 2002 al 2005 2002 al 2004 �Epizootias recientes de VNO en equinos Marruecos Italia Francia Estados Unidos Canadá Belize Argentina 1996 (94 casos con mortalidad del 44%) 1998 (14 casos con mortalidad del 43%) 1998 -1999 - 2003 1999 al 2005 2002 2003 2006 �Serología positiva en Equinos en Centro y Sud América México ‹ Guadalupe ‹ Belize ‹ El Salvador ‹ Guatemala ‹ Trinidad ‹ Puerto Rico ‹ Colombia ‹ Cuba ‹ 2002 2002 2003 2003 2003 2004 2004 2005 2005 �Evolución de la enfermedad en los Estados Unidos �Virus del Nilo Occidental en los EUA (Año 2005 – Aves) Casos confirmados Sin datos Muestras remitidas Datos acumulados 2005 – (última actualización: Feb 14, 2006) Casos confirmados de infección en aves a nivel nacional: 5345 �Virus del Nilo Occidental en los EUA (Año 2005 – Mosquitos) Casos confirmados Sin datos Muestras remitidas Datos acumulados 2005 – (última actualización: Feb 14, 2006) Presencia en pooles de mosquitos a nivel nacional: 11485 �Virus del Nilo Occidental en los EUA (Año 2005 – Equinos) Casos confirmados Sin datos Datos acumulados 2005 – (última actualización: Feb 14, 2006) Casos confirmados de enfermedad en equinos a nivel nacional:1162 �Virus del Nilo Occidental en los EUA (Año 2005 – Humanos) Casos confirmados Sin datos Muestras remitidas Datos acumulados 2005 – (última actualización: Feb 14, 2006) Casos confirmados de enfermedad en humanos a nivel nacional: 2951 �Evolución del VNO en seres humanos en los Estados Unidos Año Nº Enfermos Nº Muertos 1999 62 7 2000 21 2 2001 66 9 2002 4156 284 2003 9862 264 2004 2539 100 2005 2949 116 Totales 19655 782 �Número de muestras positivas para VNO en México y Canadá 2001-2003 Mexico 2001 2002 2003 Equinos - 2 2088 Aves - - 112 Humanos - 1 6 2001 2002 2003 - 336 445 127 555 1633 - 198 1303 Canada Equinos Aves Humanos Hasta Noviembre 2003 – Fuente: MS Mexico y Canadá �Posible implicancia de las migraciones de aves Modelos probables de diseminación de la enfermedad atribuible a las aves migratorias �Gentileza Anibal Parera FVS Argentina �Probable ruta de diseminación del VNO en las Américas desde 1999 WN ? Modelo Rappole et. al 2000 �Patrones de migración de aves Estornino pinto Gaviota plateada Gaviotín golondrina from http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol6no4/rappole.htm. Figures adapted from Bull J. Birds of New York State. Garden City (NY): Doubleday; 1974. Rappole et. al 2000 �República Argentina Gentileza Anibal Parera FVS Argentina �ESPECIES DE AVES SILVESTRES MIGRATORIAS QUE ARRIBAN A LA PAMPA HÚ HÚMEDA 1) Procedentes de América del Norte (Canadá y EUA) con presencia estival (primavera-verano): ORDEN FALCONIFORMES a) Familia Accipitridae: – Aguila Pescadora (Pandion haliaetus) – Aguilucho langostero (Buteo swainsoni) b) Familia Falconidae: – Halcón peregrino (Falco peregrinus) ORDEN CHARADRIIFORMES a) Familia Charadriidae: – Chorlo pampa (Pluvialis dominica) b) Familia Scolopacidae: – – – – – – Pitotoy grande (Tringa melanoleuca) Pitotoy chico (Tringa flavipes) Pitotoy solitario (Tringa solitaria) Playerito pectoral (Calidris melanotos) Playerito unicolor (Calidris bairdii) Playerito blanco (Calidris alba) �ESPECIES DE AVES SILVESTRES MIGRATORIAS QUE ARRIBAN A LA PAMPA HÚ HÚMEDA (Cont.) – Playerito rabadilla blanca (Calidris fiscicollis) – Playerito manchado (Actitis macularia) – Becasa de mar (Limosa haemastica) – Playero trinador (Numenius phaeopus) c) Familia Phalaropodidae: – Falaropo común (Phalaropus tricolor) d) Familia Rynchopidae: – Rayador (Rynchops niger) e) Familia Sternidae: – Gaviotín negro (Chlidonias niger) ORDEN CAPRIMULGIFORMES Familia Caprimulgidae: – Añapero boreal (Chordeiles minor) ORDEN PASSERIFORMES Familia Hirundinidae: – Golondrina tijerita (Hirundo rustica) – Golondrina rabadilla canela (Petrochelidon pyrrhonota) – Golondrina zapadora (Riparia riparia) �ESPECIES DE AVES SILVESTRES MIGRATORIAS QUE ARRIBAN A LA PAMPA HÚ HÚMEDA (Cont.) 2) Procedentes de Norte y Centro de Sudamérica (Colombia, Brasil, Paraguay) con presencia estival (primaveraverano): ORDEN CUCULIFORMES Familia Cuculidae: – Cuclillo canela (Coccyzus melacoryphus) – Cuclillo chico (Coccyzus cinereus) ORDEN CAPRIMULGIFORMES Familia Caprimulgidae: – Atajacaminos tijera (Hydropsalis brasiliana) ORDEN PASSERIFORMES a) Familia Tyrannidae: – – – – – – – – Anambé común (Pachyramphus polychopterus) Benteveo rayado (Myiodynastes maculatus) Viudita blanca (Fluvicola pica) Churrinche (Pyrocephalus rubinus) Suirirí real (Tyrannus melancholicus) Tijereta (Tyrannus savana) Mosqueta estriada (Myiophobus fasciatus) Fiofío pico corto (Elaenia parvirostris) �ESPECIES DE AVES SILVESTRES MIGRATORIAS QUE ARRIBAN A LA PAMPA HÚ HÚMEDA (Cont.) b) Familia Hirundinidae: Hirundinidae: – – – – – Golondrina Golondrina Golondrina Golondrina Golondrina ceja blanca (Tachycineta leucorrhoa) patagónica (Tachycineta leucopyga) doméstica (Progne chalybea) negra (Progne modesta) parda (Phaeoprogne tapera) c) Familia Vireonidae: Vireonidae: – Chiví común (Vireo olivaceus) 3) Procedentes de Patagonia con presencia invernal (otoñ (otoño-invierno): ORDEN CHARADRIIFORMES a) Familia Charadriidae: Charadriidae: – Chorlito pecho canela (Zonibyx modestus) – Chorlito doble collar (Charadrius falcklandicus) �ESPECIES DE AVES SILVESTRES MIGRATORIAS QUE ARRIBAN A LA PAMPA HÚ HÚMEDA (Cont.) b) Familia Sternidae: – Gaviotín sudamericano (Sterna hirundinacea) ORDEN PASSERIFORMES a) Familia Furnaridae: – Remolinera común (Cinclodes fuscus) – Canastero coludo (Asthenes pyrrholeuca) b) Familia Phytotomidae: – Cortarramas (Phytotoma rutila) c) Familia Tyrannidae: – Sobrepuesto (Lessonia rufa) �VNO en la especie equina �VNO en la especie equina ‹ Período de incubación: 5 a 15 días. – Experimentalmente: 8 dí días. ‹ Mortalidad: variable según los países en los cuales se presentó, aunque se puede asumir 1 muerto de cada 3 clínicamente afectados (Datos de la Organización Mundial de Sanidad Animal OIE). �VNO en la especie equina No todos los caballos cursan con enfermedad clínica. Algunos pueden manifestar signos y la mayoría cursa con cuadros subclínicos En otros casos se presentan con formas graves (meningoencefalomielitis o encefalitis) y muerte. ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ Hipertermia (en el 24% de los casos). Depresió Depresión y debilidad Ataxia (en el 80% de los casos). Caminar en cí círculo. Tremores Dificultad para mantenerse en pie o incorporarse. Mono a tetraparesis y tetraplejí tetraplejía Fasciculació Fasciculación y rigidez muscular. Déficit propioceptivo. propioceptivo. Ceguera (en el 16% de los casos). Caí Caída o pará parálisis de los labios. Rechinar de dientes �VNO en la especie equina ‹ Cuadro histopatológico principal: – Polioencefalomielitis linfocitaria típica; lesiones bilaterales en sustancia gris de cuernos ventral y lateral de médula toracolumbar (área más afectada). �VNO: Incoordinación en equinos Patas cruzadas Fotos: Juan Lubroth, USDA Patas abiertas �VNO: Pedaleo en decúbito – equinos Fotografía cedida por CDC – U.S. Pergamino 2003 �Diagnóstico Diferencial en equinos* 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Mielopatías compresivas. Traumas. Intoxicaciones. Meningoencefalitis protozoaria equina (EPM) Leucoencefalomalacia. Rabia. Otras encefalitis virales: Encefalomielitis Equina del Este y Oeste, Encefalitis Japonesa, Encefalitis Equina Venezolana, Encefalitis de San Luis. 8. Herpesvirus equino 1. 9. Enfermedad de Borna. 10.Otras. * Alguna de las enfermedades citadas no presentes en la República Argentina �VNO en la especie aviar �Formas de presentación del VNO en aves Todas las especies aviares pueden ser afectadas por la enfermedad. • No todas las aves infectadas cursan con enfermedad clínica, constituyéndose en la mayoría de los casos como reservorios asintomáticos del virus. • Las aves domésticas jóvenes resultan ser más susceptibles a la enfermedad clínica que las adultas. • En cambio, las aves silvestres pueden ser susceptibles a la enfermedad clínica a cualquier edad. �Signos clínicos en aves ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ ‹ Depresió Depresión Debilidad Decú Decúbito Ataxia. Posició Posición anormal de cabeza y cuello Tremores Dificultad para volar. Movimientos en cí círculo Convulsiones Muerte Cuadro histopatoló histopatológico principal: principal: Meningoencefalitis linfocitaria �Diagnóstico de VNO en animales 1.- Identificación del agente a partir de muestras de cerebro, LCR, suero sanguíneo, riñón, bazo y corazón: • Aislamiento en cultivo celular (Vero, BHK) o en ratón lactante. • Diagnóstico molecular y clasificación genética: RT-nested PCR, hibridación in situ-D.N.A. probes, Secuenciación, Enzimas de restricción. • Inmunofluorescencia directa. • Inmunohistoquímica. • Microscopía electrónica • Inmunocromatografía (Vec Test). �Diagnóstico de VNO en animales (cont.) 2.- Diagnóstico serológico: – Seroneutralización (PRNTT). – Inhibición de la Hemoaglutinación. – ELISA: ‹ IgG. ‹ Captura de IgM. ‹ Blocking test. �PREVENCION DEL VNO: USO DE VACUNAS EN EQUINOS EN LOS EE UU Innovator® (Fort Dodge): programa vacunal con 2 dosis, separadas entre 3 a 6 semanas, con 1 refuerzo anual. ‹ Recombitek® (Merial): programa vacunal con 2 dosis, separadas entre 3 a 6 semanas, con 1 refuerzo anual. ‹ Respuesta de anticuerpos: no producen IgM; sólo anticuerpos neutralizantes después de la 2da. dosis. �Vacuna contra VNO para Seres Humanos y Aves ‹ Varios grupos (Reino Unido, Estados Unidos, China) están llevando a cabo investigaciones referidas a: – – – Vacunas a virus inactivado, inactivado, Virus Quimé Quiméricos (FA/ WNV), Vacunas a DNA ‹ Ensayos clínicos en un futuro cercano. ‹ Su utilidad en la población aún no es clara. �Impacto de la enfermedad sobre el intercambio de animales susceptibles Esta enfermedad puede ocasionar restricciones o la incorporación de exigencias sanitarias específicas por parte de países con distinta condición sanitaria para autorizar el ingreso de animales susceptibles a VNO. �Recomendaciones dadas por las autoridades sanitarias americanas para proteger contra el VNO a las personas que trabajan al aire libre (http:// www.cdc.gov//spanish/ http://www.cdc.gov spanish/niosh/ niosh/factfact-sheets/ sheets/factfact-sheetsheet-westNile2. westNile2.html) html) ‹ ‹ ‹ Evitar que los trabajadores permanezcan al aire libre durante el tiempo en el que los mosquitos son más activos y están picando, es decir, desde el atardecer hasta el amanecer. Poner repelentes de insectos a disposición de los trabajadores. Recomendar a los que trabajan al aire libre que usen camisas de manga larga, pantalones largos y medias cuando sea posible. �Recomendaciones dadas por las autoridades sanitarias americanas para proteger contra el VNO a las personas que trabajan al aire libre (http:// www.cdc.gov//spanish/ http://www.cdc.gov spanish/niosh/ niosh/factfact-sheets/ sheets/factfact-sheetsheet-westNile2. westNile2.html) html) (cont.) ‹ Eliminar tantos sitios de agua estancada como sea posible a fin de disminuir las poblaciones de mosquitos. El agua que dura estancada por más de cuatro días provee un sitio para que los mosquitos se reproduzcan. – Cambiar el agua dos veces por semana en los bebederos para animales, aves y cualquier otro recipiente que contenga agua. – Colocar un aparato de aireación en los estanques y jardines de agua para mantener el agua circulando o poner peces que se coman las larvas y los mosquitos adultos. �Recomendaciones dadas por las autoridades sanitarias americanas para proteger contra el VNO a las personas que trabajan al aire libre (http:// www.cdc.gov//spanish/ http://www.cdc.gov spanish/niosh/ niosh/factfact-sheets/ sheets/factfact-sheetsheet-westNile2. westNile2.html) html) (cont.) – Retirar las cubiertas de auto descartadas del sitio de trabajo. – Poner boca abajo, cubrir o retirar equipos como cobertores, baldes, barriles, carretillas y recipientes a fin de evitar la acumulación de agua. – Colocar aberturas de drenaje en los recipientes en los que se acumule el agua y que no puedan ser descartados. – Limpiar las canaletas de desagüe. – Retirar con frecuencia deshechos como hojas, ramas y basuras de las zanjas. – Rellenar o vaciar los surcos y otras áreas que acumulen agua. �El SENASA se encuentra coordinando con otros Organismos, Entidades y Autoridades Competentes tanto del quehacer Nacional como Provincial, las acciones tendientes a la prevención y control del VNO en seres humanos y animales susceptibles de la República Argentina, lo que podrá ser consultado en las respectivas páginas web. �FIN DE LA PRESENTACIÓN � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Virus del Nilo Occidental (VNO) Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2006 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Dirección Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0035 Abstract A summary of the resource. Este trabajo está destinado a presentar una recopilación de la información disponible en el mundo sobre la enfermedad denominada VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL (VNO), que puede afectar a los animales y a los seres humanos, de reciente hallazgo y diagnóstico en nuestro país en 2 (dos) equinos nativos de la República Argentina. https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/532c91e7da7e8a3960b4455c14b1f51a.pdf 45927513c980086b9a38b9b19603234a PDF Text Text ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 Manual de Procedimientos Arteritis Viral Equina Prefacio: El presente manual de procedimientos fue redactado por la Dirección de Luchas Sanitarias, a cargo del Dr. Marcelo de la Sota y el Programa de Enfermedades de los Equinos a cargo del Dr. Raúl González, el mismo cuenta con la revisión de la Comisión Nacional de Enfermedades de los Equinos Finalidad El presente manual se dirige principalmente a los Veterinarios Acreditados, privados, sectores interesados en la producción equina y a las autoridades provinciales, municipales y nacionales locales encargadas de las acciones sanitarias contra la AVE; por tanto, se centra en los principios de la enfermedad, descripción, aplicaciones de las pruebas de laboratorio, en la evaluación de sus resultados, atención de sospechas, focos y casos de infección. Arteritis Viral Equina Características La arteritis viral equina(AVE) es una enfermedad vírica general y febril de los équidos. A pesar de su elevada morbilidad, exhibe una baja mortalidad (inferior al 5%). El plazo de incubación es de 3-14 días. La OIE determina que el período de infecciosidad de la arteritis viral equina es de 28 días para las yeguas y los caballos castrados Esta enfermedad reviste especial importancia en las yeguadas, puesto que en ellas pueden abortar hasta el 80% de todas las yeguas gestantes del efectivo. Sin embargo, predominan generalmente los cursos latentes, con apariciones esporádicas de la enfermedad en animales aislados. Presentación El virus está presumiblemente muy difundido. Se ha informado sobre la existencia de casos en USA, Europa (salvo Alemania, Checoslovaquia, Hungría, Rumania y Bulgaria), India y algunos países africanos. Japón y Australia se consideran libres de esta enfermedad. En Argentina, sobre fines de 1997 se comienza a realizar la contraprueba serológica de equinos y material reproductivo importados, y en abril de 1998 se detecta un semen importado positivo, lo que derivó en la destrucción del mismo y la intervención oficial de los dos haras de destino involucrados. En octubre de 1998, ingresan tres padrillos importados certificados negativos en origen, resultando en las contrapruebas uno de ellos positivo serológico. Se 1 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 interviene oficialmente, el establecimiento - único afectado en todo el país - fue interdictado y puesto bajo saneamiento oficial. En este contexto, tres padrillos de este establecimiento fueron confirmados por prueba biológica como eliminadores y fueron retirados de la actividad reproductiva. Como resultado de la investigación epidemiológica se estableció que el posible ingreso del virus al establecimiento se produjo a través de un equino importado en el año 1997 que fue incorporado al plantel de sementales. El virus es aislado en diciembre de 2001 del semen conservado de uno de los padrillos eliminadores. La enfermedad solo ha sido detectada en un número reducido de establecimientos y solo pudo confirmarse en ellos hallazgos serológicos sin síntomas reproductivos ni respiratorios Sintomatología Sus síntomas principales son: apatía, conjuntivitis, flujo ocular y nasal seroso, edema en el bajo vientre y extremidades, y aborto en las yeguas gestantes. Estos síntomas se asemejan a los de la rinoneumonitis, si bien aparecen más marcados en el animal afectado La AVE cursa generalmente en forma benigna, con poca o ninguna fiebre, evoluciona espontáneamente sin dejar secuelas y deja inmunidad duradera: el equino que enfermó una vez ya no vuelve a contagiarse. En razón de los síntomas leves es común que pase desapercibida en animales a campo e incluso raramente se diagnostica en equinos bajo cuidados intensivos, los síntomas desaparecen en menos de 2 semanas. La enfermedad preocupa pues puede tener consecuencias graves para la reproducción: si una yegua enferma contagia a sus congéneres preñadas éstas pueden abortar. Fue justamente por esta grave complicación que la arteritis viral fue descubierta y definida en USA: ocurrieron “tormentas de abortos” en haras de trotadores americanos y luego de SPC y en ellos se aisló e identificó al virus causante, responsable de los abortos. No siempre la infección de la yegua preñada produce abortos, y cuando se producen, generalmente ocurren en yeguas que tienen 3 a 10 meses de preñez. En nuestro país, en los haras en los que se registraron hallazgos serológicos no se registraron descensos en el porcentaje de potrillos nacidos. En Europa tampoco acusan tener abortos atribuibles al virus de la AVE; tampoco en Norte América el virus produce siempre abortos. Diagnóstico Atendiendo a las manifestaciones clínicas, la AVE puede diferenciarse bastante 2 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 bien de las afecciones respiratorias de origen vírico que afectan al caballo (entre otros signos, son patognomónicos los edemas de párpados y extremidades), pero sólo con dificultad de la forma abortiva de la rinoneumonitis. Por ello, el diagnóstico de «arteritis infecciosa» del caballo se considera únicamente asegurado cuando se evidencia la presencia del virus causal, el cual es vertido al exterior con las secreciones serosas durante las fases agudas de la enfermedad. La arteritis viral se diagnostica con facilidad en el laboratorio con la prueba de seroneutralización que puede determinar si un animal ha tenido contacto con el virus. Esta prueba mide la presencia de anticuerpos contra el virus, que son justamente los que producen la protección contra una nueva infección. Así, si el caballo se contagió y curó, queda positivo en esa prueba, posiblemente para toda la vida, y él título de anticuerpos queda alto y constante; lo que significa que el equino está inmune y no volverá a enfermar. Si está recién contagiado y se hace una prueba antes del contagio que resulta negativa, pero 2 o más semanas después se hace positiva, el animal ha enfermado recientemente; por esto cuando se importan caballos éstos deben permanecer 3 semanas en el lazareto, para descartar que se hayan contagiado poco antes del viaje. En países endémicos, si el animal fue vacunado, la prueba arroja resultado positivo, pero él título es generalmente más bajo y puede descender con el tiempo si no se lo revacuna. Un padrillo serológicamente positivo puede ser portador o no. Si lo es, esto debe saberse antes de que sirva a una sola yegua y la contagie y, a través de ella, a muchos caballos más: esto se determina fácilmente buscando la presencia del virus en el semen, por PCR o aislamiento del virus o por medio de una prueba biológica, o sea, dando servicio a dos yeguas con serología negativa y repitiendo la prueba serológica 3 o 4 semanas después en esas yeguas: si siguen siendo negativas, significa que no se infectaron porque el padrillo no elimina virus en el semen. Los brotes de AVE que se producen en un haras a partir de uno o más servicios de un padrillo portador y eliminador, muchas veces desaparecen y se extinguen por si solos en poco tiempo. Etiología El virus RNA de la AVE antes se lo clasificaba como Togaviridae, ahora como Orden Nidovirales, Familia arteriviridae, Género arterivirus. Este virus parece ser serológicamente uniforme y genéticamente estable. Exhibe sólo escasa resistencia frente a las influencias ambientales y es sensible a todos los desinfectantes comerciales ordinarios. Algunas de las cepas de virus que actúan son más agresivas que otras. 3 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 Reservorios del virus: El virus causal de la AVE está muy adaptado a los équidos y tiene su reservorio exclusivamente en las poblaciones hospedadoras infectadas. Por ello, la principal fuente de contagio es el caballo excretor de virus. Transmisión: La transmisión se produce únicamente por contacto directo (luchas por establecer el dominio del grupo; coito) y aerógeno (infección por gotitas). Los insectos hematófagos no son capaces de transmitir las altas dosis necesarias para que se produzca el contagio, por lo que carecen de significación en el proceso epizoótico de la AVE. Los brotes de AVE se producen porque la enfermedad se transmite por vía aérea como otras enfermedades respiratorias, es decir de un animal a otro con el cual convive y a veces, indirectamente, con los que comparte bebederos, comederos, embocaduras, camas, caballerizo u otros elementos; la infección se transmite durante el periodo de incubación y de enfermedad clínica. De esta manera, una yegua que ha sido servida por un padrillo eliminador puede contagiar a todos los animales de la manada, incluyendo potrillos y potrancas, y también puede contagiar a animales de lotes vecinos o a caballos de trabajo o incluso en training. Esta es la forma en que una yegua puede contagiar a un padrillo, si, por ejemplo, se echa en una manada con padrillo, una yegua que ha sido servida poco tiempo antes por un padrillo portador y que tiene la enfermedad activa en el momento de entrar a la manada. Es decir, si un padrillo contagia a una yegua, ésta puede contagiar a todos los equinos del establecimiento, de cualquier edad o sexo, sin que medie acto sexual alguno. Población hospedadora: Son susceptibles los équidos de todas las edades y sexos. Tanto la superación de la enfermedad como las infecciones latentes generan una sólida inmunidad de varios años de duración, que incluso puede persistir toda la vida. Esta inmunidad protege frente a una nueva enfermedad, pero no garantiza que los animales convalecientes estén exentos de virus. Estado de portador En los padrillos que enferman luego de la pubertad (es decir, de un año o más de edad), el virus puede quedarse acantonado y viable en las glándulas sexuales accesorias, eliminarse con el semen y contagiar así a una yegua durante el servicio; es decir, el padrillo se convierte en un portador sano y puede contagiar, pero sólo por el acto sexual y solamente a las yeguas que no han padecido la enfermedad anteriormente. 4 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 En razón de lo anterior, se la considera una enfermedad venérea, pero no lo es realmente en todo el sentido etimológico de la palabra ya que la hembra no contagia al macho por el acto sexual. Nunca se encontró virus persistente en las yeguas, ni en los machos castrados o los machos enteros que se contagiaron antes de la madurez sexual. No todos los machos serológicamente positivos, es decir que se contagiaron y curaron, son necesariamente eliminadores. Por de pronto, la persistencia del virus depende de la presencia de testosterona, hormona que produce el testículo a partir de la pubertad, por lo que los potrillos que enferman antes del año de edad no se convierten normalmente en portadores. Entre los machos enteros que enferman después de la pubertad, mas del 40 o 60 % de ellos no quedan como portadores; no se ha demostrado hasta ahora que un padrillo que no elimina virus enseguida después de la enfermedad lo elimine un tiempo después, pero no se puede estar absolutamente seguro de que esto sea así. Un padrillo portador elimina cantidades muy grandes de virus en cada eyaculación y contagia al menos al 85% de las yeguas que sirve, salvo que sean inmunes. Pese a que puede haber ligeras variaciones en la cantidad de virus que se elimina según la época del año, un padrillo-portador contagia durante todo el año. Además, el virus de la AVE resiste el congelamiento: el semen congelado de un padrillo portador contagia tanto como el semen fresco. Se ha discutido sobre si los padrillos que si eliminan virus inmediatamente después del contagio pueden llegar a hacerse no infectantes con el tiempo. Si bien se demostró que algunos padrillos eliminan virus por un período muy corto, otros lo hacen permanentemente durante toda la vida por lo que hasta tanto existan más pruebas al respecto todo padrillo positivo debe considerarse de riesgo. Yeguas Positivas Las yeguas positivas, ya sean importadas o provenientes de otro predio, significa que han enfermado y curado y por lo tanto no se va a volver a infectar, ni siquiera si la sirve un padrillo portador y no va a contagiar a un padrillo sano ni a sus compañeras de manada. Estas son las yeguas que se utilizan en países endémicos para hacer servir con padrillos portadores sanos. Tampoco debemos tener miedo a su potrillo, aunque sea hijo de una madre positiva o de un padrillo portador: el contagio “in útero” es rarísimo. Si hemos enviado una yegua a servicio a un haras o a un centro de inseminación en el que luego se detectó un brote, sí debemos tomar precauciones a su regreso, en realidad son las precauciones que deberíamos tornar con todos los animales que ingresan o reingresan a un predio, cualquiera 5 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 fuera su origen, efectuando una cuarentena con él o los equinos aislados en un corral o piquete propio y realizando doble prueba serológica con dos semanas de intervalo entre ellas para verificar paridad o descenso de títulos entre ambas. Las yeguas negativas, que provienen de un haras en el cual sospechamos que puede haber virus activo o latente son las más peligrosas. A estas debemos exigirle una cuarentena con dos pruebas separadas por dos semanas, en que la segunda no tenga un título mayor que la primera. Cuando en los casos descriptos, el título esta subiendo, quiere decir que la yegua se contagió recientemente. Entonces hay que esperar otras dos semanas, repetiendo hasta que se estabilice el título, lo que nos asegura que ya está curada y que no va a contagiar más. Es decir que ante cualquier sospecha debemos actuar como se hace con los caballos que se importan: si son negativos, dos pruebas separadas por 15 días, ambas negativas. Si son positivos, una segunda prueba, que debe dar un resultado igual o menor que el primero, lo que nos asegura la curación e inmunidad del animal. Prevención y lucha Cuando se producen movimientos de caballos deportivos o reproductores que van más allá de las fronteras, los efectivos equinos libres de AVE se ven especialmente amenazados por animales con la infección latente. Por ello, la finalidad de las medidas de lucha contra la AVE es reducir sobre todo el riesgo de que se introduzca el virus en la población, así como aislar de manera inmediata y radical cualquier brote de AVE que se produzca. La República Argentina está en condiciones de sostener el sistema de declaración obligatoria y monitoreo permanente y de garantizar a sus países compradores la ausencia de riesgo sanitario para lo cual se cumple con la aplicación de las medidas previstas en los artículos 3.4.10.2 y 3.4.10.3 del Capítulo 3.4.10, parte 3, del Código Zoosanitario Internacional (ver más adelante). Medidas a adoptar en los brotes de arteritis infecciosa Cuando aparezcan manifestaciones clínicas que permiten sospechar la existencia de AVE, se aislará de inmediato el efectivo y se procurará aclarar el diagnóstico por procedimientos anatomopatológicos, virológicos y serológicos. Debido a la baja contagiosidad de la AVE, al contrario de lo que sucede en la influenza A y en la rinoneumonitis, resulta conveniente en todos los casos efectuar rápidamente el aislamiento de los caballos enfermos y de los animales que estuvieron en contacto inmediato con ellos. La limpieza y desinfección a fondo de las cuadras ocupadas por los équidos enfermos, acompañadas de una desinfección intermedia diaria en la zona de aislamiento, evitan la difusión del virus en el seno del establecimiento. El grupo 6 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 de animales aislados será cuidado por personal independiente. Reduciendo al mínimo los esfuerzos corporales del núcleo de caballos enfermos, creando unas condiciones ambientales óptimas y adoptando medidas generales de higiene veterinaria, pueden disminuirse tanto la predisposición y exposición de la fracción no enferma de la población, llegándose a un momento en el que ya no aparecen más casos. El secuestro de los efectivos y el aislamiento de los animales convalecientes sólo pueden levantarse como mínimo 6 semanas después de desaparecer la fiebre en el último caso clínico. No obstante lo dicho, dependiendo del número de animales, el manejo, la cercanía entre lotes, las oportunidades de infección entre grupos de diferentes edades o sexos y, por sobre todo, del movimiento interno de animales en el haras, el virus puede ir pasando lentamente entre individuos o grupos de individuos y quedar activo en el campo durante un tiempo más o menos prolongado. Para evitar esto, cuando hubo un brote, lo mejor es, a. realizar una primera prueba serológica en todos los equinos del predio dentro de un plazo no mayor a 30 días corridos, b. de acuerdo a lo hallado separar los animales en grupos de positivos y negativos y c. impedir en este período todo movimiento interno de equinos, no sólo de los que entran o salen, sino de los grupos entre ellos y de un potrero a otro. Si después de seis semanas, se realizan nuevos estudios serológicos en los animales previamente negativos y no ha aparecido un caso nuevo, es decir ninguno de los negativos se hizo positivo, es posible que el virus haya desaparecido. La única manera de asegurarse de que un brote se ha extinguido definitivamente en un campo, es controlar serológicamente en forma repetida a los animales y asegurarse de que no están apareciendo casos nuevos. Hay que controlar a todos los animales, especialmente a todos los machos, nacidos o criados en el haras, hasta asegurarse de que no hay casos nuevos, y eliminar constantemente a los machos enteros positivos. Acciones preventivas 9 Conozca la enfermedad. Sepa qué es la AVE y como se transmite. Se dará cuenta que puede ser fácilmente controlada si se toman ciertas precauciones y se actúa con seriedad y honestidad. 9 Manténgase informado: averigüe cuáles son los haras o establecimientos en los que hay o hubo virus activo y si se ha eliminado el brote o no. 9 Realice controles periódicos entre sus animales. 9 Controle anualmente sus padrillos antes de dar el primer servicio de la temporada, aunque SENASA sólo lo exige al presentar la declaración de servicios. 9 No use ninguna partida de semen importado que no haya sido debidamente controlada por SENASA. 7 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 9 Recuerde que un padrillo positivo contagia a las hembras por vía sexual, pero la enfermedad se disemina después por vía aérea. Qué hacer si quiere servir su yegua con un padrillo de otro haras. Debe asegurarse no sólo de que el padrillo sea negativo sino también de que ese haras no tuvo nunca un brote de AVE o que, si lo ha tenido, éste a sido perfectamente controlado y no siguen apareciendo animales positivos. Si se tienen dudas, y si tiene la infraestructura necesaria, puede adquirirse el semen del padrillo que interesa y realizar la inseminación artificial en el campo, pero previamente debe realizarse una prueba biológica con el semen adquirido dando servicio a dos yeguas con serología negativa y repitiendo la prueba serológica 4 semanas después en esas yeguas que deberán seguir siendo negativas. Que hacer si quiere enviar su yegua a un centro de inseminación o transferencia. Estos centros ponen en contacto a muchas yeguas y pueden ser el origen de la diseminación de la enfermedad. Debe asegurarse de que en ese centro no utilicen semen de padrillos positivos ni vayan yeguas provenientes de un haras con virus activo. De todas maneras, al volver del centro se mantendrá aislada y se le realizarán dos pruebas serológicas separadas por 14 días. Si ambas son negativas o con títulos iguales o decrecientes se puede juntar la yegua con sus compañeras. Si la segunda tiene un título más alto que la primera, se dejará la yegua aislada y se realizarán nuevos controles hasta que el título no suba más. Qué hacer si le envían yeguas a servir a su haras. Si la yegua tiene un resultado positivo en un análisis que tenga más de un mes de realizado no existe riesgo sanitario. Esta yegua ya enfermó y curó y no va a volver a enfermar ni va a contagiar a otras yeguas ni al padrillo del establecimiento. Ante la duda, se solicitará un segundo análisis, el que debe mostrar titulo igual o menor que el primero. Si la yegua es negativa a una sola prueba, en todos los casos se debe exigir una segunda prueba separada por 15 días y confirmar que sigue siendo negativa. Medidas ante la sospecha de infección (hallazgo de serología) 9 Notificar al veterinario local de la Dirección Nacional de Sanidad Animal 9 Interdicción del predio. 9 Inmovilizar la totalidad de los equinos dentro del predio, aislar a los padrillos de todos los otros caballos, machos o hembras. 9 Realizar el control serológico del total de los animales. 9 Efectuar la correspondiente investigación epidemiológica. 8 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 Procedimiento y Acciones Se indican los procedimientos y acciones que deberán llevarse a cabo ante la detección de un equino positivo serológico a la AVE: 1) INTERDICCIÓN preventiva del establecimiento bajo acta, con estricta prohibición de todo tipo de ingresos y egresos de equinos. 2) PADRILLOS: La totalidad de los padrillos serán sangrados oficialmente de inmediato (dos muestras de suero por animal con intervalo mínimo de 14 días) y los sueros remitidos exclusivamente al Laboratorio de SENASA. Los positivos serológicos (a una prueba y cualquier título), serán retirados de su actividad reproductiva y sometidos dentro de los 30 días a una prueba biológica (servicio a dos yeguas seronegativas con tomas de muestras antes y a los 28 días del servicio) ó de PCR en semen. 3) RELEVAMIENTO Y ENCUESTA: a) IDENTIFICACIÓN: Todas las existencias equinas deberán estar identificadas o identificarse de manera fehaciente, debiendo controlarse periódicamente la existencia total y las filiaciones (en forma aleatoria) mientras dure la interdicción. b) ORIGEN DE LOS INDIVIDUOS: el propietario o responsable a cargo, deberá proveer información de cada equino residente respecto de: I. El origen de cada equino (nacido en el establecimiento o en su defecto procedencia y año de ingreso). II. Si es producto de servicio natural (aclarar: padrillo propio o de terceros) o de inseminación artificial (en este caso, si el semen: nacional o importado). III. Identificación del padre o dador seminal. c) MOVIMIENTOS realizados en los últimos 6 (SEIS) meses: Se informará, los ingresos y egresos registrados en la oficina local si los hubiere y los que declare el propietario o responsable. d) ANTECEDENTES SANITARIOS: recabar información sobre cualquier registro de casos clínicos en los últimos 6 (seis) meses (con particular atención en antecedentes de cuadros respiratorios o reproductivos). De constatarse signos/síntomas, se deberá tomar contacto con los laboratorios habilitados para la adecuada remisión de muestras específicas (tejidos fetales, hisopados, etc.). 4) FIN DE LA INTERDICCIÓN: Se basará en los resultados de un doble sangrado de la totalidad de los equinos en el cual no se registre ningún caso de seroconversión. El momento para la recolección de los sueros será planificada por el propietario y deberá ser realizada dentro de un período de 30 días corridos (con 15 días de diferencia entre extracciones) y ambos análisis efectuarse en un mismo laboratorio habilitado a elección del propietario. Estas pruebas serán cargo del propietario. Las extracciones y la remisión de las muestras serán fiscalizadas oficialmente. 9 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 Obtenidos los resultados, la Oficina local los remitirá a la Dirección de Luchas Sanitarias quien comunicará el fin de la interdicción si corresponde. 4) EGRESOS OCASIONALES: hasta tanto se cumpla con la condición anterior y durante el tiempo que dure la interdicción, solo se autorizarán egresos de equinos lo que se hará bajo las siguientes pautas: a) Solicitud por escrito a la Oficina Local con treinta días de anticipación expresando los motivos, la que deberá ser autorizada por la Dirección de Luchas Sanitarias. b) Autorizado el egreso, se deberá expedir una Certificación conjunta del veterinario oficial y del veterinario responsable del establecimiento en laque conste: I. Aislamiento riguroso de los equinos. Para esto se asignará un corral/ potrero situado a más de 100 metros para realizar la cuarentena. II. Que el lote cumplió en forma efectiva con un período mínimo de aislamiento de 30 días, período dentro del cual fueron extraídas las dos muestras de suero por equino (con intervalo mínimo de 14 días) para diagnóstico de Arteritis Viral. III. Que no han manifestado ningún signo / síntoma de enfermedad infecto contagiosa, en los últimos 30 días los equinos del lote IV. Que la curva térmica individual, se mantuvo dentro de parámetros fisiológicos normales y fue realizada diariamente durante 14 días previos al despacho V. Ningún equino de la totalidad del lote presentó incrementos de títulos mayores a 2 (dos) diluciones en ambas pruebas. VI. En caso de ser padrillos solo podrán egresar con resultado negativo en ambas pruebas. Laboratorios Habilitados Para Arteritis Viral Equina: Laboratorio SENASA, Virología: Tel 4836-0062/1114, Fax 4836-1995/0065 e-mail: dilab@inea.com.ar. Contacto: Dra. Mónica Ayerbe. 2) INTA – Castelar: Tel 4621-1447, Fax 4621-1743 Contacto: Dra. María Barrandeguy. Area de Virología. e-mail: mbarrandeguy@cicv.inta.gov.ar 3) FCV de la Universidad de La Plata, Virología: Tel 0221-4236664, Fax 0221/-4253276. Contacto: Dr. Edgardo Nosetto. e-mail: nosetto@fcv.medvet.unlp.edu.ar 4) CEVAN – CONICET: Tel 4856-4495, Fax 4856-4495. e-mail: jltcevan@datamar.com.ar. Contacto: Dra. Marcela Iglesias. 10 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 Legislación aplicable: RESOLUCIÓN SENASA N° 434/01 BUENOS AIRES, 2 de octubre de 2001 VISTO el expediente Nº 10597/2001 del registro del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, y CONSIDERANDO: Que por el mencionado expediente la Dirección Nacional de Sanidad Animal propicia la continuación y adopción de nuevas acciones de Vigilancia Epidemiológica y Monitoreo Epidemiológico Permanente, con respecto a la Arteritis Viral Equina. Que oportunamente se cumplimentó lo dispuesto por la Resolución Nº 603 del 10 de junio de 1999 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, efectuada en equinos machos enteros y sólo sobre algunas razas. Que está comprobado epidemiologicamente que los padrillos actúan como portadores asintomáticos y que, en esta condición, son la principal fuente de diseminación de la enfermedad. Que los resultados del relevamiento serológico efectuado, determinaron la inexistencia de reactores en el grupo testeado, pero que aún persiste la probabilidad de ingreso del virus de la Arteritis Viral Equina al país, como así también que otros padrillos importados podrían haber estado naturalmente expuestos. Que la Comisión Nacional de Sanidad Equina, a través de sus representantes, ha manifestado preocupación y ha solicitado la continuación de las acciones de Vigilancia Epidemiológica activa, incluyendo un amplio y detallado diagnóstico de situación, que complemente lo ya actuado al respecto. Que la Dirección de Asuntos Jurídicos ha tomado la intervención que le compete. Que la Comisión Nacional de Sanidad Equina, creada por Resolución Nº 80 del 19 de enero de 1999 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, se ha expresado favorablemente sobre el particular. Que corresponde en consecuencia dictar las normas que permitan continuar el conjunto de acciones iniciadas que propendan al cumplimento del objetivo citado en el primer considerando. Que el suscripto es competente para resolver en esta instancia de conformidad 11 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 con las atribuciones conferidas por el artículo 8º, inciso e) del Decreto Nº 1585 de fecha 19 de diciembre de 1996, modificado por su similar Decreto Nº 394 del 1º de abril de 2001. Por ello, EL PRESIDENTE DEL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA RESUELVE: ARTICULO 1º - Las entidades privadas responsables del registro de las distintas razas equinas, exigirán a las personas físicas o jurídicas, responsables o propietarias de padrillos o su material seminal, sea éste de equinos nativos o semen importado, el diagnóstico de laboratorio que acredite el resultado negativo a una prueba de seroneutralización a la enfermedad "Arteritis Viral Equina", como condición previa al registro anual de servicios. ARTICULO 2º - En los casos en que un padrillo dador del material seminal resultara positivo a la prueba de seroneutralización y, a efectos de comprobar que no elimina el virus de la Arteritis Viral Equina por semen, se realizará bajo supervisión oficial una prueba biológica consistente en el servicio (natural o artificial) de DOS (2) yeguas con resultado negativo a la prueba de seroneutralización, en las que se deberá observar igual título serológico en los resultados de las pruebas efectuadas a los VEINTIOCHO (28) días de servidas o inseminadas. ARTICULO 3º - Si el servicio que se registra fuera realizado con semen importado ingresado al país con anterioridad al 31 de diciembre de 1997 o proviene de padrillos nativos fallecidos, se efectuará la prueba biológica en los términos descriptos en el artículo precedente. ARTICULO 4º - La remisión de muestras de suero o semen a los laboratorios, se efectuará en el formulario que, como Anexo, forma parte de la presente resolución. En el formulario y a título de Declaración Jurada, certificarán con su firma, sello aclaratorio y número de matrícula, tanto el profesional veterinario que extrajo la muestra, como el laboratorista que certifica el resultado diagnóstico y, asimismo el propietario o responsable del equino, dando fe de los datos consignados. ARTICULO 5º - Los únicos laboratorios habilitados para realizar las pruebas de seroneutralización serán los expresamente autorizados por la Dirección de Laboratorios y Control Técnico de este Servicio Nacional, para el diagnóstico específico de esta enfermedad. ARTICULO 6º - Los responsables de los laboratorios remitirán a la Dirección Nacional de Sanidad Animal del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, las copias de las certificaciones emitidas con resultado negativo en forma mensual, mientras que los diagnósticos positivos que eventualmente surjan deberán ser notificados en forma fehaciente, a la 12 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 misma dependencia oficial, dentro de las SETENTA Y DOS (72) horas subsiguientes a su hallazgo. ARTICULO 7º - Los padrillos que resulten positivos a la prueba de eliminación de virus por semen, serán retirados de la actividad reproductiva, pudiendo el propietario optar por el sacrificio o castración y, de tratarse de material seminal infectante, se procederá a la destrucción de la totalidad de las existencias del mismo. Estas acciones, de corresponder, serán llevadas a cabo bajo la supervisión y registro de personal afectado al SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA. ARTICULO 8º - El incumplimiento de las obligaciones emergentes de las normas establecidas en la presente resolución, será pasible de las sanciones previstas en el artículo 18 del Decreto Nº 1585 del 19 de diciembre de 1996 y concordantes. ARTICULO 9º - La presente resolución entrará en vigencia a partir de su publicación en el Boletín Oficial. ARTICULO 10. - Comuníquese, publíquese, dése a la Dirección Nacional del Registro Oficial y archívese. Bernardo G. Cané RESOLUCION Nº 434/01 13 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 Código Zoosanitario Internacional - OIE: CAPÍTULO 2.5.10. ARTERITIS VIRAL EQUINA Artículo 2.5.10.1. El período de infecciosidad de la arteritis viral equina es de 28 días para las yeguas y los caballos castrados. Se comprobará la condición sanitaria de los sementales seropositivos para cerciorarse de que no segregan el virus de la arteritis viral equina con el semen. Las normas para las pruebas de diagnóstico y las vacunas están descritas en el Manual. Artículo 2.5.10.2. Las Administraciones Veterinarias de los países importadores deberán exigir: para los équidos machos no castrados importados temporalmente para la reproducción o importados definitivamente la presentación de un certificado veterinario internacional en el que conste que los animales: 1. no presentaron ningún signo clínico de arteritis viral equina el día del embarque ni durante los 28 días anteriores al embarque; 2. resultaron negativos a dos pruebas de diagnóstico para la detección de la arteritis viral equina efectuadas durante los 28 días anteriores al embarque a partir de muestras sanguíneas que se tomaron con más de 14 días de intervalo, o 3. resultaron negativos a una prueba de diagnóstico para la detección de la arteritis viral equina efectuada a partir de una muestra sanguínea que se tomó entre los 6 y los 12 meses de edad, y fueron inmediatamente vacunados contra la enfermedad y revacunados periódicamente, o 4. resultaron positivos a una prueba de diagnóstico para la detección de la arteritis viral equina y: a) fueron acoplados a dos yeguas que resultaron negativas a dos pruebas de diagnóstico efectuadas a partir de muestras sanguíneas; la primera muestra sanguínea se tomó el día de la monta y la segunda 28 días después, b) o su semen, tomado durante los 28 días anteriores al 14 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 embarque, resultó negativo a una prueba de aislamiento del virus (actualmente en estudio). Artículo 2.5.10.3. Las Administraciones Veterinarias de los países importadores deberán exigir: para los équidos machos no castrados importados temporalmente para fines distintos de la reproducción, y para équidos que no sean machos no castrados la presentación de un certificado veterinario internacional en el que conste que los animales: 1. no presentaron ningún signo clínico de arteritis viral equina el día del embarque ni durante los 28 días anteriores al embarque; 2. presentaron ausencia de anticuerpos o estabilidad o disminución de los títulos de anticuerpos en dos pruebas de diagnóstico efectuadas durante los 28 días anteriores al embarque a partir de muestras sanguíneas que se tomaron con más de 14 días de intervalo; 3. resultaron negativos a una prueba de diagnóstico para la detección de la arteritis viral equina efectuada a partir de una muestra sanguínea que se tomó entre los 6 y los 12 meses de edad, y fueron inmediatamente vacunados contra la enfermedad y revacunados periódicamente. Artículo 2.5.10.4. Las Administraciones Veterinarias de los países importadores deberán exigir: para el semen fresco la presentación de un certificado veterinario internacional en el que conste que los sementales: 1. permanecieron, durante los 30 días anteriores a la toma del semen, en una explotación en la que ningún équido presentó signos clínicos de arteritis viral equina durante ese período; 2. no presentaron ningún signo clínico de arteritis viral equina el día de la toma del semen; 3. resultaron negativos a una prueba de diagnóstico para la detección de la arteritis viral equina efectuada a partir de una muestra sanguínea que se tomó entre los 6 y los 12 meses de edad, y fueron inmediatamente vacunados contra la enfermedad y revacunados periódicamente, o 4. resultaron negativos a una prueba de diagnóstico para la detección 15 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 de la arteritis viral equina efectuada durante los 14 días anteriores a la toma del semen a partir de una muestra sanguínea y no fueron utilizados para la monta natural entre el momento de la toma de sangre y el de la toma del semen, o 5. resultaron positivos a una prueba de diagnóstico para la detección de la arteritis viral equina, y: a) fueron acoplados, durante el año anterior a la toma del semen, a dos yeguas que resultaron negativas a dos pruebas de diagnóstico efectuadas a partir de muestras sanguíneas; la primera muestra sanguínea se tomó el día de la monta y la segunda 28 días después, b) o su semen, tomado durante el año anterior a la toma del semen destinado a la exportación, resultó negativo a una prueba de aislamiento del virus (actualmente en estudio). Artículo 2.5.10.5. Las Administraciones Veterinarias de los países importadores deberán exigir: para el semen congelado la presentación de un certificado veterinario internacional en el que conste que los sementales: 1. no presentaron ningún signo clínico de arteritis viral equina el día de toma del semen; 2. resultaron negativos a una prueba de diagnóstico para la detección de la arteritis viral equina efectuada a partir de una muestra sanguínea que se tomó más de 14 días después de la toma del semen, o 3. resultaron negativos a una prueba de diagnóstico para la detección de la arteritis viral equina efectuada a partir de una muestra sanguínea que se tomó entre los 6 y los 12 meses de edad, y fueron inmediatamente vacunados contra la enfermedad y revacunados periódicamente, o 4. resultaron positivos a una prueba de diagnóstico para la detección de la arteritis viral equina y: a) fueron acoplados, durante el año anterior a la toma del semen o lo antes posible después de dicha toma, a dos yeguas que resultaron negativas a dos pruebas de diagnóstico efectuadas a partir de muestras sanguíneas; la primera muestra sanguínea se tomó el día de la monta y la segunda 28 días 16 �ARTERITIS VIRAL EQUINA. MARZO 2003 después, b) o su semen, tomado durante el año anterior a la toma del semen destinado a la exportación, o el mismo semen destinado a la exportación, resultó negativo a una prueba de aislamiento del virus (actualmente en estudio). 17 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual de Procedimientos Arteritis Viral Equina Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2003 Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0036 Abstract A summary of the resource. El presente manual se dirige principalmente a los veterinarios acreditados, privados, sectores interesados en la producción equina y a las autoridades provinciales, municipales y nacionales locales encargadas de las acciones sanitarias contra la AVE; por tanto, se centra en los principios de la enfermedad, descripción, aplicaciones de las pruebas de laboratorio, en la evaluación de sus resultados, atención de sospechas, focos y casos de afección. Enfermedades de los Equinos https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/70656b7ede7d51131f0603b30a0adf00.pdf 0821478bcb5ba41106b667c26d4b40da PDF Text Text �Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Manual de Procedimientos para la ANEMIA INFECCIOSA EQUINA (AIE) Dr. Marcelo Daniel de la Sota Dirección de Luchas Sanitarias �SENASA Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Av. Paseo Colón 367 C1063ACD Ciudad de Buenos Aires - República Argentina tel. (054) (011) 4331-6041 al 49 y lineas rotativas. website: http://www.senasa.gov.ar Coordinación General Dr. Marcelo D. de la Sota (Dirección Nacional de Sanidad Animal) email.: mdelasot@senasa.gov.ar Responsables de los Contenidos Dr. Marcelo D. de la Sota (Dirección de Luchas Sanitarias) Dr. Raul J. Gonzalez (Programa Enfermedades Equinas) Edición: Lic. Cristina del Llano (Coordinación de Gestión Técnica) Armado y diagramación: Area de Diseño Gráfico. Buenos Aires, agosto de 2005 4 Dirección de Luchas Sanitarias �AUTORIDADES Dr. Jorge Néstor AMAYA Presidente Ing. Carlos CASAMIQUELA Vicepresidente Dr. Jorge Horacio DILLON Director Nacional de Sanidad Animal Dr. Marcelo Daniel de la SOTA Director de Luchas Sanitarias Dr. José Luis ANTONELLI Coordinador General de Campo Manual de Procedimientos de Anemia Infecciosa Equina 5 �INDICE FINALIDAD ........................................................................................................................................................... 11 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA (AIE) .......................................... 13 1. Consideraciones Generales ......................................................................................................................... 13 1.1 Importancia económica ....................................................................................................................... 14 2. Etiología ........................................................................................................................................................ 14 3. Descripción ................................................................................................................................................... 15 4. Formas de presentación clinica .................................................................................................................... 15 5. Transmisión de la enfermedad ...................................................................................................................... 16 6. 7. 8. 9. 5.1 Transmisión natural .............................................................................................................................. 16 5.2 Transmisión por el hombre .................................................................................................................. 17 5.3 Otras vías de transmisión .................................................................................................................... 17 Diagnóstico de Laboratorio ........................................................................................................................... 18 6.1 Periodo de ventana para la detección de la enfermedad por medio del test ...................................... 18 6.2 Precisión de los tests diagnósticos y divergencias más frecuentes. ................................................... 18 Proceso Epizoótico ....................................................................................................................................... 19 7.1 Reservorios del virus ........................................................................................................................... 19 7.2 Población hospedadora ....................................................................................................................... 19 Medidas de Prevención y control .................................................................................................................. 20 8.1 Aplicación de las medidas de control y prevención. ............................................................................ 20 8.2 Medidas protectoras en territorios limpios (Países o regiones de países) .......................................... 20 8.3 Medidas en territorios con la enfermedad enzoótica ........................................................................... 21 8.4 Medidas a adoptar ante brotes o hallazgos de reactores positivos al test .......................................... 21 8.5 Procedimientos en predios rurales ...................................................................................................... 22 8.6 Medidas para los ingresos ................................................................................................................... 22 8.7 Procedimientos en los eventos hípicos ............................................................................................... 22 8.8 Procedimientos en los remates ferias .................................................................................................. 23 8.9 Desinfección ........................................................................................................................................ 23 Diagnóstico y Certificación: Procedimientos ............................................................................................... 23 9.1 Extracción y remisión de la muestra .................................................................................................... 23 9.2 Recepción de las muestras ................................................................................................................. 24 9.3 Tiempo de validez de las certificaciones ............................................................................................. 24 10. Procedimiento para la denuncia ................................................................................................................... 24 11. Eliminación de los reactores ......................................................................................................................... 25 REGLAMENTO SANITARIO EQUINO - Res. SAGP y A N° 617/05 .................................................................... 27 �Prefacio El presente manual de procedimientos fue redactado por la Dirección de Luchas Sanitarias, a cargo del Dr. Marcelo de la Sota y el Programa de Enfermedades de los Equidos a cargo del Dr. Raúl González. El mismo cuenta con la revisión de la Comisión Nacional de Enfermedades de los Equinos. �Finalidad El presente manual se dirige principalmente a los Veterinarios privados, sectores interesados en la producción equina y actividades hípicas, y particularmente a vastos sectores rurales que estando cultural y tradicionalmente tan cerca del caballo quedan a veces tan lejos de los conocimientos más elementales para proteger su salud. También va dirigido a las autoridades nacionales, provinciales y municipales locales igualmente responsables y encargadas de emprender acciones sanitarias contra la AIE. En su desarrollo, se pretende reavivar el debate acerca de cual fue el aprendizaje y cuales fueron los defectos u omisiones en el intento de controlar la AIE desde siempre, puntualizando aquello que está al alcance de todos y cada uno para controlarla en todo el país. Seguramente se reiterarán conceptos y se desmitificarán algunas creencias populares sobre la enfermedad que a lo largo de los años sumaron confusión y produjeron alarmas exageradas en aquellos que se enfrentaron o vuelven a enfrentarse con esta enfermedad. Por tanto, centraremos su contenido en los principios de la enfermedad, descripción, pruebas de laboratorio, evaluación de sus resultados, medidas preventivas, atención de sospechas, focos y casos de infección. 11 �Manual de Procedimientos para la ANEMIA INFECCIOSA EQUINA (AIE) 1. Consideraciones Generales Esta enfermedad se encuentra incorporada mediante el Decreto Nº 991 de fecha 14 de marzo de 1969, al grupo de enfermedades a que refiere el artículo 6º del Reglamento General de Policía Sanitaria. Por lo tanto son de aplicación todas las regulaciones previstas en la Ley Nº 3959 de Policía Sanitaria de los animales y su decreto reglamentario, lo que incluye la denuncia obligatoria, la interdicción preventiva ante la presencia de casos y la eliminación de portadores de acuerdo al articulado de las normas específicas para la Anemia Infecciosa. Lo referente a la notificación, vigilancia y seguimiento epidemiológico, análisis de riesgo y emergencias sanitarias, así como los procedimientos que contemplan los aspectos de protección y lucha contra esta enfermedad y los diferentes niveles de responsabilidad de los distintos actores en la misma, se encuentran establecidos en las Resoluciones SENASA N° 422/03 y SAGPyA N° 617/05. Manual de Procedimientos de Anemia Infecciosa Equina 13 �En el país, a pesar de la existencia de normativas oficiales para su control y del esfuerzo colectivo desarrollado por varios sectores en los últimos 35 años, la AIE ha constituido un enigma para muchos propietarios y productores, adquiriendo importancia no solo en relación a pérdidas directas sino también a las limitaciones, necesariamente estrictas, que imponen las exportaciones y el sostenido tráfico del comercio caballar y las actividades ecuestres. Las diferencias en la prevalencia e incidencia de esta enfermedad dependen de diversos factores, como la región geográfica y sus ecosistemas, la densidad de población de équidos y su dinámica regional, también del nivel socio cultural de sus propietarios y consecuentemente la asistencia sanitaria y profesional de los equinos y por ende del conocimiento o no de la enfermedad, muy en especial de las formas de transmisión. Pero básicamente, el cumplimiento responsable de las medidas de prevención y control, ya sean estas las impuestas por la autoridad sanitaria oficial o simplemente las de propia incumbencia y responsabilidad del propietario son definitorias. La morbilidad y la mortalidad vienen determinadas preferentemente por la sensibilidad de la población, es decir, que en los territorios con la enfermedad enzoótica (presente en forma marcada y permanente) predominan los cursos crónicos y latentes, mientras que en regiones limpias o de baja prevalencia pueden prevalecer los cursos graves sobretodo en los primeros brotes de esta enfermedad, tal como aconteció a fines de la década del 60. 1.1 Importancia económica En general, existe la creencia que solo los grandes brotes de enfermedades de los animales, con registros de alta mortalidad, acompañados de cuadros clínicos claros y manifiestos son los que originan cuantiosas pérdidas económicas. La Anemia Infecciosa Equina, en su forma más frecuente de presentación crónica e inaparente, es un claro ejemplo de enfermedad de presentación «poco visible» para el productor, lo que hace posible que, a través de su diseminación insidiosa, solapada y permanente, genere pérdidas regionales por millones de dólares anuales sin que cada productor en particular registre tal magnitud. Esto se expresa mediante el permanente reemplazo y reposición de equinos de trabajo que propone esta enfermedad, y que es lo que provoca tales mermas productivas. Según un estudio realizado en Santa Fe a comienzos de los años 90, en el centro y este de la región ubicada al norte del paralelo 32, el desplazamiento de bovinos provocado por la superpoblación de equinos de trabajo portadores de esta enfermedad – para el cálculo fue considerado que por su bajo rendimiento se requieren para cumplir tareas rurales de dos a tres equinos por uno – era equivalente a 40-50 millones de dólares anuales medidos en kilos de carne bovina. En esta línea de análisis, si bien no existen antecedentes de ponderación económica similares a lo descripto, debiera tomarse en cuenta que en todo nuestro territorio nacional, el equino es aún hoy una herramienta insustituible, no solo formando parte de la cadena de recolección y distribución de una gran variedad de productos pecuarios y agrícolas primarios que de otra forma no llegarían luego a ser bienes contabilizables en el mercado, o al menos lo harían generando mayores costos - sino también en relevantes tareas tales como el control de fronteras o las relacionadas con el desarrollo sociocultural de numerosas poblaciones rurales en las cuales el caballo garantiza la asistencia sanitaria y educativa de sus pobladores. 2. Etiología El virus RNA de la anemia infecciosa pertenece a la familia Retro viridae, incluyéndose entre los llamados lentivirus, caracterizados por una alta tasa de mutación, que por estar genéticamente relacionado con el virus de HIV-SIDA, ha sido motivo de muchas investigaciones en el campo de la medicina humana en los últimos años, en el intento de conocer más en 14 �profundidad aspectos de la estructura molecular y el mecanismo de replicación de estos virus. Se conoce que algunas cepas de AIE matan rápidamente, mientras que otras inducen una enfermedad crónica severa, pero es sabido también que muchas cepas de campo de la actualidad, inducen muy pobres o ausentes signos clínicos de enfermedad tornando compleja su detección si no se recurre a análisis de laboratorio. No obstante, es imperioso asumir que todas las cepas de AIE tienen el potencial genético para enfermar, independientemente que la enfermedad se manifieste clínicamente o no. 3. Descripción La AIE es una enfermedad infecciosa producida por un virus que es exclusiva de caballos, asnos y mulas, de amplia difusión en todo el mundo, que no tiene cura ni vacuna preventiva, caracterizada por una variedad de síntomas relacionados a la anemia, que termina invariablemente en la muerte del animal. La duración del plazo de incubación (tiempo que transcurre entre el ingreso del virus y la aparición de síntomas) es variable, de 5 a 30 días y en oportunidades hasta varios meses. Esto depende ante todo de la cantidad y calidad de la dosis infectante, si bien esto no ejerce ninguna influencia sobre el nivel de gravedad y el posterior curso clínico seguido por la enfermedad. El curso dependerá más de la predisposición y respuesta inmunitaria del animal infectado que de factores debilitadores de la resistencia. Una vez infectado, el equino es portador del virus por el resto de su vida. 4. Formas de presentación clinica Un equino infectado puede evidenciar una de las cuatro siguientes formas: a. Sobreaguda: presentación no frecuente. Es una presentación de infección en la cual el animal muere súbitamente antes de presentar signos clínicos. Solo es detectable posmortem (mediante necropsia y análisis de laboratorio). b. Aguda: Sus síntomas principales son fiebre alta e intermitente, incremento de la frecuencia del pulso, apatía, incoordinación en algunos casos, mucosas de tonalidad entre roja sucia e ictérica (amarillenta) con hemorragias difusas, edemas subcutáneos, y pérdida de condición corporal pese a conservar el apetito. En esta forma el nivel de virus en sangre es muy alto por lo que podrá ser transmitido más fácilmente a otros caballos como se verá más adelante. c. Subaguda a crónica: se mantienen los mismos signos clínicos descriptos para la forma aguda pero de una manera más atenuada, pudiendo ocurrir la muerte del animal luego de una corta agudización de los signos. El equino infectado entra y sale de esta forma clínica hacia la forma aguda o crónica de manera cíclica, presentando períodos de normalidad - la forma inaparente - entre episodios. Este comportamiento cíclico, generalmente dilata la consulta profesional y la imprescindible confirmación del laboratorio; si bien la detección de algún síntoma, como la pérdida de peso y la apatía debieran provocar siempre la sospecha. Los equinos que se encuentran en esta etapa tienen generalmente un nivel más moderado de virus circulante pero constituyen igualmente muy buena fuente de virus. 15 �d. Subclínica o inaparente: solo detectable por medio del test de laboratorio aplicado rutinariamente, es otra forma de presentación muy frecuente de la enfermedad. En esta etapa el caballo luce sano y nadie advierte su enfermedad pudiendo mantenerse así gran parte de su vida. Otros en cambio, regresan a la forma subaguda a crónica a causa de estrés, excesivo trabajo, a otras enfermedades o a parasitosis, a ciertas medicaciones como los corticoides o por la reversión del virus a formas más dañinas dentro del propio organismo del equino. Como conclusión, la forma crónica y la inaparente, con sus «señales» pobres o ausentes, constituyen el verdadero desafío para el control de la enfermedad por constituir el único y verdadero reservorio y fuente de virus para la persistencia de la enfermedad en los rodeos y su propagación territorial. 5. Transmisión de la enfermedad La AIE no es una enfermedad contagiosa, sino una enfermedad infecciosa transmisible. El uso poco preciso de los términos contagiosa o infecciosa, conduce a veces a un exagerado temor a la infección y a la enfermedad y a la justificación de que todo lo que se haga es en vano. Al contrario de lo que muchas veces se cree, y a excepción de la vía intrauterina, la transmisión del virus no se produce por transmisión directa (contagio) de un animal infectado a otro susceptible o sano. Para que el ingreso del virus a un animal sano se produzca, es indispensable que se vehiculice sangre desde un portador en forma mecánica. Desde esta óptica, puede afirmarse entonces que si se controlaran las vías más comunes de vehiculización, la enfermedad es altamente controlable. Las principales vías de transmisión mecánica a las que referimos son básicamente dos, la transmisión natural producida a través de algunas especies de insectos hematófagos y la que provoca la mano del hombre. 5.1 Transmisión natural Se ha comprobado fehacientemente que los distintos tipos de tábanos y moscas «chupadoras» de sangre son transmisores mecánicos del virus. Algunos investigadores citan la probabilidad de que algunas especies de mosquitos lo hagan - en particular los de gran tamaño - pero en menor grado y siempre de manera mecánica. Para que esta forma de transmisión sea posible, es preciso que el acto alimentario del insecto, iniciado sobre un equino portador del virus, quede incompleto por algún motivo (p.e. defensas del animal) debiendo entonces concluir su comida sobre otro equino sano. Según pudo comprobarse, el virus va perdiendo su capacidad infectante en la boca de estos insectos sobreviviendo en ella entre 15 minutos a 4 horas. Por lo tanto, la probabilidad y el grado de transmisión son altos cuando en una población de equinos se dan simultáneamente estas tres condiciones: 16 1. alta carga de tabánidos sobre el lugar (región, época del año, etc.), 2. distancias estrechas entre los equinos (factor que adquiere mucha importancia en lugares de estabulación o de alta concentración), y 3. un nivel infectivo suficiente en la sangre de el/los portador/es, que como fuera dicho es muy alto cuando se presentan síntomas clínicos. Dirección de Luchas Sanitarias �5.2 Transmisión por el hombre Se afirma que el virus puede sobrevivir varios meses a temperatura ambiente en sangre o suero secos infectados. Esta es la razón para afirmar que involuntariamente la mano del hombre es en muchos casos la principal forma de diseminación, y para ello bastará la presencia de tan solo un portador de virus para iniciar una diseminación masiva dentro de un establecimiento. A nivel rural, entre los elementos de uso común con riesgo cierto de vehiculizar el virus, se citan los frenos, espolines, mordazas, cinchas, sudaderas, rasquetas y demás elementos relacionados al equino, cuando sin una buena higiene y desinfección previa, son compartidos por distintos equinos. Es así como estos enseres tan familiares y conocidos para el hombre de a caballo, se transforman en «armas» sanitariamente peligrosas. Son igualmente considerados de alto riesgo, la omisión de cambio de aguja al efectuar tratamientos, vacunaciones o desparasitaciones colectivas, extracciones de sangre y/o las esterilizaciones o desinfecciones imperfectas de agujas, jeringas, sondas gástricas y todo tipo de instrumentos o material punzo cortante utilizado en maniobras quirúrgicas, odontológicas, terapéuticas (infiltraciones), diagnósticas, de identificación (tatuajes), etc... También está descripto en algunos trabajos, que los saches o frascos multidosis (vacunas, vitaminas, terapéuticos, etc.), al ser compartidos por más de un caballo están expuestos a quedar contaminados con el virus, siendo una excelente vía de diseminación. En definitiva, todo aquello que pueda vehiculizar sangre infectada de un portador enfermo (aún estando seca, en la cual según algunos autores el virus persiste varios meses) a un receptor sano, debe ser considerado de alto riesgo. El Servicio Oficial de los Estados Unidos concluye al respecto: «No existe una base científica que justifique el miedo de adquirir la AIE a partir de reactores positivos conocidos, cuando el predio o lugar en donde estos equinos se cuarentenan, respeta 200 yardas (180 metros) de distancia respecto del resto de equinos sanos», agregando «La probabilidad de diseminar y adquirir el virus cuando se mezclan en un predio equinos no testeados (sin diagnóstico de laboratorio), aún cuando solo exista un infectado entre 10.000, es significativamente mayor - probablemente más de un millón de veces - que la proveniente de equinos positivos bien cuarentenados.» En esto reside la importancia de conocer el estado serológico de toda la población mediante un test periódico. 5.3 Otras vías de transmisión En niveles menos frecuentes, se describe la transmisión del virus desde la yegua infectada al potro, aún cuando este aspecto no está absolutamente claro si el contagio tiene lugar por vía intrauterina o post partum a través de la leche materna. También se contempla la posibilidad de contagio por medio del coito, puesto que se ha conseguido la transmisión experimental del virus mediante inyección subcutánea de esperma de un semental enfermo con signos clínicos. Por ser eliminado el virus con excreciones y secreciones, algunos consideran posible la transmisión oral al beber agua o pienso infectados, si bien esta circunstancia únicamente desempeñaría un papel importante si se acompaña de la existencia de microlesiones en la boca o en el tracto digestivo del receptor susceptible que actuarían como puerta de entrada a dosis infectantes suficientes. Manual de Procedimientos de Anemia Infecciosa Equina 17 �6. Diagnóstico de Laboratorio. El cuadro clínico de la enfermedad es como vimos muy variable pero al menos permite la sospecha en muchos casos. Por este motivo, ante la presencia de cuadros febriles, incremento de la frecuencia del pulso, apatía, pérdida de condición corporal aún con apetito conservado, resulta imprescindible la práctica del test diagnóstico específico para descartarla y para esto se han propuesto distintos tests serológicos para la identificación de anticuerpos ya que la detección de los mismos indican invariablemente que ese animal tomo contacto con el virus, en consecuencia ha contraído la enfermedad. La Organización Internacional de Epizootias (OIE) recomienda hasta hoy como método diagnóstico de elección la prueba de inmunodifusión en gel de agar (ID), desarrollada por Leroy Coggins en 1972, por ser la única prueba que descubre con máxima seguridad a los portadores de virus sin manifestaciones clínicas. Este test solo puede ser realizado por laboratoristas de la Red Oficial de Laboratorios para lo cual los técnicos son entrenados y evaluados periódicamente en su competencia para integrar la misma. La lista y ubicación geográfica de estos laboratorios con la nómina de los profesionales autorizados a extender certificaciones, es actualizada y difundida bimestralmente por el servicio oficial para conocimiento de los usuarios. En la actualidad existen otras pruebas (Tests de ELISA) con ventajas y desventajas respecto del Test de Coggins (ID), no obstante sigue siendo éste último el requerido para las campañas oficiales en los diversos países y para el comercio internacional. Si el resultado del test de Coggins es claramente positivo en los équidos adultos, el diagnóstico se considera confirmado, independientemente de la ausencia o existencia de signos clínicos y de cuál sea la gravedad de los mismos, y aun cuando existan indicios presuntivos de estarse desarrollando además otras patologías no infecciosas. 6.1 Periodo de ventana para la detección de la enfermedad por medio del test El llamado efecto «ventana» de una enfermedad es el período comprendido entre el momento en que se produce la infección o ingreso del virus al organismo y la probabilidad cierta de que el test diagnóstico de laboratorio detecte los anticuerpos como para dar un resultado positivo, confirmando de esta forma la condición de portador. Este período es para la AIE de 1 a 3 o más meses. En razón de lo dicho, es que para confirmar un diagnóstico negativo, se recomienda que siempre se ratifique esa condición mediante otra prueba efectuada a los 60 días de la primera, sobretodo cuando se incorporan nuevos equinos a una población controlada. Es decir que antes de incorporarlos definitivamente al predio, se los mantenga separados del resto de la población residente hasta conocer el resultado de esta prueba confirmatoria. Durante este período se pondrá especial cuidado en prevenir las formas potenciales de transmisión vistas arriba. Esta particularidad de la enfermedad también explica porque en la reglamentación para los controles de tránsito y de ingreso y permanencia a concentraciones, se haya adoptado el plazo de 60 días como el período aceptable dentro del cual todo equino, que se traslada o que asiste o permanece en lugares de alta concentración, debe estar certificado con resultado negativo por un laboratorio habilitado por el SENASA. De esta forma se apunta a minimizar el riesgo y la probabilidad de diseminación a través de los portadores. 6.2 Precisión de los tests diagnósticos y divergencias más frecuentes. No siempre en el laboratorio pueden obtenerse resultados precisos. Algunas veces ocurren discordancias como resultado de diferencias de test a test, por ejemplo: entre la técnica de ID y la de ELISA, de un laboratorio a otro, de lectura a lectura usando el mismo método y 18 �realizándolo en el mismo laboratorio, o entre dos muestras de un mismo animal. Esto puede suceder en presencia de muestras de sangre que están cerca del límite técnico que tienen las pruebas en si mismas para poder detectar los anticuerpos, a diferencias relacionadas a un fenómeno biológico o simplemente a diferencias en el desempeño humano. La razón biológica de divergencia más frecuente es que el equino en cuestión tenga muy bajos niveles de anticuerpos contra el virus de AIE. El equino puede haber estado recientemente expuesto y recién está comenzando a producir anticuerpos. Otras veces, los portadores inaparentes tienen un nivel consistentemente bajo de anticuerpos contra el virus de AIE, lo que sugiere un bajo nivel de replicación viral y una baja estimulación. Afortunadamente, este tipo de reacciones se observan en muy baja proporción, pero en ambos casos el resultado final es el mismo: el nivel de anticuerpos es tan bajo que la reacción de la prueba escapa a la detección de algunos de los tests de rutina o es de difícil o débil lectura. La presentación de resultados débilmente positivos en el test de Coggins pueden presentarse: 1. En potros sanos que vehiculizan todavía anticuerpos maternos persistentes. Un segundo análisis realizado 2 meses después del destete arrojará resultado claramente negativo. 2. En équidos infectados que están aún en período de incubación. En este caso el segundo análisis efectuado 30-60 días después arrojará resultado claramente positivo. 3. En animales con la infección latente. El segundo análisis da por lo regular el mismo resultado débilmente positivo. En el procesamiento del test y en el reporte de resultados, pueden ocurrir errores humanos en múltiples aspectos. Primero, podría haber ocurrido un error técnico en el procesamiento de la muestra. Por ejemplo, en el test de ID, errores en la preparación del agar y placas y el uso de sacabocados más pequeños que los recomendados, o el lavado de los «wells» para ELISA, pueden dar resultados incorrectos. Segundo, el técnico puede sentirse incómodo o poco dispuesto para interpretar y reportar como positiva una muestra con una reacción a la ID muy débil. Tercero, puede ocurrir una pérdida en la integridad de la muestra por contaminación o mal rotulado. No obstante lo dicho, las falsas reacciones negativas en el test de AIE son extremadamente raras y además puede afirmarse que el impacto de estos equinos diagnosticados como falsos negativos es considerado significativamente bajo con respecto a los cientos de miles que nunca han sido testeados. 7. Proceso Epizoótico 7.1 Reservorios del virus El virus está muy adaptado a los équidos y tiene como reservorio única y exclusivamente a las poblaciones equinas infectadas. Independientemente de que la enfermedad se manifieste clínicamente o no, está presente en todo portador del virus - por tanto positivo al test siendo de esta forma una potencial fuente de diseminación por las vías de transmisión vistas. 7.2 Población hospedadora El hecho de que en los territorios enzoóticos, casos con la forma aguda se presenten con menor frecuencia que la enfermedad latente o inaparente, no puede atribuirse, por consiguiente, a la falsa creencia de que un gran número de animales superaron la enfermedad. 19 �Todos los solípedos son igualmente susceptibles, independientemente de cuál sea su especie, raza, edad o sexo. Una vez infectado el animal susceptible, en virtud de la persistencia típica de este lentivirus, el équido, a pesar de generar anticuerpos, se convierte en un portador de virus por el resto de su vida. En la infección natural, tanto en la enfermedad clínica como en la latente, los anticuerpos formados no garantizan ninguna protección inmunitaria, por lo que los animales infectados pueden enfermar gravemente y morir al cabo de meses o años, tras largos períodos asintomáticos. Por esto, hasta el presente, no ha sido posible disponer de una vacuna eficaz, ni de una terapia efectiva. 8. Medidas de Prevención y control Vistas las características de la enfermedad, todas las medidas preventivas y de lucha y control que se aplican en los distintos países del mundo, se concentran en: a) La detección de los portadores mediante el test diagnóstico de laboratorio. b) La eliminación de los mismos, mediante sacrificio o envío a faena. El objetivo de lo expresado es evitar la difusión territorial del virus y el incremento de equinos portadores. El sostenimiento de este sistema, permite en algunos casos y regiones que, en condiciones ecológicas favorables y con la participación responsable y activa de todos los actores ligados al caballo y al ámbito rural y ecuestre, pueda ser controlado o erradicado paulatinamente. Si bien son conceptualmente iguales, las medidas de prevención pueden ser modificadas según se hable de países o regiones libres de la enfermedad, o de territorios con presencia enzoótica de la misma, pudiéndose en éstos territorios diferenciar a su vez zonas o regiones según el nivel de prevalencia de la enfermedad. 8.1 Aplicación de las medidas de control y prevención. Puede decirse de manera general que respecto a la implementación de estas medidas, las acciones de control están más relacionadas con la aceptación y aplicación de las reglamentaciones establecidas por la autoridad sanitaria, y las acciones de prevención recaen en manos de productores y propietarios, siendo por lo tanto de su propia y exclusiva responsabilidad el disponerlas en defensa del patrimonio propio o de terceros. En este sentido, para el éxito en el control de la enfermedad debe sumarse al accionar de las entidades oficiales, la participación imprescindible del usuario mediante el conocimiento y cumplimiento de las normas, el requerimiento de asesoramiento técnico profesional privado, y la aceptación y aplicación responsable de las medidas y recomendaciones que son de su exclusiva competencia. 8.2 Medidas protectoras en territorios limpios (Países o regiones de países) Cada importación o ingreso de solípedos al país o región libre exigirá en origen un certificado oficial en el que se haga constar que no más de 5 días antes de efectuar el embarque o transporte: 20 1. Los animales no presentaron signos clínicos de la enfermedad. 2. Los animales permanecieron como mínimo durante los 3 meses últimos en su establecimiento de origen. 3. Los animales arrojaron resultado negativo al test de Coggins realizado 30 días antes de su embarque o egreso. Dirección de Luchas Sanitarias �4. Los animales que ingresan para permanecer corto tiempo en el país o región (exposiciones y concursos hípicos) también cumplirán los tres requisitos precedentes. 5. Los que vayan a quedarse definitivamente en el país o región limpia se someterán posteriormente a su arribo, a una cuarentena de 30 días como mínimo, debiendo presentar un segundo test negativo confirmatorio realizado a los 60 días del efectuado en origen para que se autorice su ingreso definitivo. 8.3 Medidas en territorios con la enfermedad enzoótica Marco general Además de la denuncia obligatoria, desde 1979 existe en la República Argentina la obligación oficial de certificar con un test negativo no sólo a todos los équidos que traspasen las fronteras del país y a los destinados a la producción de sueros, sino también a todo équido que se traslade o que ingrese y/o permanezca en concentraciones a los que asisten equinos desde diversos orígenes. Si bien la legislación no contempla la obligatoriedad de realizar pruebas de control dentro de los predios en la medida que no se registren egresos desde los mismos, para mantener predios controlados las recomendaciones técnicas establecidas desde los comienzos de la campaña de lucha, y de aplicación voluntaria, son los mismos: 1. Realizar uno o dos test anuales en poblaciones estables de manera sistemática, en especial en zonas, o luego de temporadas de alta carga de insectos. 2. Establecer cuarentenas internas para los ingresos de nuevos equinos, reconfirmando la condición de negativos de los ingresantes a los 30-60 días posteriores y recién allí incorporarlos definitivamente al predio. 3. Garantizar el buen manejo de las posibles fuentes de transmisión descriptas anteriormente (material descartable, intercambio de enseres, desinfección, etc.). Como fuera dicho, la realización del test solo puede ser efectuada en laboratorios habilitados de la Red Oficial, quienes para su habilitación y mantenimiento en la Red, son previamente entrenados y luego evaluados periódicamente por el servicio oficial. 8.4 Medidas a adoptar ante brotes o hallazgos de reactores positivos al test Es única responsabilidad del propietario o responsable que ante animales clínicamente enfermos o inaparentes con resultado positivo al test de Coggins, proceda a: i) separarlos inmediatamente del resto, ii) efectuar la denuncia y iii) eliminarlos, por sacrificio inmediato en el lugar a los sintomáticos o con marcado a fuego y posterior remisión a faena. Una vez confirmado el diagnóstico, está contraindicado todo tipo de tratamiento, ya que vale recordar que el animal positivo, es un animal infectado, y se convierte en portador y reservorio del virus toda su vida, convirtiéndose en una potencial fuente de diseminación de la enfermedad sino se evitan las vías mecánicas de transmisión. Todo equino que estuvo en contacto con un caso infeccioso de una forma tal que se considera que ha estado considerablemente expuesto y por consiguiente corre el riesgo de contraer la infección, se debe aislar de los demás caballos y ser sometido a control clínico y serológico. Siempre que se presente esta enfermedad, se llevará a cabo una adecuada lucha contra los insectos y se acentuará la prevención de diseminación descripta para las formas de transmisión por la mano del hombre. Manual de Procedimientos de Anemia Infecciosa Equina 21 �8.5 Procedimientos en predios rurales En zonas de baja infección, al ocurrir en los predios hallazgos ocasionales de portadores, se deben eliminar de la población todos los equinos con test positivo; y de manera inmediata los que presenten además manifestaciones clínicas; el resto de los equinos del predio que contactaron con los positivos (sean negativos al test o no testeados), deben ser aislados y remuestreados a los 60 días para su confirmación diagnóstica. De verificarse nuevos hallazgos en éstos lotes, se repetirá el procedimiento tantas veces como sea necesario hasta asegurarse que toda la población es negativa. En los territorios con alta presencia de la enfermedad, se irán constituyendo paulatinamente efectivos de equinos seronegativos, los que deben ser mantenidos a la distancia indicada de 180 metros de la población infectada; estos lotes se protegerán del ingreso del virus con una continuada lucha contra los insectos y un adecuado manejo diferencial de los aperos, arneses y utensilios. Mediante la eliminación progresiva de los équidos seropositivos de la población remanente, combinada con el aislamiento y ulterior control de los animales en contacto, se irá reduciendo continuadamente el número de équidos infectados presentes en el territorio, y con ellos los reservorios del virus. Posteriormente, estos predios se manejarán como fue descripto para zonas de baja infección. 8.6 Medidas para los ingresos En forma similar a otras enfermedades infecciosas que afectan a los animales, la responsabilidad de los ingresos de équidos a establecimientos o predios de cualquier índole es exclusivamente de la entidad, del propietario o responsable de los mismos, por lo tanto para prevenir el ingreso de la enfermedad a una población, todo equino que ingrese debiera hacerlo bajo las siguientes condiciones: 1) Con diagnóstico y certificado negativo de origen. 2) Aislamiento del resto de la población estable, un mínimo de 180 metros de distancia (50 metros pueden ser efectivos en épocas o regiones sin tábanos). 3) Verificación de la negatividad mediante dos pruebas consecutivas, separadas una de otra por un intervalo de 30 días entre ambas o al menos una prueba confirmatoria a los 60 días de la fecha de realizada la anterior. 4) Durante la cuarentena, se garantizará el control y el buen manejo de las posibles fuentes de transmisión mecánica descriptas. 8.7 Procedimientos en los eventos hípicos La adaptación de las medidas recién descriptas, dada la gran dinámica de movimiento y estabulación de equinos debe centrarse en: 22 1) Diagnóstico y certificado negativo de origen. 2) Verificación de la negatividad. Se podrá disponer al ingreso la utilización de la prueba rápida de Elisa para los de corta permanencia, y en todos los casos - mayor lapso de tiempo de permanencia o reingresantes al predio – se confirmará la negatividad por test de Coggins. 3) Los que arrojen resultado positivo a ELISA se aislarán de inmediato en un box con protección contra insectos, hasta confirmación por la técnica de inmunodifusión. 4) Hasta conocer el estado serológico de los ingresantes o reingresantes, se garantizará el control y el buen manejo de las posibles fuentes de transmisión mecánica. �8.8 Procedimientos en los remates ferias Los certificados de AIE, deberán ser presentados al ingreso de los equinos a las autoridades sanitarias para su verificación y siempre con anterioridad a la realización de la subasta. Las tropas o équidos que arriben al predio ferial y que no se encuentren amparados por la mencionada certificación, serán considerados de riesgo sanitario, quedando interdictados en el lugar para posteriormente ser remitidos a faena sanitaria. Los certificados que no den cumplimiento a las normas establecidas al respecto, quedarán intervenidos y retenidos por la autoridad oficial independientemente del tiempo que reste para su vencimiento, labrándose las actuaciones correspondientes a efectos de determinar las responsabilidades del caso. Estas tropas o équidos que arriben al predio ferial con estas certificaciones intervenidas, quedarán aislados e interdictados en el predio hasta la realización de una prueba oficial a cargo del remitente. Los licenciatarios, propietarios o responsables de los mercados de concentración (Rosario, Liniers, Córdoba u otros), o de ferias regionales serán responsables de que los equinos que se encuentren o presten servicio en las instalaciones de los mismos cuenten con la certificación de Anemia Infecciosa Equina con diagnóstico negativo con una antigüedad no mayor a sesenta (60) días. 8.9 Desinfección El virus exhibe una marcada resistencia a las influencias físico-químicas, por lo que sólo una limpieza y desinfección escrupulosamente efectuada con un desinfectante en concentración suficiente permiten la destrucción del virus. Para la desinfección química de los instrumentos, primero se debe remover todo resto de suciedad mediante lavado y cepillado y luego sumergirlos en desinfectantes fenólicos por 10 minutos. Cuando la materia orgánica no es removida puede utilizarse clorhexidina o compuestos fenólicos combinados con un detergente. Para la desinfección personal se indican alcohol, hipoclorito de sodio o compuestos yodados. 9. Diagnóstico y Certificación: Procedimientos Es la resultante del conjunto de responsabilidades y tareas compartidas por el responsable, propietario o tenedor del/los equinos que solicita el test, el veterinario acreditado que extrae la sangre e identifica al equino y el laboratorista de la Red Oficial que realiza y lee la prueba serológica específica e informa el resultado. Cada uno de los actores mencionados asume su responsabilidad firmando en los respectivos lugares asignados en el formulario de certificado de Anemia Infecciosa Equina, Libreta Sanitaria o Pasaporte. 9.1 Extracción y remisión de la muestra Las muestras de sangre deben ser extraídas por la autoridad oficial o por un profesional veterinario acreditado oficialmente, siendo su responsabilidad: a. Acompañar a las muestras que remite, con el certificado de AIE, Libreta Sanitaria o Pasaporte aprobados por la autoridad oficial. b. Completar apropiadamente o verificar según se trate, los datos de estos documentos, con especial énfasis en lo referente a la reseña del animal y a la ubicación del equino al momento de extraer la sangre. 23 �c. En caso de verificar que la residencia de los equinos difieren de la consignada en las libretas, acompañará al material remitido de una nota con firma y sello consignando la ubicación de los equinos al momento de la extracción. d. Comunicar al propietario o tenedor del equino sobre los procedimientos y obligaciones a cumplir según las normativas de control vigentes. La sangre se volcará en tubos sin anticoagulante, utilizando rigurosas condiciones de asepsia, y luego las muestras se mantendrán refrigeradas en heladera sin congelar, hasta su remisión al laboratorio seleccionado. 9.2 Recepción de las muestras El laboratorista es responsable de: a. No dar ingreso a ninguna muestra, si el material remitido no viene acompañado de su correspondiente certificado de AIE, Libreta Sanitaria o Pasaporte aprobados por la autoridad oficial. b. No procesar las muestras si la documentación adjunta correspondiente a cada muestra no garantiza el eventual seguimiento oficial ante posibles hallazgos de reactores positivos, en particular: 1. La ubicación de los equinos al momento de la extracción. 2. Los datos del tenedor de los mismos. 3. La correcta identificación de cada equino. 4. La firma y aclaración del veterinario extractor de la muestra y del propietario o tenedor. 5. Cualquier otra irregularidad que impida la actuación oficial ante una denuncia. 6. Certificar solo sobre documentos con modelos aprobados oficialmente. Para facilitar la operatoria, los laboratorios podrán disponer de un formulario de recepción propio donde conste la conformidad del remitente y del laboratorio respecto de la documentación que acompañan a las mismas, número de muestras recepcionadas y su correlatividad con el Nº de certificado o Libreta que acompaña a cada muestra. 9.3 Tiempo de validez de las certificaciones La reglamentación vigente establece la obligatoriedad de realizar el test diagnóstico a los équidos que se encuentren en alguna de las condiciones que siguen: a. Todos los équidos del país que se movilizan, cualquiera sea su origen y destino, con excepción de aquellos con destino final a faena. b. Todos los équidos residentes en lugares de concentración tales como: clubes hípicos, caballerizas, centros de descanso, clubes de campo, countries; hipódromos, cuadreras, centros de entrenamiento o eventos deportivos para la práctica del pato, polo, trote, salto, equitación, prueba completa; espectáculos públicos, domas, jineteadas, desfiles tradicionalistas, marchas; paseos, recreación; o cualquier otra actividad o situación en la que convivan o se reúnan equinos de diversos orígenes. La validez de un resultado negativo, es de 60 días contados a partir de la fecha de extracción de la muestra. 10. Procedimiento para la denuncia Por estar reglamentada la denuncia obligatoria, la misma no es excluyente respecto de quien la formula ante la autoridad oficial, por lo que todo el que esté en conocimiento de la existencia de reactores estará igualmente obligado a realizarla. 24 Dirección de Luchas Sanitarias �No obstante, por ser el hallazgo de un positivo la resultante de responsabilidades compartidas por el tenedor del/los equinos, el veterinario que extrae la sangre y el laboratorista de la Red, el siguiente es el ordenamiento de procedimientos a seguir: a. El laboratorista está obligado a i) comunicar conjuntamente el resultado a la delegación oficial correspondiente a su zona de ubicación y al veterinario extractor, por cualquier medio fehaciente de comunicación (con evidencia documentada y comprobable); ii) retener la documentación que acompañó a la/las muestra/as objeto de la denuncia y iii) hacer entrega o remitir la documentación original al veterinario oficial cuando éste se lo requiera. b. El veterinario actuante notificará de inmediato por cualquier medio fehaciente de comunicación a la delegación oficial regional correspondiente a la localidad en que se encuentra el predio de residencia de los equinos y al tenedor de los equinos en forma conjunta. c. A partir del momento de tomar conocimiento del resultado POSITIVO del examen, es responsabilidad exclusiva del propietario o responsable, el aislamiento e inmovilización de/del los equino/s dentro del predio, hasta la intervención oficial y su posterior eliminación. d. El tenedor podrá optar por realizar una segunda prueba confirmatoria, la que será única y realizada solo en forma oficial, y sin que hayan transcurrido más de VEINTE (20) días corridos de intervalo entre la primera y la segunda extracción y manteniendo al equino en estricto aislamiento. e. De presentarse litigios sobre resultados de pruebas realizadas sobre un mismo equino, solamente se dará por válida y definitiva aquella cuya extracción y diagnóstico sea realizado únicamente por el servicio oficial. 11. Eliminación de los reactores Los equinos con sintomatología de la enfermedad, confirmados con resultado positivo al test, deberán ser sacrificados de inmediato en el lugar de residencia. Los portadores serológicos sin síntomas, se marcarán a fuego con las letras AIE en la tabla del cuello del lado izquierdo y podrán ser remitidos a faena directa en cuyo caso serán marcados además con una letra F en la grupa derecha. Cualquiera de las acciones indicadas deberán ser supervisadas por un funcionario oficial. Manual de Procedimientos de Anemia Infecciosa Equina 25 �REGLAMENTO SANITARIO EQUINO (Res. SAGPyA N° 617/05) Apartados del Anexo II relacionados a la A.I.E. 7.12. Anemia infecciosa Equina 7.12.1. Los équidos que se movilicen con cualquier origen y destino, con excepción de aquéllos destinados a faena, deberán haber sido sometidos al diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina, y transitar acompañados con una certificación de Anemia Infecciosa Equina negativa vigente. 7.12.2. Para los casos de importación y exportación de équidos el diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina será realizado por la Dirección de Laboratorios y Control Técnico del SENASA o por el organismo oficial o laboratorio de Red que autorice la Dirección Nacional de Sanidad Animal del SENASA. 7.12.3. Todo équido clínicamente enfermo y/o sospechoso de padecer Anemia Infecciosa Equina deberá ser inmediatamente aislado del resto de los equinos hasta tanto se confirme la enfermedad por medio del diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina. En équidos con sintomatología clínica sospechosa de Anemia Infecciosa Equina, un diagnóstico 27 �serológico negativo solamente se interpretará como tal, cuando hayan transcurrido VEINTE (20) días desde la aparición de los primeros síntomas. Vencido este plazo se deberá realizar un segundo diagnóstico serológico. 7.12.4 La certificación con resultado negativo de Anemia Infecciosa Equina será la resultante del conjunto de las tareas realizadas por el responsable del equino, el veterinario que extrae la sangre a analizar y el laboratorista que realiza la prueba serológica y consigna el resultado, debiendo firmar todos en los respectivos lugares asignados en el formulario de certificado de Anemia Infecciosa Equina o Libreta Sanitaria Equina. 7.12.5 La validez del certificado de Anemia Infecciosa Equina en todos los casos será de SESENTA (60) días corridos a partir de la fecha de extracción de la muestra de sangre. 7.12.6 El diagnóstico positivo en un potrillo al pie de la yegua madre, la cual es también positiva, será considerado como tal luego que el potrillo sea destetado y se efectúen DOS (2) pruebas realizadas con un intervalo de SESENTA (60) días corridos entre ellas. Si el resultado POSITIVO subsiste, el potrillo será considerado infectado con el virus de la Anemia Infecciosa Equina. 7.12.7 Todo équido confirmado como reactor positivo, será marcado a fuego con las letras AIE, de DIEZ (10) centímetros de altura y QUINCE (15) centímetros de ancho, en el cuello, del lado izquierdo. 7.12.8 Los équidos con diagnóstico positivo y con sintomatología de Anemia Infecciosa Equina deberán ser sacrificados con intervención de la Dirección Nacional de Sanidad Animal dentro de las CUARENTA Y OCHO (48) horas de haber recibido la comunicación por parte del veterinario actuante. En todos los casos que el equino evidencie sintomatología de Anemia Infecciosa Equina, el veterinario actuante lo hará constar en la documentación que, conjuntamente con el material, se envíe al laboratorio. 7.12.9 Los équidos con diagnóstico positivo a Anemia Infecciosa Equina y sin sintomatología de Anemia Infecciosa Equina (portadores inaparentes), deberán en todos los casos ser aislados y posteriormente eliminados por sacrificio en el lugar donde se encuentran o por remisión a faena, en cuyo caso se deberán marcar a fuego previamente con las letras AIE, de DIEZ (10) centímetros de altura y QUINCE (15) centímetros de ancho, en el cuello, del lado izquierdo, y ser despachados según el régimen vigente de remisión de équidos a faena. 7.12.10 El aislamiento de los reactores o cuando se sospeche que la enfermedad que aqueja al equino es Anemia Infecciosa Equina y hasta tanto no se cuente con el resultado del diagnóstico de laboratorio, se efectuará cumpliendo con las siguientes pautas: 7.12.10.1. Se lo aislará debiendo encontrarse separado por lo menos TRESCIENTOS (300) metros de otros équidos, si se encuentra en el campo. 7.12.10.2. El aislamiento de los équidos reactores será permanente, no pudiendo salir bajo circunstancia alguna de ese lugar hasta su eliminación por sacrificio o remisión al frigorífico. 7.12.10.3. Se evitará todo intercambio de jeringas, útiles de aseo, enseres de monta, recipientes de alimentación, termómetros u otros objetos entre equinos enfermos o sospechosos y equinos sanos, salvo una adecuada y esmerada esterilización. 7.12.10.4. Se evitará el acercamiento de insectos al enfermo y a los lugares de alojamiento de los sospechosos. 7.12.11 Ante el hallazgo de UN (1) resultado positivo, el lugar o predio de residencia del reactor quedará interdictado, procediéndose al sangrado y diagnóstico de la totalidad de las existencias cuando éstas sean menores al número de DIEZ (10) équidos, y del DIEZ (10) por ciento de las existencias en forma aleatoria por encima de esta cifra. 28 Dirección de Luchas Sanitarias �7.12.12 De registrarse UNO (1) o más resultados positivos en los muestreos indicados en el numeral anterior, el propietario o responsable del predio quedará obligado al saneamiento total de las existencias equinas, manteniéndose la interdicción del predio hasta su cumplimiento y siendo los costos emergentes del mismo a su cargo. 7.12.13 Ante un resultado positivo el propietario o responsable del équido podrá optar únicamente por un segundo diagnóstico bajo los requisitos que se detallan: 7.12.13.1 El propietario del animal deberá manifestar al veterinario de la Dirección Nacional de Sanidad Animal del SENASA dentro de las CUARENTA Y OCHO (48) horas de tomado conocimiento del primer diagnóstico, su decisión de realizar el segundo diagnóstico. 7.12.13.2 Esta segunda prueba – la extracción de la muestra y el diagnóstico oficial – tendrá carácter definitivo y será realizada exclusivamente por personal del SENASA. 7.12.13.3 Entre el primer y segundo diagnóstico no podrán transcurrir más de VEINTE (20) días de intervalo. 7.12.13.4 Aislamiento total del equino dentro del predio en un lugar autorizado por la Dirección Nacional de Sanidad Animal. 7.12.13.5 El Veterinario Oficial procederá a la extracción de la muestra de sangre, y la remitirá al laboratorio oficial. Todos los costos emergentes serán a cargo del propietario. 7.12.13.6 La remisión de la sangre deberá hacerse en la forma indicada en el presente reglamento e irá, asimismo, acompañada con la ficha de identificación. 7.12.13.7 En caso de repetirse el diagnóstico positivo, el Veterinario Oficial actuante deberá proceder a la marcación del animal, dentro de un plazo no mayor de CUARENTA Y OCHO (48) horas. 7.12.14 Los laboratorios que elaboren productos biológicos medicinales de origen equino, tanto para uso humano como animal, deberán utilizar únicamente equinos libres de Anemia Infecciosa Equina. 7.13. Laboratorios de A.I.E - Registro de pruebas efectuadas 7.13.1 El laboratorio llevará el registro de la totalidad de las pruebas diagnósticas de Anemia Infecciosa que efectúe, incluyendo las repeticiones de pruebas y las que se efectúen sin requerimiento de certificación (relevamientos), de tal forma que exista correspondencia entre la cantidad de dosis provistas y declaradas por el Laboratorio proveedor de cada equipo diagnóstico y el número de dosis utilizadas. 7.13.2 Los laboratorios deberán contar con un libro foliado, rubricado indistintamente por personal autorizado dependiente de la Dirección Nacional de Sanidad Animal o de la Dirección de Laboratorio y Control Técnico del SENASA, cuyas medidas mínimas sean de VEINTIDOS (22) por TREINTA (30) centímetros, y en el cual deberán constar los siguientes datos: 7.13.2.1 En su primer hoja: nombre del laboratorio, nombre del director técnico, código de habilitación otorgado, domicilio, localidad, partido o departamento y distrito correspondiente a la oficina local de la Dirección Nacional de Sanidad Animal al cual corresponde. 7.13.2.2 En las hojas subsiguientes se reproducirá el modelo de registro según se detalla en el Anexo III . 7.13.2.3 En los casos en que se utilicen registros informáticos, las planillas deberán respetar el modelo mencionado y sus impresiones deberán quedar adheridas firmemente sobre las hojas respectivas del libro foliado. Manual de Procedimientos de Anemia Infecciosa Equina 29 �7.13.3 7.14 Los laboratorios obligatoriamente remitirán esta información en los términos descriptos en forma mensual a la Dirección de Luchas Sanitarias. Manejo de la certificación y del estampillado 7.14.1 La totalidad de los resultados diagnósticos que se vuelquen en los certificados y Libretas Sanitarias oficiales, además de la firma y sello del Director Técnico, llevarán adherida la estampilla oficial con el autoadhesivo provisto en el equipo diagnóstico. 7.14.2 Cuando se utilice el formulario de certificación, sus TRES (3) hojas deberán firmarse en forma hológrafa, por el profesional acreditado que remite la muestra, por el propietario, tenedor o responsable del equino y por el Director Técnico del Laboratorio, prescindiendo del uso de carbónicos u otros mecanismos de duplicación. 7.14.3. En caso de requerirse en una misma muestra la repetición de una prueba diagnóstica, las estampillas correspondientes a las dosis utilizadas deberán quedar adheridas en el libro foliado en la columna correspondiente a Nº de certificado o libreta. 7.14.4. Se procederá de igual modo al descripto en el numeral anterior cuando se realicen pruebas que no demanden certificación (relevamientos). 7.15. Comercialización y utilización del antigeno Anemia Infecciosa Equina. 7.15.1. Los laboratorios de la Red habilitados para efectuar las pruebas de Anemia Infecciosa Equina deberán llevar un archivo que contendrá los remitos y facturas de compra de los equipos diagnósticos. 7.15.2. Las cajas o estuches que contengan al antígeno de Anemia Infecciosa Equina, llevarán en un superficie una parte fácilmente removible (troquelada, perforada) en la que conste el nombre comercial del producto, número de serie o lote y cantidad de dosis diagnósticas. 7.15.3. Acompañando a la presentación comercial del producto se incluirán en su interior las estampillas oficiales, numeradas del UNO (1) al número total de dosis contenidas en el envase; y en cada una de ellas, el número de serie o lote y la fecha de vencimiento, conforme lo establecido por la Resolución Nº 118 del 4 de febrero de 1994 del exSERVICIO NACIONAL DE SANIDAD ANIMAL. 7.15.4. Cada titular de Certificado de Uso y Comercialización -importadores o elaboradores- y cada comercializador inscripto llevará un archivo en el que consten en forma completa los documentos de compra y venta, o de venta, del antígeno de Anemia Infecciosa Equina, según corresponda en cada caso. 7.15.4.1. La documentación debe ser conservada hasta DOS (2) años después de realizada cada operación. A los fines de su auditoria oficial debe obrar copia de cada documento tanto en el archivo del emisor del mismo (documento de salida o venta) como del receptor (documento de entrada o compra). 7.15.4.2. El documento a archivar será la factura o, en su defecto, el remito que documenta el movimiento del antígeno de Anemia Infecciosa Equina entre partes. 7.15.4.3. La Documentación Comercial del movimiento del antígeno de Anemia Infecciosa Equina será archivada en el domicilio legal de cada operador (lugar formal de auditoría). 7.15.4.4. Unicamente se podrán efectuar ventas desde los laboratorios elaboradores o importadores a los Laboratorios Habilitados de Red. 30 �7.15.4.5. Prohíbese la venta a cualquier lugar o persona no habilitada y registrada oficialmente para efectuar diagnósticos 7.15.4.6. La información que deben conservar los Laboratorios Habilitados de Red será un archivo, el que contendrá, por un lado, los remitos o facturas de compra del antígeno de Anemia Infecciosa Equina y, por otro, el libro foliado con el detalle de la utilización de las dosis diagnósticas de los equipos adquiridos. 7.15.4.7. Los laboratorios elaboradores o importadores deberán informar mensualmente a la Dirección Nacional de Sanidad Animal el número total de equipos comercializados a sus clientes con el detalle de las facturas o remitos, según corresponda,. 7.15.4.8. Además de la remisión mensual indicada en el punto precedente, toda la información descripta debe conservarse ordenada cronológicamente y a disposición del personal del SENASA a los fines de la auditoría oficial del sistema. 7.15.4.9. La Dirección Nacional de Sanidad Animal comunicará mensualmente a los laboratorios titulares de Certificados de Uso y Comercialización la nómina de las altas, bajas y suspensiones de laboratorios de la Red, con la identificación de sus Directores Técnicos, a efectos de la programación de sus ventas. Ante la detección de cualquier incumplimiento en el funcionamiento del sistema, el SENASA podrá suspender el Certificado de Uso y Comercialización del producto que corresponda. La conservación de documentos para auditoría oficial del sistema y el flujo de información para auditoria interna es responsabilidad del titular del Certificado de Uso y Comercialización. 31 �32 Pour On Baño Cumafos SANUVET 10 SIPERKINA 91217 93206 FAEVE S.A. VETANCO S.A. AGROINSUMOS S.A. TRINSEC POUR-ON VETANCID POLVO WARBICIDE POUR-ON 98262 92186 93128 (*) ANTES DE USAR, LEA LAS INSTRUCCIONES Y CONSULTE SIEMPRE A SU VETERINARIO DE CONFIANZA. Cipermetrina Cipermetrina Pour On Espolvoreo Ambiental Pour On Pour On Cipermetrina BURNET SACIFIA TEHUELCHE POUR-ON 92491 Cipermetrina, BOP.,diclorvós Pour On OVER Pour On Cipermetrina OVER SYNECTO PLUS POUR-ON Aspersión Animal Pour On Pour On Aspersión Amb y animal Aspersión Amb y animal Pour On Aspersión Animal Pour On Aspersión Amb y animal Tópica SYNECTO MAX A.R. POUR-ON Cipermetrina Tópica Aspersión Amb y animal 97252 Cipermetrina, Carbaril,BOP Cipermetrina Cipermetrina Asimetrina Cipermetrina Cipermetrina Cipermetrina Cipermetrina Carbaril Carbaril Triclorfón, Diclorvós Cipermetrina,Diclorvós Pour On 90176 OVER POUR ON BIOTENK 93202 SYNECTO ASPERSION BIOGENESIS S.A. PIRETRAL 92432 90175 BIOTENK S.A. BROUWER S.A. PIRETRAL POUR-ON 92492 OVER FAEVE S.A. OPIGAL 50 87001 DELENTE LABORATORIOS FAEVE S.A. MOSCASIN POUR-ON 93183 STOP FLY IND. QUIMICAS ALMIDAR LUVUCIT 90248 SUPER SYNECTO POUR-ON ANUBIS S.R.L. LER CHAMPU MEDICADO 93335 95341 Deltametrina LAB.LER S.R.L. HOECHST ROUSSEL VET S.A. INSECTICIDA RURAL 82642 93432 Tópica Pour On Diclorvós,Malatión BIOGENESIS S.A. JOHN MARTIN S.R.L. GALMETRIN PLUS POMADA 87504 Cipermetrina Tópica BROUWER S.A. DERRAMIN Tópica 88234 Cialotrina Pirimifós VON FRANKEN SAIC Cipermetrina,DDVP SCHERING PLOUGH S.A. CURABICHERAS PIRETROIDE Aspersión Animal Pour On Pour On DKL 5 CURABICHERA LIQUIDO Diazinón Cipermetrina Cipermetrina Tópica y Ambiental Aspersión Amb y animal 82799 NOVARTIS ARGENTINA S.A. CLIK 600 ASPERSION 1805 Diclorvós Cipermetrina 87313 INSTITUTO SAN JORGE BAGO PHARMAVET DE CASTAÑO SRL CIPERSIX CIPERVET POUR ON 96162 BIOGENESIS S.A. 87595 ALSI QUIMICA SANITARIA CIOVAL CIPERKILL 86368 BOX 92376 80246 Tópica Pour On Triclorfón Cipermetrina ALLIGNANI HNOS S.R.L. LOPEZ VILLANUEVA Y ASOC. BICHOLUZ RIO DE JANEIRO 82488 Pour On PROAGRO S.A. Cipermetrina BAYER ARGENTINA SA ASUNTOL LIQUIDO BICHERON POUR ON 1544 96016 Pour On Cipermetrina BIOGENESIS S.A. ACIENDEL Cipermetrina BIOGENESIS S.A. ACIENDEL 87595 VIA DE ADMINISTRACION 0080/E COMPONENTES EMPRESA PRODUCTO CERTIFICADO PRODUCTOS REPELENTES DE INSECTOS HEMATOFAGOS INDICADOS EN EQUINOS (*) �REGISTRO DE PRUEBAS DIAGNOSTICAS DE ANEMIA INFECCIOSA EQUINA EFECTUADAS EN LABORATORIOS DE RED OFICIAL Para volcar datos en el libro foliado y remisión mensual de la información a la Dirección de Luchas Sanitarias AL COMENZAR CADA EQUIPO DE DIAGNOSTICO Marca ............................................................. N° de Serie Estampillas Nros. de ......................................................... ......................................... Fecha de Compra .............../......................................./.............. a N° de Dósis ................................ ..................................... Factura/Remito N° ..................................................... DATOS A COMPLETAR Prueba N° Fecha de Ingreso Remitente Origen de la Muestra Resultado Certificado/ Libreta N° .............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................ .............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................ .............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................ .............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................ .............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................ RESPONSABLE Lugar ................................................................................................ .................................................. Firma y Sello Fecha C.244 .............../......................................./.............. .............................................................................. Aclaración 33 �N° Colegio de Veterinarios de la Provincia de: 000000000 Fecha: ............../................./ ................... IDENTIFICACION Nombre del Equino: .................................................................................. Edad: ......... DISEÑO DE MARCA A FUEGO Identificación Individual: ........................................................................ Sexo:............ Raza o Tipo:..................................................................... Pelo: .................................. Padre: ..........................................................Madre:.......................................................... PROPIETARIO Apellido y Nombre:.......................................................................................................... RENSPA N°: ....................................................... Domicilio: Calle: ........................................................................................................... N°:........................ Localidad: ....................................................... Partido o Dto.: ..................................................................... Los datos consignados son verídicos, corresponden al equino y se ajustan a la realidad Prov.:.............................................................. ...................................... Firma del Propietario CERTIFICACION DE LA EXTRACCION DE LA MUESTRA Fecha de Extracción: ........./....................../.............. La Muestra se Encuentra Identificada con: ............................... Fecha de Remisión: ........./....................../.............. Equino CON SINTOMAS Equino SIN SINTOMAS Lugar de Extracción: Calle: ................................................................................................................................... N°:........................ Localidad: ....................................................... Partido o Dto.: ...................................................... Prov.:.............................................. Responsable de la Extracción: Doctor................................................................................................ MP N°:....................................... Acreditación SENASA N°: ..................................................... Los datos consignados son verídicos, corresponden al equino y se ajustan a la realidad. Los datos de filiación se encuentran correctamente transcriptos, sin tachaduras ni enmiendas ...................................... Firma y Sello del Profesional CERTIFICACION DEL DIAGNOSTICO Laboratorio donde se efectuó el análisis:.............................................................................................................. Red N°:..................... Diagnóstico Positivo Negativo FECHA DE RESULTADO ........./....................../.............. Pegar el stiker correspondiente a la prueba, en este lugar. ......................................................... Lugar de Expedición Vencimiento ........./....................../.............. Expedición ........./....................../.............. ...................................... Firma Laboratorista Certifico el resultado del análisis del equino cuya filiación figura en este documento MP N°: .......................... C247 35 �INTERVENCION SENASA FECHA MOTIVO LUGAR FIRMA .............................................................................................................................................................................................................................. .............................................................................................................................................................................................................................. .............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................. INTERVENCIONES SERVICIO VETERINARIO PRIVADO ACREDITADO FECHA MOTIVO LUGAR FIRMA .............................................................................................................................................................................................................................. .............................................................................................................................................................................................................................. .............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................. .............................................................................................................................................................................................................................. ............................................................................................................................................................................................................................. 1 - En los formularios estará dibujada la silueta de un équido, con DOS (2) perfiles, derecho e izquierdo. Entre ambos la cabeza, cuello y pecho, de frente; también estarán los perfiles izquierdo y derecho de los miembros y los mismos vistos de atrás. 2 - La individualización de todo equino que requiera certificación diagnóstica específica de Anemia Infecciosa Equina, deberá efectuarla el veterinario que extraiga la sangre para exámen, con el equino a la vista, cumplimentando la documentación identificatoria correspondiente. 3 - Para una correcta identificación el veterinario actuante acreditado deberá consignar la totalidad de las señas particularas, como ser: remolinos, manchas, cicatrices, pelos blancos, marcas a fuego, pelaje, edad, etcétera, todo ello correctamente ubicado, remitiendo luego al laboratorio los TRES (3) ejemplares conjuntamente con la muestra de sangre contenida en un tubo identificado con una faja de seguridad. 4 - Para dar ingreso a las muestras deberá verificarse que los datos que figuran en el certificado que acompaña la muestra, estén completados en su totalidad, y rubricados por el veterinario que extrae la muestra con sello aclaratorio. 5 - Deberá mantenerse en archivo por un lapso no menor a UN (1) año y en el orden en que fueron expedidos, los duplicados de los certificados, los que deberán ser presentados al personal del SENASA, cuando este lo requiera. 6 - Los certificados deberán ser firmados, tanto por el profesional que remite la muestra como por el Director Técnico del laboratorio en forma ológrafa, prescindiendo del uso de carbónicos u otros mecanismos de duplicación. 7 - El laboratorio deberá llevar registro de la totalidad de las pruebas diagnósticas Anemia Infecciosa Equina, sean estas para la extensión de los certificados diagnósticas o de relevamientos a establecimientos que no la requieran. 8 - En caso de que el diagnóstico sea POSITIVO, el laboratorio lo comunicará al veterinario actuante, reservándose para sí el triplicado. El original y el duplicado los remitirá de inmediato a la Oficina Local del SENASA. 8.1 - Los formularios duplicados y triplicados no tendrán valor como certificación. 8.2 - En caso de extravío del formulario, se podrá solicitar una copia, en la que deberá constar tal carácter. 8.3 - Los certificados deberán ser confeccionados con tinta o cualquier material inalterable y no presentar raspaduras ni enmiendas. 36 �� Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Manual de Procedimientos para la Anemia Infecciosa Equina (AIE) Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2005 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Dirección de Luchas Sanitarias Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0037 Abstract A summary of the resource. El presente manual se dirige principalmente a los Veterinarios privados, sectores interesados en la producción equina y actividades hípicas, y particularmente a vastos sectores rurales que estando cultural y tradicionalmente tan cerca del caballo quedan a veces tan lejos de los conocimientos más elementales para proteger su salud. También va dirigido a las autoridades nacionales, provinciales y municipales locales igualmente responsables y encargadas de emprender acciones sanitarias contra la AIE. En su desarrollo, se pretende reavivar el debate acerca de cual fue el aprendizaje y cuales fueron los defectos u omisiones en el intento de controlar la AIE desde siempre, puntualizando aquello que está al alcance de todos y cada uno para controlarla en todo el país. Seguramente se reiterarán conceptos y se desmitificarán algunas creencias populares sobre la enfermedad que a lo largo de los años sumaron confusión y produjeron alarmas exageradas en aquellos que se enfrentaron o vuelven a enfrentarse con esta enfermedad. Por tanto, centraremos su contenido en los principios de la enfermedad, descripción, pruebas de laboratorio, evaluación de sus resultados, medidas preventivas, atención de sospechas, focos y casos de infección. Table Of Contents A list of subunits of the resource. FINALIDAD MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA (AIE) 1. Consideraciones Generales 1.1 Importancia económica 2. Etiología 3. Descripción 4. Formas de presentación clinica 5. Transmisión de la enfermedad 5.1 Transmisión natural 5.2 Transmisión por el hombre 5.3 Otras vías de transmisión 6. Diagnóstico de Laboratorio 6.1 Periodo de ventana para la detección de la enfermedad por medio del test 6.2 Precisión de los tests diagnósticos y divergencias más frecuentes. 7. Proceso Epizoótico 7.1 Reservorios del virus 7.2 Población hospedadora 8. Medidas de Prevención y control 8.1 Aplicación de las medidas de control y prevención. 8.2 Medidas protectoras en territorios limpios (Países o regiones de países) 8.3 Medidas en territorios con la enfermedad enzoótica 8.4 Medidas a adoptar ante brotes o hallazgos de reactores positivos al test 8.5 Procedimientos en predios rurales 8.6 Medidas para los ingresos 8.7 Procedimientos en los eventos hípicos 8.8 Procedimientos en los remates ferias 8.9 Desinfección 9. Diagnóstico y Certificación: Procedimientos 9.1 Extracción y remisión de la muestra 9.2 Recepción de las muestras 9.3 Tiempo de validez de las certificaciones 10. Procedimiento para la denuncia 11. Eliminación de los reactores REGLAMENTO SANITARIO EQUINO - Res. SAGP y A N° 617/05 Enfermedades de los Equinos https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/de57dbef6cd95e116eac773161c81dd9.pdf a8f811827681a398d8911eb173cd3ed4 PDF Text Text Dirección de Epidemiología y Análisis de Riesgo epidemiologia@senasa.gov.ar Informe Final: Halicephalobus: Recomendaciones sanitarias El siguiente informe se ha llevado a cabo tomando en consideración los aportes realizados por el grupo de expertos, conformado a pedido del SENASA. En el mismo se presenta las conclusiones que deben ser consideradas ante la ocurrencia de futuras sospechas de ésta enfermedad, como así las medidas de prevención y mitigación. El presente se confeccionó a raíz de un evento de un equino muerto con antecedentes de signología nerviosa en un club de campo de la ciudad de Avellaneda, provincia de Buenos Aires. Para la construcción de las siguientes recomendaciones, se citó a la conformación de un grupo de expertos profesionales, pertenecientes a variadas ramas de la biología, lo cuales están relacionados con la temática. Ellos son:      Dr. Chavez Eliseo. Zoólogo. (Universidad Nacional de La Plata Dr. Tanzola Ruben Daniel. Biólogo (Universidad del Sur) Dra. Radman Nilda. Microbiología (Universidad Nacional de La Plata) Dra. Salomón, Maria Cristina. Bioquímica (Universidad Nacional de Cuyo) Dr. Suarez Victor. Veterinario (INTA Salta) De acuerdo con la bibliografía internacional referida a Halicephalobus gingivalis, nematode Rhabditoidea, descripto por Stefanski en 1954 en Francia es habitante común de suelos enriquecidos con materia orgánica vegetal en descomposición y posible de aislar a partir de materia fecal de equinos. Es patógeno facultativo o accidental de equinos. Cosmopolita y, zoonótico. Forma tempranamente granulomas evidentes en piel y mucosas, es letal al legar a nervioso central. Dado el riesgo que implica, se realizan las siguientes observaciones y recomendaciones para diagnóstico, manejo y control de la Halicephalobiasis. Página 1 de 7 �Dirección de Epidemiología y Análisis de Riesgo epidemiologia@senasa.gov.ar 1. Recomendaciones operativas Protocolo de desparasitación y desinfección       Primera desparasitación: dosis única de Fenbendazol 100mg/kg vía oral (sonda nasogástrica) e Ivermectina 1,2 -1,8 mg/Kg. Le sigue un período de 48hs de limpieza y desinfección de los boxes (soda caustica 5% o hipoclorito de sodio 10%), donde previamente debe se debe retirar la cama de cada equino de forma diaria para ser quemada. Segunda desparasitación a los 4 días: dosis única de Fenbendazol 100mg/kg e Ivermectina 1,2 – 1,8 mg/kg. Le sigue un período de 48hs de limpieza y desinfección de los boxes (soda caustica 5% o hipoclorito de sodio 10%). Se debe retirar la cama de cada equino de forma diaria para ser quemada. Cumplido, los equinos deben ser llevados a la zona limpia, por un período de 72hs. Durante estas 72hs se deberá realizar una exhaustiva limpieza y desinfección diaria de los boxes que fueron desalojados (zona sucia) con soda caustica al 5% o hipoclorito de sodio al 10%. 2. Posible impacto en la sanidad equina. Considerando el género del parasito y su ciclo de vida, el cual según las revisiones bibliográficas, describe una etapa ambiental y una segunda, con estadios adultos, dentro del hospedador definitivo (equino), se resuelve tener presente las siguientes premisas:     La totalidad de las descripciones y hallazgos diagnósticos se llevaron a cabo mediante las necropsias respectivas de los animales fallecidos y complementándolo con estudios histopatológicos/parasitológicos. El mayor porcentaje de la casuística revisada, alude a la ocurrencia del evento en equinos estabulados. Esto plantea la posibilidad del riesgo de contagio entre los animales mediando algún tipo de material infeccioso, posiblemente materia fecal, cama, etc. Considerar entre los diagnósticos diferenciales las distintas encefalitis equinas de origen vírico. No se recomienda la utilización de corticoides en equinos con sospecha o riesgo de padecer ésta parasitosis. El riesgo se considera según el nexo epidemiológico acorde a la investigación llevada a cabo. (Están contraindicados, coadyuvan en la diseminación de la parasitosis por el organismo). Página 2 de 7 �Dirección de Epidemiología y Análisis de Riesgo epidemiologia@senasa.gov.ar  Controlar los animales que estén en riesgo posteriormente a situaciones de stress y/o inmunodepresoras (traslados, exigencias deportivas, enfermedades concomitantes, vacunaciones, etc.). 2 Recomendaciones para el diagnóstico, a partir de casos clínicos y posibles contactos Se considera que el diagnóstico debe realizarse tanto en animales vivos con signología compatible inespecífica, como en aquellos con sospecha de muerte por éste parásito o que tengan un nexo epidemiológico que los relacione. En caso de establecer sospecha de Halicephalobisis, es factible realizar un diagnóstico precoz de la infestación:      3 En animales en pie se debe observar la presencia de nódulos subcutáneos y submucosos (Realizar biopsias mediante la técnica aspiración (PAF) o ablación parcial y observación en fresco). Observar la presencia de tumoraciones superficiales renales por palpación rectal. Se describen éstas ubicaciones en un gran porcentaje de la casuística. Realizar observaciones en fresco, con previa concentración del material mediante centrifugación, de las secreciones nasales, lavados bronquiales y orina, previamente concentrar el material mediante centrifugación. En todos los casos respetar las condiciones de bioseguridad adecuadas para trabajar con éste patógeno. Como técnica coproparasitológica se recomienda la de Baerman, Recuperación de larvas, realizada con heces refrigeradas. También se pueden sembrar éstas sobre placas de agar conteniendo una pátina de Bacilus subtilis o Escherichia coli. Se observarán a ojo desnudo o conicroscopio estereoscópico, trayectos correspondientes a la migración de los vermes por el agar. Recomendaciones para el tratamiento de animales con sintomatología compatible; y el tratamiento preventivo de posibles contactos. Al reconocer a ésta entidad patógena con cierto poder de contagiosidad, (la cual aún no se ha aclarado con certeza), se recomienda que ante la presencia de animales con diagnostico positivos, como a los susceptibles convivientes y sospechosos con nexo epidemiológico, se lleven adelante las siguientes acciones precautorias:   Ante la presencia de vermes en nódulos subcutáneos o en secreciones o heces, realizar resección quirúrgica y/o tratamiento general con Ivermectina (1.2 a 1.8 mg/kg) acompañado con Fenbendazol (100mg/Kg) vía nasogástrica, en forma inmediata a fin de evitar la migración vía hemática de los vermes al SNC. Las mismas drogas y dosis deben ser repetidas a los 4 días de la primera, para reforzar la terapéutica. Recordar la dosis toxica de IVM, la cual es de 3 – 6 mg/Kg, presentado cuadro con sinología nerviosa indeseada. Los equinos considerados contactos deben ser medicados con Ivermectina y Fenbendazol a la dosis anteriormente nombradas. Página 3 de 7 �Dirección de Epidemiología y Análisis de Riesgo   4 epidemiologia@senasa.gov.ar  Permanecer en estado de alerta ante la aparición de signos compatibles en los contactos directos e indirectos. Ante la aparición de un caso, reforzar los controles clínicos y las medidas higiénicosanitarias en el establecimiento. Realizar las denuncias correspondientes a las autoridades sanitarias pertinentes. Posibles riesgos para la salud humana y de otras especies. Atento a la bibliografía consultada, se considera a éste agente infeccioso como un parasito zoonótico. Se han descripto numerosos casos en personas que tuvieron contacto estrecho con los animales fallecidos y/o con potenciales fuentes infecciosas del ambiente. En todos los casos la infección culmina en la muerte del individuo, presentado un cuadro neurológico central, producto de la migración del parásito en el SNC. Hasta el momento no se han podido clarificar la via de ingreso, pero se postula la percutánea como una de ellas. Por tal motivo se considera tener precauciones especiales y se recomiendan los siguientes ítems:         Los contactos humanos deben concurrir a consulta médica a las áreas del nosocomio correspondiente, con la finalidad de ser evaluados y consignar controles y tratamiento acorde. Comunicar a las autoridades de salud el evento para estar preparados ante cualquier contingencia. Minimizar el ingreso de personas al sitio de agonía o de fallecimiento del animal. De la misma manera se debe reducir el movimiento de personas en el establecimiento. Todos aquellos elementos que tengan contacto con el animal sospechoso/infectado, o con potenciales fuentes de infección, deben ser descontaminados adecuadamente o eliminados, en los que se permita. Los elementos de limpieza del ambiente donde se encuentra el animal sospecho/infectado o fuentes potenciales de infección, deben ser de uso exclusivo de ese sector y no retirarse. Se deben descontaminar todos los días. La recolección de camas y heces debe ser diaria con su eliminación/destrucción adecuada. Los encargados de la tarea deben tomar las medidas de bioseguridad adecuada (guantes, mamelucos, antiparras, etc). Colocar mallas metálicas en el sector de permanencia del animal sospechoso/infectado, a fin de evitar la proliferación y diseminación del agente por medio de los insectos. Restringir la presencia de mascotas en el área. Tomar medidas para minimizar la aparición de roedores que puedan difundir el agente patógeno. Página 4 de 7 �Dirección de Epidemiología y Análisis de Riesgo epidemiologia@senasa.gov.ar 5 Recomendaciones para la prevención y/o control de la patología a nivel poblacional. Al considerar ésta entidad a un nivel poblacional, se debe recordar que el halicephalobus es un parasito de ciclo mixto, con etapas dentro del animal como en el ambiente. Esto genera la posibilidad de difundirse en el hábitat y ser capaz de permanecer vital en el mismo, hasta encontrar al próximo hospedador para continuar con el ciclo. Por tal motivo se deben minimizar lso riesgos de difusión a otros equinos y especies susceptibles.        Aislar a los animales infectados (cuarentenas, uso de material de bioseguridad, botas, guantes, barbijos etc). Los animales fallecidos sin diagnóstico de certeza, deben ser necropsiados y estudiados por los servicios especializados complementarios (Bacteriología, virología micología y parasitología). Los cadáveres deben ser incinerados, con lo que se consigue la destrucción total del parasito y su potencial fuente de infección. Realizar tareas de limpieza y desinfección (soda caustica al 5% o hipoclorito de sodio al 10%) de los boxes y superficies donde permaneció el animal problema. Toma de muestras sanguíneas (sangre entera y suero), materia fecal y camas recuperadas de boxes (tener en cuenta que se trata de vermes de vida libre adaptados al parasitismo). para realizar diagnósticos por biología molecular. Remitir muestras sospechosas a laboratorios especializados. En todos los casos debe notificarse la sospecha y confirmación ante las autoridades correspondientes, (SENASA local, autoridad sanitaria animal y humana acorde a la región en cuestión) . Referencias bibliográficas Anderson RC, Linder KE, Peregrine AS: .Halicephalobus gingivalis (Stefanski, 1954) from a fatal infection in a horse in Ontario, Canada with comments on the validity of H. deletrix and a review of the genus. Parasite. 1998 Sep;5(3):255-61. Anwar, M. A. Gokozan, H. N. Ball, M. K. Otero, J. McGwire, B. S. 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Detection of Halicephalobus gingivalis in soil nematode samples using PCR. Japanese Journal of Nematology; 2007. 37(2):101-104. Página 7 de 7 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Informe Final: Halicephalobus: Recomendaciones sanitarias. Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2013 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Dirección de Epidemiología y Análisis de Riesgo. Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0043 Abstract A summary of the resource. El siguiente informe se ha llevado a cabo tomando en consideración los aportes realizados por el grupo de expertos, conformado a pedido del SENASA. En el mismo se presenta las conclusiones que deben ser consideradas ante la ocurrencia de futuras sospechas de ésta enfermedad, como así las medidas de prevención y mitigación. El presente se confeccionó a raíz de un evento de un equino muerto con antecedentes de signología nerviosa en un club de campo de la ciudad de Avellaneda, provincia de Buenos Aires. https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/710248feb193f60178a853f8077dfb68.pdf 5f815d28254dedc6f56e0df7d8d1eaf0 PDF Text Text LAS PRUEBAS TUBERCULINICAS EN EL GANADO BOVINO Pedro M Torres Jefe Programa Control de Tuberculosis. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA). Av.Paseo Colon 367-4°piso (C1063ACD) Buenos Aires. tuberculosis@senasa.gov.ar Introducción La prueba tuberculínica constituye el instrumento básico para detectar la presencia de infección tuberculosa, por lo tanto, desempeña un papel fundamental en el programa de control y erradicación de la tuberculosis bovina. El empleo de la prueba tuberculínica en el ganado bovino tiene ya una larga historia, que ha permitido acumular una gran cantidad de conocimientos y una amplia experiencia, especialmente en los países cuyos programas de control de la tuberculosis bovina han alcanzado la etapa de la erradicación. Antes de describir las diferentes pruebas tuberculínicas actualmente utilizadas en medicina veterinaria para el control de la tuberculosis en las distintas especies que afecta, es importante realizar la revisión de conceptos básicos que nos permitirán comprender no solamente la razón de su utilización, sino también su capacidad para el diagnóstico, lo mismo que sus limitaciones. El conocimiento de las herramientas disponibles para el control y erradicación del problema en los animales, nos dará la posibilidad para determinar, no sólo la prueba que utilizaremos, sino también cómo, donde y cuando la aplicaremos para lograr el mejor resultado. La definición de la prueba tuberculínica, es sin duda el primer paso. Esta prueba consiste en la inoculación de un antígeno, la PPD (derivado proteico purificado) en forma intradérmica a un animal, con el objeto de poder establecer si el mismo fue infectado por el agente causante de la enfermedad. La lenta y localizada respuesta del organismo al antígeno inyectado se debe a un mecanismo de hipersensibilidad de tipo IV (retardada), la cual se manifiesta durante las 72 horas posteriores a la exposición al antígeno. Al contrario de lo que ocurre en otras formas de hipersensibilidad, la de tipo IV no puede ser transferida de un animal a otro mediante la transferencia de suero, sino que es necesario transferir células T (linfocitos), por lo que la respuesta inmune en tuberculosis se considera mediada por células. Las células T que dan lugar a las respuestas de tipo retardado tienen que haber sido sensibilizadas previamente por exposición al antígeno, y su misión es atraer células de otros tipos hacia la zona de reacción. Cuando el Mycobacterium bovis penetra en el organismo del huésped y las células del sistema inmunitario de éste se ponen en contacto con él, se produce la infección �tuberculosa, paralelamente aparece la resistencia inmunitaria adquirida junto con la hipersensibilidad retardada o de tipo tuberculínico (fenómenos paralelos ambos mediados por células), y se pondrá de manifiesto después de transcurrido el perìodo prealèrgico de 4 a 5 semanas, pudiendo persistir durante toda la vida del animal. Cuando el antígeno (PPD) se inocula en forma intradérmica en la piel de un animal sensibilizado, es decir expuesto al agente en un momento suficientemente anterior a la prueba, como para que el animal pueda haber desarrollado su respuesta inmunitaria, se produce una reacción inflamatoria en el lugar de la inoculación. Esta respuesta inflamatoria tarda varias horas en desarrollarse y alcanzar su máxima expresión, variando según las especies. En los porcinos y aves, el punto máximo de la reacción en proceso se produce a las 48 horas, mientras que los bovinos y otros rumiantes a las 72 horas. La reacción a la tuberculina es una reacción in vivo, sigue siendo una de las respuestas biológicas más interesantes, más estudiadas, que requiere del desarrollo de habilidades, y es la única forma práctica masiva que tenemos para demostrar el hecho más significativo en tuberculosis, que es la infección del ganado con el Mycobacterium bovis. Reactivo para la prueba tuberculìnica El PPD, Derivado Proteico Purificado de tuberculina, es un extracto antigénico derivado del cultivo de un bacilo tuberculoso en un medio sintético. Los Derivados Proteicos Purificados de tuberculinas que se producen son tres, utilizando ya sea Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis y Mycobacterium avium. De ellas sólo las tuberculinas bovina y aviar tienen aplicación veterinaria. De acuerdo con los diferentes métodos de elaboración, existían distintos tipos de tuberculina, incluyendo la tuberculina vieja de Koch (O.T y K.O.T) y la tuberculina de Medio Sintético concentrado por calor (H.C.S.M). En la actualidad solamente se usa el PPD por su mayor potencia y especificidad. El empleo del derivado proteico purificado de tuberculosis, para el diagnóstico de la tuberculosis en los animales, es preparado de acuerdo con los requerimientos de la Organización Mundial de la Salud (OMS.,1968) y OMS/OPS (1972), en lo que respecta a orígenes de los materiales, métodos de producción, precauciones, sustancias agregadas libres de contaminantes, identidad, seguridad, potencia, especificidad y ausencia de agentes sensibilizantes. El bioensayo para la actividad biológica tiene especial importancia y la potencia se expresa en Unidades Internacionales (U.I). Por lo tanto la calidad del PPD siempre debe ser controlada, no siendo digna de confianza ninguna prueba, si se desconoce la potencia de la tuberculina con la que se efectuó. Este PPD se inocula a un animal o animales para determinar su situación de exposición con respecto al agente. De tal manera, cuando es inoculado intradermicamente a animales no expuestos a Mycobacterias, denominados vírgenes o sanos, no se observa ninguna respuesta inflamatoria local importante o que puedan clasificarse como sospechosas o positivas. �Por lo tanto, faltó en esos animales el estímulo previo que los sensibilizara y generen una respuesta frente al agente o sus productos. De la otra manera, si se inoculara a animales infectados o enfermos, es decir ya anteriormente expuestos y sensibilizados al bacilo tuberculoso, aparecerá la reacción tuberculínica, siendo la misma un ejemplo destacado de una respuesta inmunológica específica de hipersensibilidad tardía de tipo IV, mediada por células. Patogénesis de la hipersensibilidad tardía de la piel En las primeras horas no se observan modificaciones apreciables en el lugar de inoculación, pero luego se instala una vasodilatación con aumento de la permeabilidad vascular, con eritema e inflamación, que tiene como característica especial su dureza. Microscópicamente la lesión presenta en las primeras cuatro horas una acumulación celular, transitoria de neutrófilos, pero a las doce horas pasan a ser principalmente mononucleares (monocitos y celulas T). La reacción de hipersensibilidad alcanza su máxima intensidad a las 72 horas postinoculación y la lesión tuberculínica suele desaparecer gradualmente en el plazo de 5 a 7 días, dependiendo del grado de intensidad de la reacción. En reacciones severas puede llegar a observarse necrosis en el sitio de inoculación, pero no se trata de un fenómeno común. La reacción tuberculínica es una reacción inmunológica específica mediada por linfocitos T. Estas células sensibles a los antígenos que se encuentran en la circulación, entran en contacto con el antígeno inyectado, respondiendo al mismo por movilización de otros linfocitos y por división, diferenciación y liberación de linfoquinas. En el sitio de la inyección tuberculínica, se acumula el producto de la multiplicación de los linfocitos y de nuevas generaciones de células linfocitarias. Los macrófagos fagocitan el antígeno inyectado y finalmente lo destruyen, desapareciendo así el estímulo para que continúe la producción de linfoquinas, con lo cual los tejidos vuelven al estado normal. Las pruebas tuberculínicas deben ser aplicadas a intervalos no menores de sesenta (60) días, ya que el sitio alrededor del tejido que se inoculó previamente con la tuberculina puede estar temporalmente desensibilizado. De manera tal, la reacción tuberculínica aparece sólo en animales que tienen o han tenido la infección tuberculosa y puede entonces emplearse para identificar animales con infección o enfermedad. Este test ha servido como base para todos los programas de control y erradicación de la enfermedad en el mundo, a través de la identificación de animales infectados y de su eliminación y ha permitido alcanzar el objetivo de erradicación en países como U.S.A, Canadá, Australia, Cuba y algunas áreas de Uruguay, Chile y Paraguay. �Interpretación de la prueba tuberculínica Para la correcta interpretación de la prueba y sobre todo para que los resultados sean comparables, repetibles e igualmente interpretables por distintos profesionales, existen seis constantes que deben establecerse claramente con los resultados de cada prueba. Estas constantes son: 1. Potencia de la PPD. 2. Dosificación del antígeno. 3. Sitio de la inoculación. 4. Tiempo de lectura. 5. Medición de las respuestas o reacciones para su interpretación. 6. Instrumental a utilizar. No es suficiente clasificar a un animal o a un rodeo como reactor positivo, sospechoso o negativo, ya que la repetición del test por otro profesional que varíe cualquiera de las constantes, puede producir resultados dispares y ser motivo de situaciones conflictuantes a veces importantes. Los criterios de cuantificación de estas variables pueden cambiar en distintos países y aún dentro de un mismo país, de acuerdo con distintas situaciones epidemiológicas y es correcto y lógico que eso suceda, pero es sumamente importante que cada diagnóstico, especialmente aquellos de animales que se mueven hacia otros países, se acompañen de las aclaraciones que permitan conocer todos los pasos seguidos para el mismo, al igual que los criterios de evaluación utilizados para el análisis. La potencia de una tuberculina, es la medida de su actividad biológica en animales previamente sensibilizados con un organismo específico, valorada de acuerdo con patrones y un estándar internacional establecido. De acuerdo a lo establecido por la World Health Organization (WHO), el PPD bovino deberá contener 1 mg de proteínas por mililitro de antígeno para una potencia de 32,500 U.I/mg/ml. La potencia estimada de tuberculina bovina deberá ser, no inferior al 66% ni mayor del 150% de la potencia indicada en el prospecto. El PPD aviar con 0,5 mg de proteína por mililitro de antígeno deberá alcanzar 25,000 U.I/0.5mg/ml. La potencia estimada para las tuberculinas aviares no deberá ser inferior al 75% ni superior al 133% de la indicada en la etiqueta. Las tuberculinas PPD deberán conservarse al abrigo de la luz y a una temperatura de 2ºC a 8ºC, descartando el sobrante que quede en el frasco, sino se va a utilizar en el mismo día. Por lo tanto, cuando utilizamos antígenos de distintas potencias biológicas no hay duda que aquel de mayor potencia nos dará la máxima sensibilidad en las pruebas, por lo que los animales y rodeos testeados con resultados negativos utilizando una PPD de baja potencia, pueden dar resultados muy diferentes a una nueva prueba en la que se cambie el antígeno. Cuando utilizamos el lugar de inoculación más sensible, que es la tabla del cuello, si la potencia de la PPD es baja, los resultados que se obtengan en la identificación de �animales infectados, podrían ser iguales o aún menor que los que se podrían registrar utilizando un área menos sensible, como ser el pliegue ano caudal y una PPD de adecuada potencia. Al utilizar el sitio de inoculación menos sensible y una PPD de baja potencia, la veracidad de los resultados podría alterarse seriamente, sobre todo cuando se desconoce el verdadero diagnóstico de situación sanitario del rodeo. Una segunda constante mencionada, la dosificación del antígeno, es otro dato imprescindible de consignar en un diagnóstico. Manteniendo invariables las cinco constantes, el volumen de antígeno inoculado no importa el sitio, hará variar la sensibilidad de la prueba, que puede aumentar en una cierta proporción de acuerdo al volumen de PPD inyectado. Existen trabajos que muestran que no hay una diferencia significativa en sensibilidad y especificidad para el test ano caudal, utilizando 0.2 ml y 0.4 ml de dosis de PPD de 0.1 mg/ml, aunque el tamaño de la reacción de los animales infectados sería mayor con la dosis de 0.4ml, no observándose la diferencia en los animales no infectados (Francis et al., 1978). Otros estudios muestran escasa diferencia entre la sensibilidad del test cervical simple con 0.1ml de dosis y el test ano caudal con 0.2ml a igual potencia (Kantor et al., 1984). En este último trabajo tuvo como conclusión , que la prueba ano caudal utilizando 0.2 ml de PPD de 1mg/ml de alta potencia, era más sensible que la prueba cervical comparativa y tan sensible como la prueba cervical simple utilizando 0.1ml de PPD de potencia moderada. Por lo tanto, es claro entonces la necesidad de registrar esta información en el diagnóstico de situación. En la actualidad y de acuerdo al manual de normas y procedimientos en vigencia, las dosis correspondientes a las pruebas tuberculínicas en el ganado bovino y en otras especies animales, se hará inoculando 0.1ml de tuberculina PPD bovina de 1.0 mg/ml de concentración (Secretaría de Agricultura, Dirección Nacional de Sanidad Animal, Argentina., 1999). La tercera constante en estudio es el sitio de inoculación, siendo posiblemente el dato más comúnmente registrado, ya que sirve para identificar el tipo de prueba utilizada. Algunas veces no se hace la distinción entre prueba cervical simple o cervical comparativa. Sin embargo no faltan ocasiones en que la única información disponible es de un resultado negativo a la prueba tuberculínica, sin ningún otro dato adicional. La implementación de una prueba de alta sensibilidad, hace que las posibilidades de que surjan inconvenientes con una nueva prueba no importa cual, son escasas al igual que cuando se utiliza una prueba de menor sensibilidad en un rodeo controlado. Los problemas se presentan generalmente cuando luego de una primera prueba de baja o mediana sensibilidad en rodeos infectados o no controlados, se pasa a una prueba muy sensible. Existen otros factores que intervienen en el resultado de un re-test y que luego �consideraremos, pero es de suma importancia conocer la prueba inicialmente utilizada para poder evaluar el resultado que se recibe y decidir que se hará posteriormente. Actualmente no existen prácticamente discrepancias en el tiempo de lectura de la prueba, que es la cuarta constante y debe realizarse a las 72 horas, más/menos 6 horas, post- inoculación en el bovino y a las 48 horas en el porcino y las aves. Existen trabajos que demostraron que las reacciones a PPD bovina en animales tuberculosos, están bien avanzadas a las 48 horas y alcanzan su máxima expresión a las 72 horas (Lepper et al.,1977) y (Francis et al.,1978). Por este motivo es importante registrar cualquier alteración en el tiempo de lectura, cuando situaciones imprevistas dificultan efectuarla en el momento adecuado, en virtud de que reactores en el umbral de las 72 horas, pueden ser erróneamente clasificados 24 horas mas tarde. Por lo tanto, sería sumamente importante consignar cualquier tipo de reacción encontrada al momento de la lectura y no simplemente la categoría de clasificación del animal. La quinta constante a considerar es la medición de las respuestas o reacciones postinoculación. En los animales domésticos, cuando a los reaccionantes a la prueba tuberculínica, pretenden otorgarle una clasificación cuantitativa, criterios como tamaño de un grano de arroz, de maíz, de un huevo o de una naranja, son totalmente inservibles, ya que se modificarán con cada observador. Por supuesto que no existirán dudas respecto a la clasificación de reactores de un animal con una reacción del tamaño del huevo o una naranja, pero sí aparecerían juntamente con serios inconvenientes, con las reacciones pequeñas. La alternativa vigente es el uso del instrumento de medida, que permita cuantificar en forma correcta y en la misma escala, la reacción localizada a través de la medición del aumento del grosor de la piel en el sitio de inoculación, por cualquier profesional en cualquier lugar. Por lo tanto, en un diagnóstico de estas características, es aconsejable eliminar todo tipo de subjetividades en la lectura e interpretación de la prueba y para ello el uso del calibre es el procedimiento adecuado, si se pretende algo más que un diagnóstico cualitativo (reaccionante o no reaccionante). Excepto cuando se utilicen calibres automáticos, las medidas del espesor de la piel previa y posterior inoculación, variarán de observador a observador y es usual que esto suceda en virtud de la diferente presión que cada profesional de acuerdo con la aplicación de su fuerza, ejerza sobre la boca del calibre. No obstante, esto no constituye ningún problema, en virtud de que el diagnóstico surge de la diferencia de medidas del pliegue de la piel previa y posterior inoculación, y siempre que el veterinario acreditado que realice ambas lecturas sea el mismo, la diferencia medida en milímetros será la misma. �En el manual de normas y procedimientos de la resolución vigente, se describen los criterios de interpretación, en forma individual para cada una de las pruebas tuberculínicas, pero es importante recalcar que la simple observación sin proceder a la palpación, se debe considerar el procedimiento de la técnica de lectura en forma incorrecta. En algunos países como por ejemplo Estados Unidos, no se considera actualmente adecuado el uso del calibre en la prueba ano caudal, mientras que en otros, sí se lo utiliza para cuantificar y eliminar toda subjetividad de la prueba. La diferencia se debe a que en USA, con cualquier reacción a la palpación, se considera al animal como positivo, en tanto en los otros países, lo hacen de acuerdo a una escala con umbrales en milímetros, en donde se clasifican a los animales reactores en positivos, sospechosos y negativos, surgiendo ambos criterios de situaciones epidemiológicas totalmente diferentes. La sexta constante es el instrumental a utilizar, variable de suma importancia en la obtención del éxito o el fracaso del saneamiento del rodeo. Es necesario utilizar jeringas de uso veterinario de 1 a 2 ml de volumen, automáticas o manuables graduadas en 0.1 mililitros. Las agujas serán hipodérmicas, calibre 6, con una longitud de la cánula de 5 milìmetros y bisel corto. En el caso de animales difíciles de inmovilizar, se podrán usar agujas más cortas. Los calibres deberán estar graduados al 0.1 milímetro, pudiendo ser metálicos o de plásticos. La falta de calidad instrumental, puede llevar aparejado una disminución en la dosis aplicada, debido a una pérdida de tuberculina, como también una disminución de la tasa de cobertura o inoculación de los animales en tiempo y forma, teniendo como resultado una disminución de la eficacia o efectividad en el cumplimiento de los objetivos propuestos. En los sistemas productivos intensivos, con especial referencia a los tambos de alta producción, tales circunstancias pueden tener implicancias directas en la eficiencia o rentabilidad empleada para llevar a cabo el programa de saneamiento o monitoreo del rodeo. Es precisamente el estudio epidemiológico de cada situación en particular, la variable que inevitablemente tendremos siempre que analizar, cuando antes de iniciar cualquier diagnóstico de situación por medio de la prueba tuberculínica, nos planteemos cinco preguntas bàsicas: 1. 2. 3. 4. 5. Cuál es el objetivo del trabajo? Qué sabemos de la condición sanitaria del rodeo respecto a la enfermedad? Cuál de las pruebas tuberculínicas vamos a utilizar? Qué categorías vamos a testear? Cómo vamos a evaluar los resultados? �La definición del objetivo constituye sin duda el punto de partida y es de fundamental importancia para la programación de las actividades posteriores. El deseo por parte del productor y veterinario acreditado, de conocer la posible existencia de la tuberculosis bovina en el rodeo, con el único fin por ejemplo, de definir el origen y los costos de futuros reemplazos en el manejo de la reposición de hembras, o tal vez para contar con otro elemento de juicio en el momento de descartar animales para venta, hace que la organización de las tareas posibles de realizar, será muy diferente a la que se programe cuando se desea eliminar la enfermedad en el rodeo. Es posible que la prueba tuberculínica que utilicemos puede ser la misma, pero los animales a inocular y la evaluación de los resultados obtenidos serán totalmente diferentes. Por lo tanto, es una necesidad iniciar las tareas de saneamiento a partir de un diagnóstico de situación transparente, en el cual el productor pueda reconocer el problema concreto de la enfermedad en su rodeo y el profesional crear las alternativas posibles. Es necesario crear un equipo con las personas que son responsables en las diversas tareas. Esto se realiza con las prácticas y las relaciones de motivación y comunicación constante que el veterinario acreditado debe transmitir al personal de campo y el desempeño de las actividades se refleja en los indicadores que serán analizados, valorados e interpretados. Toda la información analizada, debe pasar por los mecanismos de retroalimentación y estar a disposición permanente de los propietarios del establecimiento. Es fundamental para el logro de las metas y objetivos propuestos, desarrollar las actitudes y habilidades del personal a cargo, a través de charlas de actualización en los diferentes temas de la problemática a resolver. De tal manera, se podría afirmar, que es muy difícil que exista una planificación coherente, si no sabemos para qué estamos trabajando y esa es la importancia de este primer paso, definir que es lo que esperamos obtener con la utilización de éste método de diagnóstico. La segunda pregunta, correspondiente al conocimiento de la condición sanitaria del rodeo respecto a la enfermedad, merece un análisis detallado de la historia del rodeo, como se fue formando, la situación de la tuberculosis en los rebaños adyacentes, en áreas vecinas, basándose para ello en resultados tuberculínicos confiables y/o en los datos disponibles que surjan de la vigilancia epidemiológica en faena, los resultados de pruebas anteriores y el orígen de los animales que a él ingresen dentro del marco local o regional, que nos permitirá tener una visión global de la historia natural de la enfermedad en el rodeo. Los datos que se obtengan por medio de una detallada anamnesis, en algún grado nos permitirá evaluar, primero el riesgo de que la tuberculosis esté presente y segundo, la posibilidad de su ingreso al rodeo a través de las distintas vías de transmisión. �Esto constituye parte del estudio epidemiológico que antes se mencionó como variable de análisis, que no se limitará a medir el problema presente y los riesgos de introducción o reinfección, sino que deberá abarcar aspectos mucho más amplios, bajo un enfoque sistémico, en la que no podrán dejarse de lado aspectos sociales, culturales y fundamentalmente económicos del establecimiento en estudio y del área o región en que se encuentre. Del correcto análisis de esa situación, depende la adecuada selección de la prueba tuberculínica a utilizar que se planteó en tercer lugar. Cuando hablamos de un estricto análisis de diagnóstico de situación, debe quedar claro que el mismo no se limita a presencia o ausencia de la enfermedad o a su grado de difusión en el rodeo, sino que contempla otros aspectos, como las posibilidades de eliminación de los reactores, en el caso de rodeos infectados, en forma tal que su número y el momento de su segregación afecten en la menor proporción posible el esquema productivo del establecimiento. Es sabido que la erradicación de la tuberculosis bovina, es sin duda una acción sanitaria redituable, pero debe tenerse en consideración todas las alternativas posibles de aplicación, para que en el proceso se afecten lo menos posible los ingresos del establecimiento, hasta el punto de no hacer peligrar la continuidad del programa de saneamiento. Por lo tanto, juntamente con el diagnóstico de situación inicial y con el resultado de una prevalencia de infección, debe evaluarse también la capacidad económica y financiera de cada establecimiento en particular, ajustando las acciones a las posibilidades reales del propietario. De acuerdo con el sitio de inoculación, podemos clasificar a las pruebas tuberculínicas en ano-caudal y cervicales. Las cervicales a su vez pueden ser de dos tipos: cervical simple y cervical comparativa, según se utilice un antígeno PPD bovino o dos, PPD bovino y PPD aviar respectivamente. La exactitud de una prueba puede medirse y expresarse, en base a su habilidad de clasificar correctamente animales de acuerdo a su situación sanitaria. Estas medidas son la sensibilidad (Se) y especificidad (Ep). Debido a que sobre estas dos propiedades esenciales, se basa la decisión del tipo de prueba a utilizar en cada una de las distintas situaciones que pueden presentarse, al igual que los criterios utilizados en la interpretación de los resultados de la lectura postinoculación, es importante dejar claro ambos conceptos. La sensibilidad es la probabilidad de que una prueba identifique correctamente aquellos animales infectados y enfermos. La especificidad es la probabilidad de que una prueba identifique correctamente aquellos animales no infectados o sanos. �Para establecer estos dos atributos, se debe aplicar la prueba en muestras de animales cuya situación respecto a la enfermedad es conocida y los resultados pueden tabularse en cuadro 2 x 2, del cual pueden calcularse la Se y Ep. En el caso de la tuberculosis bovina, la prueba utilizada es la prueba tuberculínica que es un test indirecto, ya que no se utiliza para detectar al agente de la enfermedad, sino para evidenciar en los animales en estudio una reacción inmunitaria contra el mismo. Esta reacción que representa la manifestación de la capacidad individual para producir defensas detectables y mensurables contra el mycobacterium, no diferencia infección ni enfermedad, sino simplemente mide la exposición del huésped al agente con el correspondiente desarrollo del proceso inmunitario. Una prueba tuberculínica es tanto más sensible cuanto mayor es el número de respuestas positivas entre los animales infectados, y es tanto más específica cuanto menor es el número de respuestas positivas en animales no infectados o sensibilizados por otras micobacterias diferentes del bacilo bovino. No existe actualmente ninguna prueba tuberculínica absolutamente sensible, capaz de detectar con una sola aplicación el 100% de los animales infectados; siempre habrá un cierto porcentaje de “falsos negativos”. Tampoco existe la prueba absolutamente específica; todas las micobacterias poseen ciertos antígenos comunes y los animales sensibilizados por el M.avium complex (MAC) Subsp.paratuberculosis,o por una variedad muy grande de otras micobacterias generalmente saprófitas que se hallan en el medio ambiente, pueden dar también reacción tuberculínica positiva, son los denominados “falsos reactores positivos” En las poblaciones de ganado bovino con altos porcentajes de infección, se deben preferir sistemas de saneamiento que utilicen pruebas tuberculínicas altamente sensibles, con el propósito de interrumpir lo más rápidamente posible la transmisión de la infección. La prueba que detecta la mayor proporción de animales infectados con el menor número de repeticiones será la adecuada, aunque con ella se corra el riesgo de tener algunas falsas respuestas positivas. Es conveniente utilizar la prueba tuberculínica operativa ano-caudal, de rutina, para determinar la presencia de infección tuberculosa en un rodeo o región, y la prueba cervical simple, más sensible, para eliminar los reactores de los rebaños infectados. El criterio de interpretación podrá ser más o menos severo, según las condiciones de infección del rodeo o de la región en que se aplicará la prueba y el objetivo que se persigue con la misma. En un rodeo con antecedentes de tuberculosis, será necesario emplear un criterio más estricto que en otro donde nunca se haya detectado un reaccionante. �De acuerdo a lo expresado anteriormente, de la Se de la prueba elegida, dependerá la mayor o menor proporción de enfermos y/o infectados detectados, mientras que la Ep determinará la proporción de falsos positivos que formarán parte de la tasa de prevalencia aparente de la enfermedad, surgiendo la misma, directamente de la práctica diagnóstica realizada por el profesional. Los datos que se obtienen de esa práctica rural, están clasificados como positivos y negativos a la prueba diagnóstica e incluyen tanto verdaderos positivos y verdaderos negativos como falsos positivos y falsos negativos. El profesional veterinario a pesar de no poder cuantificarlos, deberá estar prevenido sobre la posible inclusión de falsos positivos y falsos negativos, en la medida de la presencia de la enfermedad en el rodeo. Los resultados en cada caso serán el producto de la Se y Ep del test diagnóstico que se utilice, que no siempre son exactamente conocidas. Partiendo que la prevalencia verdadera esta calculada por aquellos animales probados y realmente infectados por la “prueba de oro”, determinándose normalmente por un método estándar (aislamiento bacteriológico), se puede inferir que la prevalencia aparente detectada es diferente a la verdadera. Esto se debe a la capacidad diagnóstica de cada prueba, expresada como Se y Ep, que al aplicarse sobre una población animal la discrimina en los cuatro grupos mencionados. Si fuese la Se y Ep del ciento por ciento cada una, solo existirían dos grupos, sanos y enfermos, que permitirían solucionar los problemas epidemiológicos y sin conflicto. En la realidad esos grupos de superposición sí se presentan y su gravitación en el saneamiento y eliminación de la enfermedad en el rodeo, puede ser tan importante como detener todo el proceso del mismo, siempre y cuando el profesional acreditado no tenga en claro los conceptos anteriores que pueden sintetizarse en dos propiedades importantes de la pruebas, que son el valor predictivo positivo (VP+) y el valor predictivo negativo (VP-) El primero también denominado diagnosticabilidad, indica que proporción de los animales positivos a la prueba están realmente infectados o enfermos. Es la probabilidad que un animal con resultado positivo a la prueba, sea correcto. El valor predictivo negativo, indica la proporción de animales realmente sanos del total de animales que no reaccionaron a la prueba. Es la probabilidad que un animal no esté infectado si tiene un resultado negativo a la prueba. Los valores predictivos indican la exactitud de la prueba, por lo tanto, es la proporción de animales correctamente identificados por la prueba, ambos VP dependen de la prevalencia de la enfermedad en la población y de la Se y Ep de la prueba utilizada. Existe una relación cercana entre VP+ y la Ep, así como entre VP- y la Se. Cuando aumenta la Ep de la prueba, se incrementa el VP+ y por lo tanto la probabilidad de que un resultado positivo sea verdadero, aumenta. �Cuando aumenta la Se de la prueba, aumenta el VP- y por lo tanto la probabilidad de que un resultado negativo sea correcto, aumenta. La Se permite una mayor confianza en un resultado de prueba negativo. Esto nos permite inferir, que una prueba tuberculínica negativa de mayor Se como la cervical simple, seleccionada para una eventual compra de animales, aquellos que fueron negativos a la prueba no diseminarán la enfermedad. Es importante tener presente que si la Se y la Ep de la prueba no se modifican o sea se mantienen constante, su diagnosticabilidad variará directamente con el valor de la prevalencia de la enfermedad en el rodeo. A mayor prevalencia corresponderá una diagnosticabilidad del test más elevada y viceversa, cuando la prevalencia de la enfermedad disminuye, el VP+ del test, se irá reduciendo y aumentará consecuentemente la eliminación de falsos reactores positivos. El conocimiento de estos conceptos y su comprensión son fundamentales para el correcto uso de las distintas pruebas tuberculínicas, que se detallan en el manual de normas y procedimientos de la legislación vigente, ya que cada una fundamentalmente de acuerdo con su Se y Ep tendrá un uso adecuado o una contraindicación, de acuerdo con la situación sanitaria que se esté analizando. No existe una prueba aconsejable para todos los casos y la opción entre las distintas pruebas diagnósticas disponibles dependerá del análisis de las variables que se han mencionado anteriormente. Que categorías del rodeo vamos a testear, nos indica la siguiente pregunta, la cual está relacionada con la edad de los bovinos a tuberculinizar. En la primera prueba ano-caudal, cuando se desconoce si los animales están o no infectados, es conveniente aplicar la PPD bovina a todos los bovinos mayores de 3 meses de edad en las razas lecheras, ya que la leche es el vehículo ideal como vía de transmisión del bacilo tuberculoso, observándose en éstas categorías de terneros/as una mayor frecuencia de la infección por ingestión de leche que por vía aerógena. Las ubres de vacas positivas a la tuberculina pueden eliminar bacilos en leche sin que exista mastitis tuberculosa. La eliminación por leche es trascendente, siendo el vehículo ideal para la transmisión de los bacilos, ya que éstos se encuentran en emulsión en la grasa y ésta facilita su difusión por el tracto digestivo, cuando los alimentos son digeridos. Por lo tanto la medida de prevención es no dar más de doce horas de calostro y retirar las crías del contacto de su madre, para continuar con la crianza artificial de los terneros/as, utilizando sustitutos lácteos. Dicha medida de manejo, contribuye de manera esencial, a que el núcleo genético de las futuras vaquillonas de reemplazo, en sus tambos, mantengan una sanidad de base óptima en el inicio de la reposición. �Es importante destacar que las vaquillonas preñadas, es una categoría sensible de contraer la infección, especialmente las que provienen con un origen libre de la infección tuberculosa, por lo tanto, la no separación de los animales por grupo de edad, es un factor de riesgo que contribuye a la propagación de la enfermedad. En las razas de carne se puede iniciar el diagnóstico tuberculínico, a partir de los 24 meses de edad, si no existieron ingresos de animales en ese lapso. En cambio si hay en el establecimiento animales recientemente adquiridos, o se comprueba que el rodeo está infectado, en la siguiente prueba tuberculínica se deberá examinar a todos los animales a partir de los 6 meses de edad. En el rodeo de carne con sistemas de producción extensiva, la propagación es lenta y la transmisión de la enfermedad de la vaca al ternero desempeña en ella un papel importante. En este tipo de rodeos, la tuberculosis bovina puede afectar a unos pocos animales sin que se difunda rápidamente entre los demás. Solamente cuando las condiciones de crianza se realiza en los sistemas estabulados o semiestabulados, la propagación de la enfermedad puede incrementarse. Como vamos a evaluar los resultados, es la pregunta que nos hacemos en la evaluación epidemiológica inicial de un establecimiento infectado. El veterinario acreditado que realiza la prueba tuberculínica en un rodeo, tiene que actuar con criterio epidemiológico, tomando en cuenta la totalidad del rodeo y no interpretar los resultados en base a los animales considerados aisladamente. Las pruebas tuberculínicas negativas no son garantía sanitaria suficiente, si se desconoce el estado sanitario del rodeo del cual provienen los animales, excepto cuando los mismos proceden de un rodeo certificado oficialmente libre, puede garantizar dicha condición. Por lo tanto, es un instrumento valioso en el control y erradicación de la tuberculosis bovina y con ese criterio deben manejarse. La interpretación de los resultados de las pruebas tuberculínicas, están debidamente detalladas en la guía de saneamiento de la tuberculosis bovina en un rodeo(Torres.,2000). Como expresamos anteriormente en la selección de la prueba tuberculínica, existen situaciones y factores que pueden impedir a la prueba diagnóstica clasificar correctamente al animal. De tal manera, deben tenerse siempre presente cuando se analizan los resultados de una prueba. Positividad a la reacción tuberculínica no es sinónimo de enfermedad. Un resultado positivo sólo indica la exposición del animal en estudio al agente en algún momento de su vida, con un tiempo mínimo de incubación, anterior al estudio como para haber desarrollado la respuesta inmune. En el momento de la prueba, el animal entonces puede encontrarse infectado en un período prodrómico, enfermo o inclusive sin desarrollo de lesiones granulomatosas. �La experiencia ha mostrado que no existe correlación entre el tamaño de la respuesta tuberculínica y la extensión de las lesiones que puedan ser encontradas en el examen post mortem del animal. Por el contrario, las reacciones suelen ser más importantes cuando la infección es reciente, pasado el período de incubación prealérgico. Con otro enfoque, algunos resultados positivos, pueden deberse a la existencia de mecanismos de defensa contra agentes microbianos distintos al M.bovis, pero que tienen semejanza antigénica con él, generando reacciones cruzadas al PPD bovino. Entre las especies de micobacterias más importantes que causan dicha sensibilidad tuberculínica, se pueden encontrar el M.avium Complex (MAC), de los cuales ninguno de los serotipos reconocidos, es considerado patógeno importante en el bovino y son capaces de causar lesiones pequeñas no progresivas y circunscriptas particularmente a los linfonódulos mesentéricos. El M.avium Subsp. Paratuberculosis es el agente causal de la enfermedad paratuberculosa en el bovino y puede ser una importante fuente de sensibilidad heteroespecífica. Otras micobacterias no patógenas, como las especies que se encuentran en las lesiones de piel (dermatitis tuberculosa) Ej: Complejo M.fortuitum, M.Kansasii, M.Phlei, pueden producir sensibilidad tuberculínica. En las etapas finales del control de la enfermedad en un rodeo o en una región, el problema de los “falsos reactores positivos” va cobrando mayor importancia. Estos animales generalmente reaccionan a la tuberculina bovina, dando respuestas pequeñas. Los agentes sensibilizantes paraespecíficos son más comunes en algunas regiones que en otras, tal es el ejemplo de los resultados obtenidos en el estudio de las micobacterias no tuberculosas en los suelos de la Provincia de La Pampa (Oriani.; 2000). En condiciones de muy baja prevalencia de infección y/o sensibilización, comprobada por micobacterias diferentes del M.bovis o del M.tuberculosis, es cuando la especificidad de la prueba adquiere particular relevancia, por lo cual se deben reducir al mínimo posible los “falsos positivos”. El origen de la sensibilización de los reactores “sospechosos” a la prueba operativa de rutina, sólo se puede dilucidar cuando el criterio epidemiológico así lo aconseje, mediante el empleo de la prueba doble cervical comparativa, utilizando PPD bovino y PPD aviar. La función de ésta prueba comparativa, es clarificar si la probabilidad de que la causa de la sensibilidad tuberculínica en un animal sospechoso, es debida a una infección con M.bovis. Sin embargo, el uso de la prueba comparativa, como prueba única en los rodeos o en regiones altamente infectados es desaconsejable, porque es más compleja, tanto en su ejecución como en su interpretación, que las pruebas cervical simple o ano caudal y, si bien tiene una mayor especificidad, su sensibilidad es marcadamente inferior y ello restringe su aplicación en las áreas infectadas de tuberculosis. �También debe considerarse que un animal puede dar un resultado negativo, aún cuando pueda estar realmente infectado, si lo reciente de la infección no ha permitido el adecuado desarrollo del proceso inmunológico, cuando un fuerte shock de stress bloquea su sistema de defensa, o cuando en bovinos, como en humanos, la sensibilidad tuberculínica tiende a disminuir a medida que las lesiones progresan y toda la sensibilidad puede desaparecer en las etapas avanzadas de la enfermedad, estado que se denomina anergia tuberculinica. Otras causas de anergia son la infección muy reciente, como ser el período de incubación, y motivos fisiológicos, como es la preñez avanzada. Las enfermedades virales, inmunodeficiencias y esteroides administrados, también disminuyen la capacidad del animal infectado para su respuesta a la tuberculina. Por último hay que recordar que la anergia puede resultar el producto de una desensibilización local y sistémica, debida a una inoculación tuberculínica. Cuando se detecta la infección tuberculosa en un rodeo, ningún animal dentro de él podrá ser considerado con certeza como no infectado por el resultado de una sola prueba tuberculínica. Dado que todos los animales de ese establecimiento han estado expuestos a un foco de infección, es muy probable que entre ellos existan, casos de infección reciente, aún en la etapa prealérgica y que sólo se los pueda identificar mediante la repetición de las pruebas. Los casos complicados de saneamiento son cuando aparecen los animales tuberculosos anérgicos, que se hallan en las últimas etapas de la enfermedad, con lesiones abiertas diseminadoras de bacilos. Una práctica que alienta la aparición de éstos animales, es la no eliminación a faena de los reactores positivos a la prueba tuberculínica. Dichos animales dejan de responder a la prueba, pero continúan propagando la enfermedad. La prueba indicará la aparición de nuevos casos de infección en el rodeo a una tasa bastante constante, ocasionando una falta en el control de la enfermedad. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA Francis,J., Seiler,R., Wilkie,W., et al., 1978. The sensitivity and specificity of various tuberculin tests using bovine PPD and other tuberculins. Veterinary Record 103, 420435. Kantor, I., 1984. La prueba tuberculinica en el Ganado bovino. OPS/OMS. Lepper,A., Pearson,C., Corner,L., 1977. Anergy to tuberculin in beef cattle. Australian Veterinary Journal 53, 214-216. Organización Mundial de la Salud., 1968. Comité de Expertos de la OMS en Patrones Biológicos. Serie informe técnico Nº 384, pp.23-42. �Oriani,S.,Bernardelli,A., Sagardoy,M.,2000. Micobacterias no tuberculosas (MNT) en suelos de la Provincia De La Pampa (Argentina). Email. veter@teletel.com.ar Secretaría de Agricultura, Dirección Nacional de Sanidad Animal, Argentina, 1999. Plan Nacional de Control y Erradicación de la Tuberculosis Bovina. Resolución N° 115/99 SENASA/SAGPyA. Torres,P., 2000. Pruebas tuberculinicas (inoculación, lectura e interpretación). Preguntas y respuestas. SAGPyA, SENASA, OPS/OMS. WHO Expert Comité on Biological Standardization Requirements for Tuberculins., 1968. Technical Report, Series Nº 384, Geneva. � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Las pruebas tuberculinas en el ganado bovino Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource 2000 Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Programa Control de Tuberculosis Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0044 Abstract A summary of the resource. La prueba tuberculínica constituye el instrumento básico para detectar la presencia de infección tuberculosa, por lo tanto, desempeña un papel fundamental en el programa de control y erradicación de la tuberculosis bovina. El empleo de la prueba tuberculínica en el ganado bovino tiene ya una larga historia, que ha permitido acumular una gran cantidad de conocimientos y una amplia experiencia, especialmente en los países cuyos programas de control de la tuberculosis bovina han alcanzado la etapa de la erradicación. Tuberculosis https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/573a2fa6b1f611c148f40ab7fd5b7a83.pdf 852728bb5be57e9eaee4b582a957e524 PDF Text Text CURSO VETERINARIOS ACREDITADOS EN SANIDAD y BIENESTAR AVIAR MÓDULO 1 SITUACIÓN ACTUAL DE LA PRODUCCIÓN AVÍCOLA ENFERMEDADES BAJO PROGRAMA ÍNDICE �1. VETERINARIO PRIVADOS ACREDITADOS EN SANIDAD Y BIENESTAR AVIAR 1.1. Objetivo de la capacitación 2. SITUACIÓN ACTUAL DE LA PRODUCCIÓN AVÍCOLA 2.1. Situación de la producción de carne aviar mundial y en la República Argentina 2.2. Características de la producción de carne aviar en la República Argentina 2.3. Situación de la producción de huevo mundial y en la República Argentina 2.4. Características de la producción de huevo en la República Argentina 3. ENFERMEDADES BAJO PROGRAMA 3.1. Influenza aviar 3.2. Enfermedad de Newcastle (ENC) 3.3. Salmonelosis 3.4. Micoplasmosis 3.5. Otras Enfermedades 1. VETERINARIO PRIVADOS ACREDITADOS EN SANIDAD Y BIENESTAR AVIAR 2 �Según lo establece la Resolución SENASA N° 1-E/2018, se consideran como Veterinario privado acreditado a todas aquellas personas que hayan egresado de universidades reconocidas por el MINISTERIO DE EDUCACIÓN de la Nación, con título veterinario habilitante, acreditados y autorizados por este Organismo, para realizar las tareas inherentes a los distintos Programas Sanitarios que autorice la Dirección Nacional de Sanidad Animal. 1.1. Objetivo de la capacitación La acreditación de veterinarios privados del sector avícola tiene como objeto mantener la actualización permanente, en relación a conceptos técnicos, aspectos sanitarios de las principales enfermedades que afectan a la producción y la importancia de la notificación de sospechas de enfermedad. Si bien, cabe destacar que en el sector avícola los profesionales veterinarios son especialistas y de dedicación exclusiva a la especie, resulta imprescindible formar y mantener a los profesionales acreditados con un nivel elevado de conocimiento para que puedan tomar las medidas correctas e identificar las principales enfermedades aviares que rigen el mercado mundial, además es fundamental ejercer el cumplimiento de las medidas de bioseguridad, higiene y manejo así como el cumplimiento de los muestreos programados por SENASA. 2. SITUACIÓN ACTUAL DE LA PRODUCCIÓN AVÍCOLA 2.1. Situación de la producción de carne aviar mundial y en la República Argentina La evolución del sector de carne aviar ha demostrado una dinámica muy interesante ya que en 1950 se comercializaban las aves vivas, hacia 1960 las aves con garras y cabeza, llegando a la década del 80 donde se comercializaba la carne de ave eviscerada fresca, con menudos y sin garras ni cabeza. 3 �En la década del 90 comenzó la comercialización de carne de pollo trozada fresca y congelada, algo que vemos actualmente, junto con lo descripto en la década del 80, aparecieron los cortes deshuesados cocidos congelados, siendo un segmento importante en la comercialización de esta carne. En la última década la carne de pollo es el producto que presentó el mayor aumento de demanda en el mercado mundial de carnes. La carne aviar representa el 45% de toda la carne comercializada mundialmente. El crecimiento de la demanda por carne de aves continuará liderando el aumento en el consumo de carnes, debido a su estatus como la fuente más económica y más accesible de proteínas de origen animal. Sin embargo, mientras en algunos países la disminución en los costos de alimentación ha sido un estímulo importante en el aumento de la producción, en otros casos, las enfermedades, principalmente la influenza aviar, han limitado su crecimiento. Los principales países productores son EEUU, China y Brasil, en tanto Brasil y EEUU, lideran las exportaciones. Por su parte, Japón, Arabia Saudita, UE, México y Rusia son los principales importadores. La República Argentina mantiene un espacio en el mercado internacional ocupando el 8º lugar como productor y 8º como exportador. La faena nacional de aves en establecimientos habilitados por el SENASA alcanza cerca de 722 millones de cabezas anuales, y considerando la faena provincial y municipal se calculan aproximadamente 800 millones de cabezas. Su distribución porcentual por provincias es: Entre Ríos 50,96 %, Buenos Aires 34,83%, Córdoba 4,63%, Santa Fe 4,61%, Rio Negro 3,31% y el resto del país con el 1,66 %. 4 �El consumo ha experimentado un importante incremento desde 2003 (20 kg. per cápita) llegando un consumo per cápita en el año 2019 de 43,33 Kg/ persona/año. Diversas razones motivaron el aumento del consumo. Por un lado, la reducción del precio al consumidor y su relación con el precio de la carne vacuna se combinaron favorablemente otorgándole mayor competitividad. La significativa disminución del precio fue el resultado de la reducción del costo industrial -vía incorporación de tecnología-, la fuerte integración de la cadena y la incidencia que tuvo la apertura del comercio exterior. Por otro lado, contribuyeron a aumentar el consumo las cualidades dietéticas y nutricionales de la carne aviar, sumadas al desarrollo de nuevos productos semi-listos o preparados que respondieron a los cambios en los hábitos de vida del consumidor. Durante el 2019, se exportaron a 60 países. De acuerdo con el volumen, las exportaciones se distribuyeron principalmente entre los siguientes países: 26% China, 11% Sudáfrica, 7% Chile, 3% Hong Kong, 0.2% Alemania, el 52% restante corresponde a otros países como Omán, Angola, Emiratos Árabes, Bélgica, Vietnam, Singapur, Cuba, etc. 2.2. Características de la producción de carne aviar en la República Argentina El ciclo avícola productivo de carne (línea pesada) comienza con la importación de reproductores abuelos de un día de edad de países cuyos Certificados Veterinario Internacional (CVI) son acordados previamente. Actualmente en el país hay 4 líneas genéticas de abuelos (ROSS, COBB, ARBOR ACRES y HUBBART), comercializado por cinco firmas, las cuales obtienen sus reproductores padres y a su vez le comercializan a más de 70 empresas. 5 �En la Argentina, la producción de pollos parrilleros se realiza, en un 98%, mediante sistemas de producción integrados. Estos sistemas responden a un modelo de integración vertical de procesos. El grado de integración es variable entre empresas según las etapas de producción que controlan directamente (reproducción de abuelos y padres, incubación, engorde, fabricación de alimentos, faena de aves, procesado, etc.). Las empresas avícolas, también denominadas “empresas integradoras”, realizan la etapa de engorde en granjas propias o contratan el servicio de productores granjeros. Esta última situación es la más implementada, en la cual la empresa aporta las aves, el servicio veterinario, el alimento, la faena y comercialización de los productos y el granjero recibe una remuneración, por ave faenada, por el aporte de las instalaciones, la mano de obra, la electricidad y la calefacción. Un pequeño porcentaje de la producción de pollos parrilleros se lleva a cabo a través de productores independientes, que realizan las etapas de cría y engorde y la adquisición de insumos por cuenta propia. El Centro de Empresas Procesadoras Avícolas (CEPA) agrupa a los productores argentinos de carne de aves y representa a 32 empresas, de las cuales 27 son exportadores. Se proyecta de acá al 2025 un crecimiento de alrededor del 30% en las exportaciones de pollo a nivel mundial, siendo Asia del Este, la Unión Europea, Arabia Saudita, México, Sub-Sahara Africana, Norte y Medio Este Africano los países y regiones que más van a crecer. El sector enfrenta permanentes cambios en el escenario global, donde muchos de los países importadores se están reconvirtiendo en productores de pollo teniendo como eje la seguridad y soberanía alimentaria. 6 �2.3. Situación de la producción de huevo mundial y en la República Argentina La producción mundial de huevos también ha mostrado un dinamismo notable en las últimas décadas. Este crecimiento no ha sido homogéneo, ya que mientras que en la década de los 90 los países desarrollados contribuían con 52% de la producción global, en 2015 ya los países menos desarrollados o emergentes aportaban más del 60%, siendo China la principal causa de este cambio. Dentro de este escenario, Asia contribuye con 62,1% de la producción global y Europa, con 14,3%, mientras que Centro y Sudamérica aportan el 9,8%. En Sudamérica la producción ha aumentado exponencialmente, donde Brasil lidera la producción de huevos en la región, con 47,4% del total. Lo sigue Colombia, con 14,5% de participación, y más atrás se ubican Argentina, Perú y Chile. Estos cinco países abarcan el 87% de la producción de la región. El 97% va a consumo interno y el 3% restante se exporta a más de 56 países habilitados. El consumo ha experimentado un importante y sostenido incremento desde 2002 con 129 a 284 unidades per cápita en 2019, ubicando a la Argentina como el 5º consumidor de huevos del mundo. 2.4. Características de la producción de huevo en la República Argentina El ciclo avícola productivo de huevo (línea liviana), comienza con la importación de reproductores padres de un día de edad de países cuyos certificados (CVI) sean acordados previamente, principalmente desde Brasil, 7 �y dependiendo de la situación sanitaria por influenza aviar, desde España y Alemania. A diferencia de la producción de pollos, el sistema de producción de huevos no se halla integrado verticalmente. Los productores de huevos adquieren los insumos y realizan la venta del producto por cuenta propia. La compra de las gallinas ponedoras, el alimento, los aspectos sanitarios, el transporte de insumos, las instalaciones y la mano de obra son gerenciadas por el productor. La etapa de recría se realiza en galpones a piso o a jaula y la etapa de postura es llevada a cabo en su mayoría en galpones con jaulas. Aproximadamente el 90% de los productores compran la pollita bb y realizan la etapa de recría y producción en la misma granja. La producción de huevo se concentra principalmente en las provincias de Buenos Aires 39.3%, Entre Ríos 26.7%, Córdoba 8.3% y Mendoza 7.6%. Las empresas productoras de huevos son agrupadas en la Cámara Argentina de Productores Avícolas (CAPIA) que agrupa a más de 400 empresas a lo largo del país. Representa actualmente el 80% del sector y tiene como principal misión auspiciar el desarrollo y consolidar la industria avícola. La avicultura de postura en la Argentina tiene mucho para ofrecer, posee un potencial enorme, el cual depende exclusivamente de los actores que la componen para fijar las metas a las que quiera llegar. 3. ENFERMEDADES BAJO PROGRAMA El Programa de Sanidad Aviar tiene como objetivo disminuir en forma significativa el impacto negativo de las enfermedades de las aves 8 �domésticas que afectan la producción, comercialización y salud pública del país. En base a este criterio, se determinan las denominadas “Enfermedades bajo programa”. A continuación, se detallarán los componentes más relevantes de estas enfermedades (etiología, patogenia, epidemiología, cuadro clínico), la situación país y normativa relacionada, lo cual va a permitir comprender las actividades llevadas a cabo por el Programa, detalladas en los siguientes módulos. 3.1. El virus de la influenza aviar pertenece a la familia Orthomyxoviridae, es un virus RNA segmentado y envuelto. De acuerdo con sus nucleoproteínas y proteínas matrices, se clasifican en 3 tipos A, B y C. A su vez, atendiendo a sus 2 antígenos de superficie Hemoaglutinina (H) y Neuraminidasa (N), se subclasifican en subtipos. Estos virus exhiben una gran variabilidad antigénica y capacidad de mutación, así como un amplio espectro de virulencia. Las variaciones de los antígenos principales H y N son las causas de los cambios en la epizootiología de la influenza tipo A. Los virus de la influenza aislados de aves pertenecen sin excepción al tipo A, y si bien encontramos subtipos de H1 a H18 y N1 a N11 (198 combinaciones posibles), en las aves están presentes del H1 al H16 y N1 al N9, siendo el resto encontrados recientemente en murciélagos (H17-H18 y N10- N11). Entre los virus de la influenza de las aves y de los mamíferos existen relaciones de parentesco antigénico. La OIE define la influenza aviar de declaración obligatoria como “una infección de aves de corral, causada por cualquier virus de influenza tipo A perteneciente al subtipo H5 o H7 o por cualquier virus de influenza aviar con un índice de patogenicidad intravenosa (IPIV) superior a 1,2 en pollos 9 �de 6 semanas de edad, o que cause una mortalidad del 75% por lo menos, en pollos de 4 a 8 semanas de edad infectados por vía intravenosa” Cabe aclarar esta definición, ya que solo son de denuncia obligatoria los casos en aves de corral (en aves industriales o traspatio, pero NO en silvestres) y con aislamiento o detección viral (con aislamiento o detección por RT PCR, NO solo serología positiva). Es decir, que “la denuncia a la OIE, y consecuente pérdida del estatus del país se da si el caso ocurre en aves de corral y hay detección/aislamiento viral”. Históricamente, los problemas más severos de influenza aviar han sido causados por virus de los subtipos H5 y H7, los que inicialmente pueden presentarse como de baja patogenicidad y después, por mutación en su hemoaglutinina, se transforman en virus de alta patogenicidad. En este siglo, los brotes más importantes de IA han sido producidos por virus de los subtipos de H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N3, H7N4 y H7N7. Los virus pertenecientes al subtipo H9, se han presentado en ocasiones con mediana patogenicidad. Es una enfermedad altamente contagiosa, que tiene como principales huéspedes a gallinas, pollos y pavos, aunque es probable que todas las especies aviares sean susceptibles a la infección. La importancia epidemiológica de las aves silvestres radica en que las mismas pueden portar y distribuir el virus sin provocar en ellos enfermedades. Corresponde dar particular importancia a las aves acuáticas silvestres y, especialmente a aves del orden anseriforme (patos, gansos y cisnes), en cuyo tracto digestivo se multiplican estos virus, para ser expulsados con las heces y difundirse ampliamente en el medio ambiente acuático. También los patos domésticos pueden estar infectados en forma inaparente con virus de la influenza, y contagiar a otras especies de aves domésticas. 10 �Los signos y síntomas son muy variables dependiendo de la patogenicidad del virus. El virus de influenza de baja patogenicidad (IABP) causa infecciones entéricas o respiratorias, produciendo una enfermedad leve o moderada. Los signos de la enfermedad pueden ser plumaje erizado, reducción de la producción de huevos, o trastornos leves en el sistema respiratorio y, generalmente, cursan sin la manifestación de lesiones graves y características. El virus de influenza de alta patogenicidad (IAAP) causa infecciones sistémicas, produciendo enfermedad grave. Al tratarse de una enfermedad hiperaguda, se suele registrar una alta mortandad con ausencia casi total de signos o lesiones. En la República Argentina la influenza aviar es de declaración obligatoria, es una enfermedad exótica, de la cual no se han detectado casos ni aislado virus hasta la fecha. Desde el año 1998, el SENASA ha implementado acciones y actividades dirigidas a la prevención de la influenza aviar (IA). Una de las primeras medidas que se adoptaron fue la puesta en marcha de las técnicas diagnósticas por serología para determinación de anticuerpos contra influenza tipo A. Estas medidas obedecieron en un comienzo, más al propósito de ofrecer garantías sanitarias a los países importadores de productos avícolas argentinos, que a una preocupación por el posible ingreso de esta enfermedad, ya que hasta el momento, la influenza aviar era una enfermedad de presentación esporádica en algunos países del mundo, en su mayoría del hemisferio norte. 11 �Ante la extraordinaria difusión geográfica, en particular de la cepa A/H5N1 del virus de IA, el SENASA desarrolló e implementó diversas acciones de prevención contra la enfermedad. El país cuenta con la Resolución SENASA N° 73/2010, que ha adoptado la definición de la enfermedad acorde al Capítulo correspondiente de la OIE y obliga su notificación, vigilancia y eventual control y erradicación. Anualmente, se implementa un plan de prevención que incluye el control de las importaciones, la vigilancia epidemiológica, el control de la bioseguridad de establecimientos avícolas comerciales, la capacitación a agentes del organismo y la difusión e información a actores de la actividad avícola, entre otras actividades programadas. Frente a la aparición de sospechas o casos de estas enfermedades, los agentes del SENASA implementan actividades relacionadas a la investigación inmediata de la sospecha o eventual control y erradicación. 3.2. La enfermedad de Newcastle (ENC) es considerada en todo el mundo como una de las enfermedades más importantes en aves de corral debido a la alta mortalidad que puede producir y a las repercusiones económicas que derivan de las restricciones de comercio y embargos en las zonas y países donde se han producido brotes. Es una infección vírica aviar, producida por un virus RNA monocatenario de la familia Paramyxoviridae, subfamilia Paramyxovirinae. De los 9 serotipos existentes, es el paramixovirus-1 (PMV-1) el denominado Enfermedad de Newcastle, siendo de declaración obligatoria cuando “su índice de patogenicidad intracerebral (IPIC) es superior a 0,7 en pollitos (Gallus gallus) de un día de edad o se ha demostrado (directamente o por deducción) la presencia de múltiples aminoácidos básicos en el virus, en el extremo C-terminal de la proteína F2 y un residuo de fenilalanina en la posición 117, la cual está en el extremo N-terminal de la proteína F1. Por 12 �«múltiples aminoácidos» se entiende la presencia de al menos tres residuos de arginina o lisina entre las posiciones 113 y 116. La imposibilidad de demostrar la presencia de este modelo característico de residuos de aminoácidos exigirá la caracterización del virus aislado mediante una prueba de determinación del IPIC”. (Organización Mundial de Sanidad Animal. OIE, 2014). La Enfermedad de Newcastle (ENC) fue descubierta en Newcastle-uponTyne, Inglaterra en 1926 (Doyle) y hoy es endémica de muchos países. El virus de la ENC se ha detectado en más de 250 especies de aves, en 27 de los 50 órdenes de aves que existen. Todas las aves parecen ser susceptibles a la infección, aunque el grado de la enfermedad varía según la especie y en función de la cepa viral. Los miembros del orden Phasianiformes (aves gallináceas), en particular los pollos y gallinas, son altamente susceptibles a la ENC, según los estudios realizados a nivel experimental y en observaciones a campo. Los patos y los gansos son considerados potenciales reservorios del virus de la enfermedad de Newcastle (VEN) y presentan generalmente infecciones inaparentes, sin embargo son capaces de albergar el virus y actuar como diseminadores. Los VEN encontrados comúnmente en aves silvestres, acuáticas silvestres migratorias y otras aves acuáticas, generalmente son de baja patogenicidad para los pollos, similares a los virus clasificados como entéricos asintomáticos o lentogénicos. En general, las aves silvestres muestran pocos o ningún síntoma, incluso tras ser infectadas con cepas virulentas del VEN. La importancia que tienen las aves acuáticas es que pueden actuar como reservorios del VEN y como fuente de infección en aves de corral, pudiendo originar, eventualmente, brotes de EN en estas especies. Muy 13 �esporádicamente cepas patógenas son encontradas en aves silvestres que pueden jugar un papel de mayor importancia en la difusión del VEN una vez que la infección se ha producido en aves de corral. Las palomas (orden Columbiformes) son muy susceptibles a la ENC y los virus lentogénicos o mesogénicos del VEN son endémicos en sus poblaciones. Pueden transmitir el VEN a las aves domésticas. Las vías más frecuentes de transmisión del VEN son el contacto directo de aves, o el contacto indirecto con alimentos contaminados, subproductos contaminados, agua, transporte por personas y otros fómites. Como se indicó anteriormente, la infección es normalmente transmitida por contacto directo de aves enfermas y también por aves sin síntomas clínicos que poseen el virus. Las aves vacunadas que están clínicamente sanas también pueden excretar el virus después de estar expuestas. Existen numerosas vías de introducción potencial del VEN en un país o un área libre de enfermedad, éstas incluyen: el comercio legal de aves domésticas, el comercio legal de aves exóticas, el comercio legal de productos avícolas (huevos, carne y derivados), la migración de aves silvestres, la transmisión mecánica (movimientos de personas y objetos contaminados), la vía aerógena, a través de vacunas contaminadas, por un acto bioterrorista y mediante el comercio ilegal de aves y subproductos avícolas. En la República Argentina, la Enfermedad de Newcastle fue diagnosticada por primera vez en el año 1961, estando presente desde ese año hasta 1987 en el que se registró el último foco en pollos parrilleros, del Departamento Uruguay de la Provincia de Entre Ríos. Actualmente, la República Argentina es un país libre de enfermedad de Newcastle. 14 �Como contención se utilizó el sacrificio sanitario, la vacunación en anillo y la posterior vigilancia epidemiológica. Desde entonces y hasta el presente no se han registrado nuevos casos de la enfermedad debido, fundamentalmente, a los estrictos programas de vacunación que se efectúan en todo el país y a la eficacia de las vacunas utilizadas. Durante los años 1996 y 1997, se realizó un estudio retrospectivo sobre la enfermedad de Newcastle en la Argentina, concluyendo el mismo con la declaración de “país libre de enfermedad de Newcastle” por medio de la Resolución N° 446/1997 de la ex Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca de la Nación, la cual fue comunicada a la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) en ese mismo año. La República Argentina ha sido reconocida oficialmente como país libre de enfermedad de Newcastle velogénico viscerotrópico por la Unión Europea, Canadá, Chile y los Estados Unidos. El SENASA ha establecido estrictas normas de control y de vigilancia epidemiológica activa y pasiva implementándolas en forma permanente para la enfermedad en todo el país, tendientes a salvaguardar la situación epidemiológica alcanzada mediante la Resolución Nº 683 del 31 de Octubre de 1996 del ex - Servicio Nacional de Sanidad Animal. La principal herramienta de prevención de la enfermedad es la ejecución de un estricto programa de vacunación en todo el país. Cabe aclarar que la vacunación contra enfermedad de Newcastle en aves domésticas es de carácter voluntario y se realiza como parte de los programas de vacunación de rutina a cargo de las empresas privadas. Gran parte de los productores optan por vacunar contra la enfermedad en forma preventiva. Los planes de vacunación abarcan las aves en producción industrial o intensiva. Las explotaciones de tipo doméstico (aves de 15 �traspatio) de gallináceas no vacunan, excepto cuando las aves de raza u ornamentales asisten a ferias y exposiciones rurales. Sin embargo, cabe aclarar que la Resolución de la ex SAGPyA N° 723/2000, establece la vacunación obligatoria de las palomas de raza mensajera en todo el territorio nacional contra la enfermedad de Newcastle, ya que son una de las especies aviares de mayor susceptibilidad y resultan de alto riesgo para la diseminación de esta enfermedad, ya que la actividad que desarrollan involucra un puente de contacto entre aves susceptibles (silvestres y comerciales). Actualmente, la cobertura vacunal alcanza el 85 % de la población avícola comercial del país. Esto se establece por la relación de vacunas comercializadas por año, en relación a la cantidad de aves existentes durante ese mismo año y la cantidad de dosis que se administran. Por lo general, los lotes de pollos de engorde reciben una dosis (o eventualmente dos dosis) de vacunas vivas y/o inactivadas. Las aves reproductoras y las gallinas de postura de huevo comercial son vacunadas durante la cría y recría con un mínimo de 3 a 4 aplicaciones de vacuna a virus vivo atenuado, seguida generalmente por una vacuna aplicada antes de la producción. En algunas compañías se utilizan vacunas durante la fase de producción (a partir de la semana 19 de vida y cada 90 días). La legislación vigente autoriza para su uso vacunas elaboradas a partir de cepas lentogénicas exclusivamente, con un índice de patogenicidad intracerebral (IPIC) inferior a 0.4. El uso de cepas mesogénica y velogénicas (viscerotrópicas o neurotrópicas) para la elaboración de vacunas se encuentra prohibido. La Resolución Senasa N° 130 del 16 de marzo de 2021, establece las características que deben reunir las vacunas contra la enfermedad de Newcastle 16 �en la cual se autoriza la importación y utilización de vacunas vivas e inactivadas contra la Enfermedad de Newcastle elaboradas con cepas lentogénicas y/o recombinantes con fracción Newcastle. Esta norma abroga a la Resolución Senasa N° 1086/2019. Asimismo, se autoriza a los laboratorios nacionales y multinacionales a elaborar y/o comercializar vacunas a virus vivo e inactivado contra la ENC utilizando exclusivamente cepas lentogénicas con un Índice de Patogenicidad Intracerebral (IPIC) igual o menor a CERO COMA SIETE (0,7) en la elaboración. Dentro de las vacunas a virus vivo, son usadas principalmente las elaboradas con cepas lentogénicas tipo B1 (B1 y La Sota). También están aprobadas, aunque de menor utilización, las cepas: Clon 30, VG/Georgia, Ulster, C2, Ulster y PHY LMV 42. Para esta enfermedad, se implementa un monitoreo anualmente programado que incluye la vigilancia epidemiológica (activa y pasiva) dirigida especialmente a aves de traspatio no vacunadas. 3.3. La salmonelosis es una de las enfermedades infecciosas más comunes en el mundo, que afecta tanto a seres humanos como animales. Es causada por dos especies de Salmonella (S. entérica y S. bongori). El género Salmonella está incluido dentro de la familia enterobacteriaceae y son bacilos gran negativos lactosa y urea negativas, móviles o inmóviles. La especie S. entérica se divide a su vez en 6 subespecies, siendo la subespecie entérica la más importante. Las cepas de Salmonella a su vez se clasifican en más de 2.000 serovariedades, según la clasificación KaufmanWhite, basada en la diversidad de los siguientes antígenos: lipopolisacáridos (LPS) que se corresponden con los antígenos somáticos O y las proteínas flagelares, correspondientes a los antígenos H. 17 �Algunos serovares son específicos de especie, como S. gallinarum -que a su vez incluye dos biovares, S. Gallinarum biovar gallinarum y biovar pullorumy es el único serovar inmóvil. El biovar gallinarum (tifosis aviar) afecta a aves jóvenes, caracterizándose por una diarrea verdosa y, en aves adultas, la caída significativa de la producción. El biovar pullorum (pullororsis) afecta a aves jóvenes causando una diarrea blanca, sin embargo las aves adultas cursan generalmente como portadores asintomáticos. Otros serovares pueden afectar a distintos huéspedes, recibiendo el nombre de salmonellas paratíficas o paratifoideas. Los serovares S. Typhimurium, S. Enteritidis y S. Heidelberg son ejemplos de salmonellas paratíficas, se caracterizan por poseer la capacidad de afectar a más de una especie. La infección con serovariedades paratíficas de Salmonella pueden cursar de manera subclínica, dificultando su detección. La capacidad de Salmonella de sobrevivir y multiplicarse en macrófagos, evadiendo la respuesta humoral, les permite persistir en el hospedador, dando lugar a huéspedes asintomáticos. Las distintas serovariedades presentan características diferenciales en cuanto a su capacidad de colonización y virulencia. La presencia de una serovariedad en el tracto digestivo de las aves estaría excluyendo la posibilidad de que otra serovariedad relacionada ocupe ese nicho, estableciéndose de esta manera una competencia entre serovariedades dentro de cada individuo. En un estudio llevado a cabo con aislamientos de Salmonella de origen humano, se demostró que la capacidad de invasión también difiere entre las serovariedades, siendo S. Enteritidis y S. Heidelberg las que presentaron mayor capacidad invasiva (Jones et al, 2008). 18 �Durante las últimas décadas y a nivel mundial, ha habido un aumento de enfermedades zoonóticas transmitidas por alimentos procesados tales como la Salmonelosis. El control de esta enfermedad es actualmente una de las mayores preocupaciones de los sectores de sanidad animal y salud pública. Las Salmonellas paratíficas (ej. S. entérica var. Enteritidis y var. Typhimurium) son las principales causas de gastroenteritis bacterianas en humanos a nivel mundial –especialmente en países desarrollados– y se asocian frecuentemente al consumo de productos avícolas contaminados. Su presencia en huevos y carne de aves afecta la seguridad de los alimentos y constituye una barrera sanitaria que limita la exportación. La prevención y el control de estos patógenos requiere, por un lado, comprender sus complejos ciclos de transmisión y, por el otro, implementar actividades de vigilancia epidemiológica para la identificación de casos. A fin de garantizar la inocuidad de los alimentos de origen aviar, se debe controlar la introducción y multiplicación de estos microorganismos a lo largo de la cadena productiva avícola, es decir “desde la granja a la mesa”, en todos los procesos que suponen producción, transformación, distribución y consumo. Por tal razón, producir alimentos avícolas libres de estos patógenos y en particular de las serovariedades que producen ETAs en el hombre, es una prioridad del SENASA, la cual se traduce en menores costos para las empresas avícolas y en un escenario más favorable para la comercialización de estos alimentos, máxime teniendo en cuenta que las barreras sanitarias imperan sobre las arancelarias. Asimismo, el Código Sanitario para los Animales Terrestres de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) en su capítulo 6.5 recomienda medidas para la prevención, la detección y el control de las infecciones de aves de corral por Salmonella, complementando a su vez al 19 �Código de Prácticas de Higiene para la Carne y al Código de Prácticas de Higiene para los Huevos y Ovoproductos del Codex Alimentarius, considerando que una estrategia de reducción de los organismos patógenos en las granjas, es la primera etapa del proceso que contribuirá a reducir la presencia de agentes patógenos transmisibles por los alimentos en el producto avícola final. Ante esta situación, entre los años 2009 y 2013, se ha realizado un muestreo en las granjas avícolas de pollos de engorde y gallinas de postura, con el objetivo de estimar la prevalencia de Salmonellas no específicas de especie y con importancia en Salud Pública, posibles contaminantes del producto avícola en la etapa final de su procesado. Los resultados obtenidos permitieron dar sustento a la intervención del SENASA, elaborando la Resolución SENASA N° 86/2016 que puso en marcha el “Programa de vigilancia y control de la contaminación por Salmonellas sp en granjas avícolas comerciales”, con el objetivo de obtener una reducción continua en la prevalencia de Salmonellas paratíficas en las aves y en el medio ambiente de dichas granjas, con el fin de proteger la salud del patrimonio avícola nacional y procurar la seguridad alimentaria e inocuidad de los alimentos de origen aviar. Cabe aclarar que las Salmonellas bajo programa son S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Heidelberg. RESUMEN DE LAS ACTIVIDADES DEL PROGRAMA DE CONTROL DE SALMONELLA EN GRANJAS COMERCIALES. 20 �El muestreo está a cargo del sector privado, el veterinario acreditado es el responsable de la toma de muestra y posterior seguimiento. Las muestras obtenidas deben ser enviadas a los laboratorios que trabajan en adhesión con el Plan Nacional de Sanidad Avícola (PNSA), para la realización del diagnóstico bacteriológico (determinación de Salmonella spp.) Podrán encontrar los mismos en el siguiente link: https://www.argentina.gob.ar/sites/default/files/2019lista_de_laboratorios_adheridos_al_programa_de_sanidad_aviar.pdf En aquellos casos en los que se determine la presencia de Salmonella spp., se procederá a la tipificación para determinar la serovariedad mediante la tipificación serológica o por pruebas moleculares (PCR). Se considera granja positiva cuando se detecte la presencia de Salmonella ser. Enteritidis, S. ser. Typhimurium y/o S. ser. Heidelberg (distintas de las cepas vacunales) en el ambiente. En este caso, el veterinario acreditado del establecimiento, el responsable técnico del laboratorio, o bien, el Programa de Sanidad Aviar, comunicarán inmediatamente al veterinario oficial local con jurisdicción en el establecimiento en cuestión. 21 �En las granjas de Pollo de engorde se procederá a dar de baja la autogestión del establecimiento, se permitirá la faena del lote (en caso de estar en granja) y se bloqueará el ingreso de animales, hasta tanto se regularice la situación. El veterinario acreditado debe presentar un descargo a la oficina local de las medidas que implementará para solucionar dicha contaminación. Una vez presentado el mismo, el veterinario de la Oficina local procederá a inspeccionar la granja, a fin de corroborar el cumplimiento de las medidas dispuestas mediante acta de constatación y planilla de inspección y podrá identificar las medidas que considere insuficientes y/o deficientes. Una vez cumplimentado se permitirá el ingreso de aves y el alta la autogestión en caso de considerarlo pertinente. En las granjas de gallinas de huevos para consumo se procederá a dar de baja la autogestión del establecimiento y se bloqueará el ingreso de animales, hasta tanto se regularice la situación. El veterinario acreditado debe presentar un descargo a la oficina local de las medidas que implementará para solucionar dicha contaminación. Una vez presentado el mismo, el veterinario de la Oficina local procederá a inspeccionar la granja, a fin de corroborar el cumplimiento de las medidas dispuestas mediante acta de constatación y planilla de inspección e identificar las medidas que considere insuficientes y/o deficientes. Las medidas implementadas pueden ser respaldadas con el uso de vacunas vivas y/o inactivadas contra S. Gallinarum y/o S. Enteritidis u otra serovariedad oportunamente aprobadas por el SENASA, a fin de alcanzar una reducción efectiva en la diseminación de Salmonellas y/o inhibición de su crecimiento en huevos. 22 �Una vez cumplimentado se permitirá el ingreso de aves y el alta la autogestión en caso de considerarlo pertinente. Para una mayor comprensión, el Programa de Sanidad Aviar ha elaborado un Manual de procedimientos, el mismo se encuentra como material complementario así también en el siguiente link: https://www.argentina.gob.ar/sites/default/files/ 2._manual_de_procedimientos_operativos_vigilancia_y_control_de_salmonell a_spp._en_granjas_avicolas_comerciales_res._senasa_ndeg_86.2016._version_2018_0.pdf En aves reproductoras, la vigilancia y control de Salmonellas tíficas (Salmonella Gallinarum, S. Pullorum), paratíficas (S. Enteritidis S. Typhimurium y S. Heidelberg) y micoplasmosis (Micoplasma Gallisepticum y Micoplasma Sinoviae), se llevan a cabo en forma obligatoria desde el año 2002, en el marco del Plan Nacional de Sanidad Avícola, cuya legislación es la Resolución SENASA Nº 882 Esta vigilancia que también la realiza el sector privado mediante los laboratorios adheridos, y a su vez es fiscalizado y auditado anualmente por el Organismo. 3.4. Micoplasmosis cabe mencionar que los agentes causales son microorganismos que, por su tamaño, se encuentran entre las bacterias y los virus. El Mycoplasma gallisepticum es responsable de la enfermedad respiratoria crónica y el Mycoplasma sinoviae de la sinovitis infecciosa. Esta enfermedad esta enmarcada bajo la Resolución SENASA 882/2002, bajo un criterio de coparticipación del sector privado y el sector oficial. Las normas técnicas del plan establecen la cantidad de muestras, la frecuencia de los muestreos, el tipo de muestras para cada categoría y las pruebas de laboratorio que se deben emplear para cada determinación. En 23 �forma ordinaria, las empresas remiten las muestras extraídas por el veterinario acreditado de la empresa a laboratorios adheridos al Plan, los cuales se encuentran autorizados por SENASA para procesar las muestras correspondientes al mismo. La base técnica utilizada para el diseño de este programa es el control de las micoplasmosis y salmonelosis aviares, en base al remplazo de planteles contaminados por planteles libres y la aplicación de medidas de bioseguridad en las cabañas de reproducción y plantas de incubación. Para una mayor comprensión, el Programa de Sanidad Aviar ha elaborado un Manual de procedimientos en relación a la normativa 882/2002, el mismo se encuentra como material complementario así también en el siguiente link: https://www.argentina.gob.ar/sites/default/files/ 1._manual_de_procedimientos_operativos_programa_de_control_de_micopla smosis_y_salmonelosis_en_aves_reproductoras_res._senasa_ndeg_882.2002-version_2018.pdf Con el objetivo de verificar el cumplimiento del Plan Nacional de Sanidad Avícola (PNSA), el SENASA realiza anualmente auditorias en plantas de incubación (PI) de huevos fértiles. En las mismas se toman muestras de dos lotes de los nacimientos del día previsto de visita, en caso de ser plantas de baja producción se podrá tomar muestra de un solo lote. De cada lote se recogerán 20 huevos picados no nacidos desechados dentro del cascarón, los que serán colocados dentro de una bolsa contenedora y enviados al laboratorio central del SENASA para su diagnóstico. 3.5. Otras Enfermedades: Si bien hay otras enfermedades importantes en la producción avícola nacional, el SENASA no las incluye dentro de su programa pero actúa o interviene en casos de epizootias, colaborando con el sector privado para su control. 24 �La Laringotraquítis Infecciosa (LTI) es una enfermedad endémica y de presentación esporádica, afectando principalmente a pollos de engorde. Para su intervención cuando así lo requiera, el SENASA elaboró la Resolución SENASA N° 333 del 2015 que contiene el plan de contingencia de dicha enfermedad. La Bronquitis Infecciosa (BI) también es otra de las principales enfermedades que se incrementan año tras año y el SENASA participa en su control. A nivel sanitario, estas y otras enfermedades aviares tales como la enfermedad de Gumboro (bursitis infecciosa), cólera aviar, enfermedad de Marek, viruela aviar, anemia infecciosa, síndrome de caída de la postura, encefalomielitis aviar, infecciones por adenovirus, Micoplasmosis aviar (M. gallisepticum y M. synoviae) y Tifosis aviar son enfermedades endémicas y de aparición esporádica en las aves de producción industrial, controladas con el uso de vacunas aprobadas por el SENASA pero de aplicación voluntaria por parte de los empresas productoras. Es importante destacar que la mejor herramienta para controlar y/o evitar el ingreso en una explotación avícola de agentes patógenos, es el cumplimiento de todas las medidas de bioseguridad y la aplicación de las buenas prácticas de producción y de manufactura. Asimismo, hay que hacer hincapié en el concepto que, en la patología aviar moderna, es hablar de “enfermedades multicausales” o multifactoriales: durante los meses de invierno aumentan los problemas de manejo de temperatura y ventilación en los galpones de crianza, se incrementa la concentración de amoníaco y por lo tanto, existe una situación de estrés ambiental que desencadena en cuadros respiratorios, donde los mismos virus vacunales pueden desencadenar una enfermedad multicausal. 25 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Módulo 1: Situación actual de la producción avícola: Enfermedades bajo programa. Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource [201?] Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Coordinación Técnica de Capacitación y Desarrollo y Carrera del personal Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0105 Abstract A summary of the resource. El presente módulo trata sobre la situación actual de la producción avícola, las enfermedades bajo programa. Table Of Contents A list of subunits of the resource. 1. VETERINARIO PRIVADOS ACREDITADOS EN SANIDAD Y BIENESTAR AVIAR 1.1. Objetivo de la capacitación 2. SITUACIÓN ACTUAL DE LA PRODUCCIÓN AVÍCOLA 2.1. Situación de la producción de carne aviar mundial y en la República Argentina 2.2. Características de la producción de carne aviar en la República Argentina 2.3. Situación de la producción de huevo mundial y en la República Argentina 2.4. Características de la producción de huevo en la República Argentina 3. ENFERMEDADES BAJO PROGRAMA 3.1. Influenza aviar 3.2. Enfermedad de Newcastle (ENC) 3.3. Salmonelosis 3.4. Micoplasmosis 3.5. Otras Enfermedades https://biblioteca.senasa.gob.ar/files/original/28f7c7d0950a409bf5980d7d63d7ad81.pdf d5187891fb4743e58d77f75f9a3ed5bc PDF Text Text CURSO VETERINARIOS ACREDITADOS EN SANIDAD Y BIENESTAR AVIAR MÓDULO 3 ▪ ACTUACIÓN ANTE LA SOSPECHA Y CONFIRMACIÓN DE ENFERMEDADES EXÓTICAS ▪ COMPARTIMENTACIÓN �ÍNDICE 1. Control y erradicación 1.1. Sospecha de enfermedades de denuncia obligatoria 1.2. Implementación del plan de contingencia ante la confirmación de enfermedades exóticas. 1.3 Sacrificio sanitario 1.3.1. Gasificación con dióxido de carbono (CO2) 1.3.2 Método de espuma de alta hermeticidad 1.3.3 Dislocación cervical 1.4 Eliminación de cadáveres 1.4.1 Enterramiento 1.4.2 Incineración 1.4.3 Compostaje 1.5 Eliminación de la cama, deyecciones de aves o productos avícolas 2. Sistema de Compartimentación 2 �1. CONTROL Y ERRADICACIÓN 1.1. Sospecha de enfermedades de denuncia obligatoria El Sistema de Registro y Notificación de Enfermedades Denunciables de los Animales es de aplicación obligatoria en todo el territorio de la República Argentina. El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa), es la autoridad de aplicación del Sistema. La base normativa de la notificación de enfermedades está fundada en la Resolución Senasa Nº 153/2021, la cual tiene por objetivo adecuar a la normativa internacional vigente en cada materia sobre los sistemas de notificación de enfermedades animales, de vigilancia epidemiológica y seguimiento epidemiológico continuo, análisis de riesgo, emergencias sanitarias y un dispositivo reglamentario que contemple todos los aspectos de protección y lucha contra las enfermedades. Esta norma abroga las Resoluciones N° 234/1996 del entonces Servicio Nacional de Sanidad Animal, la Resolución Senasa N°422/2003 y la Resolución Senasa N° 540/2010. La Resolución Senasa 153/2021 agrupa todas aquellas enfermedades de denuncia obligatorias en tres grupos: GRUPO I NOTIFICABLES quedan incluidas aquellas enfermedades que deben notificarse de manera obligatoria cuya sospecha o confirmación debe ser informada dentro de las 24 hs, quedando comprendidas las enfermedades transfronterizas de los animales, aquellas enfermedades para las cuales la República Argentina posee estatus oficial de libre otorgado por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), las enfermedades consideradas exóticas en Argentina, y las enfermedades prevalentes que requieren intervención inmediata del Senasa para proteger la salud pública y animal, según lo establecido en el programa oficial de prevención, control y/o erradicación. En este grupo se encuentran incluidas: Influenza Aviar, Enfermedad de Newcastle, Clamidiosis en aves de corral y Laringotraqueitis infecciosa aviar. GRUPO II y III REPORTABLES en estos dos grupos quedan incluidas aquellas 3 �enfermedades cuya confirmación de casos deben ser reportadas de manera inmediata (brote epidémico) en menos de 24 hs. o bien deberán realizar un reporte con una frecuencia que determine el SENASA. En estos grupos se encuentran incluidas: GRUPO II: Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum y M. sinoviae), Pullorosis (S. pullorum), Salmonelas móviles (S. enteritidis, S. tiphymurium y S. heidelberg), Tifosis aviar (S. gallinarum). GRUPO III: Bronquitis infecciosa aviar, Bursitis infecciosa (Enfermedad de Gumboro). Esta norma también establece parámetros productivos que permitirán detectar precozmente posibles manifestaciones asociadas a signos clínicos relacionados con la enfermedad de Newcastle e Influenza Aviar, los cuales se fundan en las siguientes observaciones y criterios. Observaciones clínicas y patológicas en las aves. 1. Reducción de la ingesta de alimento y agua superior al 20%, sin justificar. 2. Reducción de la producción de huevos superior al 5% durante más de dos días, sin justificar. 3. Un índice de mortalidad semanal superior a un 3%, sin justificar. 4. Todo indicio clínico o lesión post-mortem que sugiera la presencia de IA /ENC. Observaciones epidemiológicas. 1. Si las aves han estado en contacto directo o indirecto con una explotación avícola que, se haya demostrado infectada con el virus de la influenza aviar /enfermedad de Newcastle 2. Si una explotación de cría o recría ha distribuido aves que se haya demostrado que estuvieran infectados con el virus de la influenza aviar/ enfermedad de Newcastle 3. Si existe la posibilidad de que las aves hayan estado expuestos al virus, por ejemplo, debido a la entrada en la explotación de personas, vehículos, etc. 4 �El Articulo 6 de la mencionada norma establece la Obligatoriedad de notificar para toda autoridad nacional, provincial o municipal, profesionales veterinarios, transportistas, entes sanitarios, personas responsables o encargadas de cualquier explotación ganadera, industrial o doméstica, universidades, organismos de investigación, zoológicos, parques o reservas naturales nacionales, provinciales o municipales y laboratorios diagnósticos estatales o privados, o cualquier persona humana o jurídica, la notificación y reporte ante el Senasa de la sospecha o confirmación de caso de todas las enfermedades, síndromes y eventos listados en la presente norma, en todas las especies de animales domésticos y de la fauna silvestre. La Resolución Senasa Nº 153/2021 establece los procedimientos de notificación frente a una sospecha incluyendo la protocolización y registro de su ocurrencia temporal y geográfica. El sistema se activa con la denuncia de un productor, veterinario privado, transportista, etc. Este puede realizarla en una Oficina Local, preferentemente de la jurisdicción en donde se encuentra el predio con el o los animales sospechosos, a través de la App “Notificaciones Senasa” que se encuentra disponible en Play Store o también se puede realizar enviando un correo a notificaciones@senasa.gob.ar . La denuncia de una presunción de enfermedad es registrada en la Oficina Local con una planilla de "Registro de enfermedad denunciable de los animales", llenando en forma completa los datos requeridos. Dentro de las DOCE (12) horas de registrada una denuncia, el Veterinario Local deberá proceder a cumplimentar la Intervención Sanitaria en el predio denunciado, protocolizando dicha visita de acuerdo al formato establecido en la Resolución Senasa Nº 153/2021. Según el art. 4º de la Ley N° 3959, ley fundamental para las políticas sanitarias de los animales: Todo propietario o persona que de cualquier manera tenga a su cargo el cuidado o asistencia de animales atacados por enfermedades contagiosas o sospechosos de tenerlas, está obligado a hacer 5 �inmediatamente la declaración del hecho a la autoridad local que los reglamentos sanitarios determinen. Asimismo, los veterinarios de la actividad privada que se encuentran en permanente contacto con el productor pecuario facilitando la difusión de los diferentes programas sanitarios, integran el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (Resolución Nº 234/96) que les establece también la responsabilidad ante el conocimiento de cualquier evento sanitario. Esta responsabilidad de productores y profesionales, personal de transporte u otros, es la inmediata denuncia ante el veterinario local del Senasa, quien debe actuar inmediatamente según procedimiento ya detallado. Pero también la responsabilidad de productores, veterinarios y otros, hasta que actúe el veterinario oficial, es la determinada en los siguientes artículos de la Ley mencionada: Art. 5. - Sin perjuicio de esta declaración y aún antes de que las autoridades hayan intervenido, desde el momento en que el propietario o su encargado hayan notado los síntomas primeros de la enfermedad contagiosa, deberán proceder al aislamiento del animal enfermo, separándolo de los sanos en cuanto sea posible. Art. 6. - La misma declaración y aislamiento son obligatorios de los animales muertos o que se supongan muertos de enfermedades contagiosas, debiendo sus despojos ser enterrados o destruidos en la forma que el Poder 6 �Ejecutivo determine en sus reglamentos. Art. 7. - En el momento en que la autoridad reciba la denuncia del caso o tenga conocimiento de la existencia de la enfermedad, procederá a asegurarse del cumplimiento de las medidas prescriptas en los artículos 5 y 6 proveyendo lo necesario a su ejecución, si no hubiesen sido cumplidas, y disponiendo, cuando sea posible, la visita y examen de los animales enfermos y de los muertos, en su caso, por el perito de que pueda disponer, para verificar la naturaleza de la enfermedad.” Específicamente para la Influenza Aviar, la Resolución SENASA N° 73/2010 y para la enfermedad de Newcastle la Resolución SENASA N° 683/96, adoptan la definición de la enfermedad acorde al Capítulo correspondiente de la OIE y obligan su notificación, vigilancia y eventual control y erradicación. Los Planes de Contingencia, respaldados por las resoluciones antes mencionadas, consideran: Frente a la aparición de signos clínicos y/o mortandad en aves que puedan ser atribuibles a influenza aviar de notificación obligatoria o enfermedad de Newcastle, el Senasa implementará rápidamente acciones tendientes a confirmar o descartar la presencia de activad viral. Entre estas actividades se incluyen: • Interdicción del predio o establecimiento bajo sospecha y de los establecimientos vecinos, si por razones geográficas o de contacto se justificara. • Censado de todas las aves del establecimiento bajo sospecha (vivas, muertas y enfermas) y aislamiento de las mismas. 7 �• Toma de muestras y envío al laboratorio oficial. La toma de muestras se realizará por parte de los Veterinarios del Senasa, teniendo en consideración los siguientes criterios: - Preferentemente extraer muestras de SUERO E HISOPADOS (traqueal y/o cloacal) de aves enfermas o aves recientemente muertas (o moribundas y sacrificadas en forma benéfica), en un número total de 20 (o de la totalidad si la cantidad de aves es menor a 20). - De hallar aves recientemente muertas (menos de 6 horas de acuerdo a las condiciones climáticas) o moribundas (y sacrificadas por el veterinario de Senasa), podrá enviarse el ave entera en número mínimo de 3 a 5 aves,en bolsas de polietileno que no pierdan su contenido. - Se recomienda no realizar necropsias. En caso de realizarla el envío de órganos debe ser en bolsa de polietileno estéril o recipiente estéril: tráquea, pulmón, bazo, hígado e intestino (tonsilas cecales). Los intestinos se deben acondicionar en forma separada al resto de los órganos. - Aves con signos nerviosos: encéfalo o directamente la cabeza del ave. - En todos los casos, las muestras deberán ser acompañadas del protocolo de sospecha de enfermedad denunciable y de un informe de la investigación realizada en terreno, así como de las medidas de control a las que fueron sometidos los animales afectados durante dicha investigación (cuarentena, prohibición del movimiento, disposición de cadáveres, etc.). • Prohibición del ingreso y salida de las aves que se encuentran en el lugar. 8 �• Restricción de movimientos de vehículos, implementos, alimentos, huevos, subproductos o desechos tales como cama de pollo o guano, aves muertas, y todo material que en forma potencial sea capaz de transmitir la enfermedad, de manera de evitar la diseminación de la misma. • Desinfección de vehículos a la entrada y salida de los mismos. • Adecuada manipulación y eliminación diaria en el predio de aves muertas. • Incremento de las medidas de bioseguridad en general y de las medidas básicas de higiene personal tales como lavado de manos, cambio de ropa y desinfección del calzado. • El Senasa mantendrá, integrará y operará el Dispositivo Nacional de Emergencia de Sanidad Animal establecido por Resolución N° 779 del 26 de julio de 1999 del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA, y expedirá las normas oficiales que establezcan las medidas de seguridad que deberán aplicarse al caso particular en el que se diagnostique la presencia de una enfermedad o plaga exótica de los animales. Estas medidas se cumplirán hasta que se garantice la ausencia de enfermedad por métodos clínicos y de diagnóstico de laboratorio. 9 �RESUMEN DE LA ACTUACIÓN ANTE LA SOSPECHA 10 �1.2. Implementación del plan de contingencia ante la confirmación de enfermedades exóticas. Si se confirmara por las pruebas de laboratorio un foco de influenza aviar de notificación obligatoria o enfermedad de Newcastle patógeno, se implementarán procedimientos destinados al control y rápida erradicación de la enfermedad, para lo cual se combinan diferentes estrategias, dependiendo a su vez de la patogenicidad de la cepa viral, las mismas incluyen: • Se activa el SISTEMA NACIONAL DE EMERGENCIAS SANITARIAS (SINAESA) Res. SENASA N° 779/99, lo que implica la reunión de sus integrantes, la comunicación interna y externa del alerta a fin de que se extremen las medidas de vigilancia en todo el país y que se implementen las medidas sanitarias correspondientes. • Se realizará una delimitación de tres zonas: Zona de foco: comprende el establecimiento afectado (puede involucrar más de uno). Zona de perifoco: de un radio mínimo de TRES (3) kilómetros, alrededor de la zona de foco. Zona de vigilancia: de un radio mínimo de SIETE (7) kilómetros, alrededor de la zona de perifoco. 11 �A continuación se describen las medidas que se deben aplicar según la zona: En la« zona de foco» se aplicarán las siguientes medidas: • Continúa la interdicción del predio, establecido durante la sospecha de la enfermedad. • Conformación de un equipo de trabajo encargado de realizar las tareas de la vigilancia epidemiológica. • Sacrificio sanitario in situ de todas la aves del establecimiento • Destrucción y enterramiento de cadáveres, huevos, restos de alimentos, cama usada, guano, etc. • Limpieza y desinfección de las instalaciones y sus alrededores, implementos, vehículos de transporte y de todo material que pueda estar contaminado utilizando para tal fin técnicas y desinfectantes autorizados oficialmente. 12 �• Vacío Sanitario de un período de espera o vacío sanitario de 21 a 30 días por lo menos. • Centinelización se instalarán en los galpones o predios lavados y desinfectados, aves centinelas. • Investigación epidemiológica: el Senasa garantizará que se realice la investigación epidemiológica correspondiente a fin de establecer el origen de la infección inicial y detectar una posible difusión de la enfermedad, indagando, el tiempo transcurrido desde el ingreso del agente etiológico hasta la aparición de los signos, los posibles contactos establecidos entre las aves afectadas y otras y/o personas, movimientos registrados en los establecimiento. Información a recabar con el fin de extremar las medidas de control y prevenir la difusión de la enfermedad. • Vacunación: el Senasa evaluará la necesidad de implementar un plan de vacunación de las aves de corral u otras, en explotaciones o locales que se encuentren o no en las zonas afectadas. De adoptarse como medida de control, la vacunación contra influenza aviar, la misma se realizará con las vacunas autorizadas por el Senasa y exclusivamente bajo la supervisión del mismo, utilizando registros de vacunación y documentación mediante actas. • Comunicación a la OIE y a los países de la región: la Dirección Nacional de Sanidad Animal del Senasa efectuará las comunicaciones correspondientes dentro de los plazos determinados a la Organización Mundial de Sanidad Animal, a todos los países y particularmente a los estados miembros del Mercosur y a la República de Chile, las novedades registradas en la República Argentina referentes a la influenza aviar de declaración obligatoria y a la evolución de las mismas mediante un informe técnico completo y detallado sobre los hechos registrados y las medidas implementadas. En la «zona de perifoco» se aplicarán las siguientes medidas: 13 �• Localización y censado de todas las explotaciones avícolas, incluidos los predios de aves de traspatio. • Inspección clínica de las aves y vigilancia epidemiológica de todos los establecimientos/predios de aves de la zona. • Desinfección adecuada de todas las entradas y salidas de esos lugares. • Los movimientos de aves (para faena o cría) y huevos (para consumo o incubación) se realizarán únicamente bajo la autorización del Senasa, por lo que se establecerá un control de tránsito dentro de la zona. • Se deberá proceder a faena controlada, con la correspondiente identificación de la carne procedente de las mismas. • El transporte de aves de un día o huevos para incubación, se realizarán de preferencia a establecimientos dentro de la zona de perifoco o de vigilancia o a un establecimiento con control oficial. • El transporte de huevos para consumo, se realizarán preferiblemente a un establecimiento elaborador de ovoproductos o deberán ser identificados para su comercialización previa desinfección de los mismos. • En caso de ser necesario se implementará el sacrificio de las aves. • Estará prohibida la realización de ferias, exposiciones o mercados en los cuales se concentren aves domésticas u otras. • No habiéndose registrado otras novedades, las medidas en la «zona de perifoco» se mantendrán durante 21 días como mínimo a partir del día en que finalizó la desinfección del establecimiento afectado. Luego de este período la zona de foco pasará a formar parte de la «zona de vigilancia». En la «zona de vigilancia» se dispondrán las siguientes medidas: • Localización y censado de todas las explotaciones avícolas o locales en los que se encuentren aves. 14 �• Inspección clínica y vigilancia epidemiológica en determinados establecimientos/predios de aves de la zona. • Control de los desplazamientos y traslados dentro y fuera de la zona. • En lo referente a las aves que se trasladen a faena, y a los huevos para incubación, podrán ser trasladados con autorización del Senasa, con identificación de las carnes y desinfección de los huevos, previo al traslado. • Los huevos para consumo podrán ser transportados a un establecimiento elaborador de ovoproductos o deberán ser identificados para su comercialización previa desinfección de los mismos. • Estará prohibida la realización de ferias, exposiciones o mercados en los cuales se concentren aves domésticas u otras. • De no haberse registrado novedades, las medidas adoptadas en la «zona de vigilancia», se mantendrán durante un período de 30 días como mínimo, a partir de haber se realizado la desinfección en el establecimiento infectado. 1.3 Sacrificio sanitario La legislación del Senasa establece que la erradicación de la influenza aviar de declaración obligatoria debe realizarse mediante el sacrificio sanitario obligatorio de las aves enfermas o sospechosas y sus contactos, y su posterior eliminación, con el fin de detener la replicación del virus y evitar la difusión de la enfermedad. Dado que no siempre la enfermedad cursa con alta mortalidad, esta medida deberá aceptarse como imprescindible para controlar la diseminación del virus en el caso de presentación de un brote de influenza aviar de baja patogenicidad de declaración obligatoria (H5/H7). Los criterios principales, para el sacrificio, en términos de bienestar animal, son que el método sea indoloro, consiga una rápida inconciencia y muerte, 15 �requiera una mínima inmovilización, evite la excitación, sea apropiado para la especie, sea irreversible y minimice el estrés animal. El método de sacrificio debe garantizar la seguridad de los operarios, así como de otras especies animales que se encuentren en la explotación y no debe tener consecuencias adversas sobre el medio ambiente. El sacrificio sanitario se realizará lo más rápido posible (24 – 48 hs.) luego de la confirmación de la enfermedad y dentro de la misma explotación infectada o lo más cerca posible. Métodos para el sacrificio de aves El Senasa determinará para cada caso los procedimientos de sacrificio que correspondan aplicar, pudiéndose implementar también la matanza por faena sanitaria, según las condiciones prácticas que se detecten, el número y especies de animales afectados y la patogenicidad del subtipo viral encontrado. Por lo tanto no se considera definitiva la lista de los procedimientos posibles enumerados a continuación. Son factibles los siguientes métodos químicos y físicos para sacrificio de aves: 1. Gasificación con dióxido de carbono (CO2) 2. Sistema de espuma de alta hermeticidad. 3. Dislocación cervical. 4. Electrocución. 5. Gasificación con nitrógeno o argón. 6. Gasificación con mezclas de gases. 7. Agentes inyectables. 8. Gasificación con monóxido de carbono (CO). 9. Gasificación con ácido cianhídrico (HCN). Si bien se permiten varios sistemas, los aconsejados y más convenientes son la utilización de dióxido de carbono y el sistema de espuma de alta hermeticidad, considerándolos humanitarios, prácticos y eficientes. 1.3.1 Gasificación con dióxido de carbono (CO2) 16 �Siempre que sea posible se utilizará, preferentemente, el sacrificio de las aves mediante gasificación con CO2. Este método de eutanasia para aves es muy rápido y eficaz, fácil de utilizar y con riesgos mínimos para los operarios. El CO2 es un gas incoloro, no inflamable, no explosivo y que no genera efectos adversos al medio ambiente. A concentraciones superiores al 60% actúa como agente anestésico y produce depresión del sistema nervioso central con rápida pérdida de la conciencia y muerte. La bibliografía recomienda situar las aves en una atmósfera de CO2 mayor al 70%, ya que pierden la conciencia muy rápido debido al efecto narcótico del gas. Sin embargo en condiciones prácticas parece ser suficiente la exposición a una concentración mínima del 55% al 60% del volumen del compartimiento. La concentración incidirá en la velocidad de muerte de las aves. El CO2 se vende en tubos en estado líquido (-72°C), por lo cual requiere válvula especial de liberación, con resistencia eléctrica. El procedimiento consiste en crear en el piso una cámara de fumigación con láminas de polietileno (6mt x 40mt = 240mt2 = 3200 aves) y, en caso de aves a jaula, las mismas pueden ser sacrificadas ubicándolas en contenedores cerrados. Se debe tener la precaución de mantener su concentración constante por al menos 3 minutos, luego de 20 minutos de exposición al gas hay que asegurarse que los animales estén muertos. 17 �1.3.2 Método de espuma de alta hermeticidad. Es un método eficiente, que hace posible un sacrificio sanitario rápido y seguro para la erradicación de enfermedades, permite mejorar el bienestar animal durante el proceso de sacrificio sanitario y disminuye el riesgo potencial de exposición humana, debido que se requieren de 2 a 3 operarios. El proceso completo de despoblación toma entre dos y tres horas. Necesita grandes cantidades de agua para su utilización. 18 �Emplea una tecnología que combina el agua y espuma con burbujas de CO2. La misma es efectiva solo para aves criadas en el piso y ha sido probada como un método de despoblación para: pollos, codorniz, patos y pavos, existiendo diferencias en el tiempo de deceso entre especies, siendo de aproximadamente 3 a 5 minutos en pollos y 10 minutos para patos y pavos. Las espumas a base de agua utilizadas para la despoblación deben ser de fácil disponibilidad, biodegradable, compatible con los métodos de eliminación de canales y de ningún riesgo para la salud humana. La aplicación debe realizarse de una manera que perturbe a las aves lo menos posible y evite el amontonamiento o el hacinamiento. La espuma se aplica al 1%, por lo tanto, si para 10 m2 se necesitan 160 a 180 litros de agua se utilizará de 1.6 a 1.8 litros espuma. Se debe considerar que para sacrificar pavos se debe utilizar el doble, debido a la altura a la que debe alcanzar la espuma. Los concentrados de espuma pueden usarse con agua potable, dura o salada, pudiendo haber diferencias de rendimiento, siendo el agua potable la recomendada. Los sistemas de suministro de espuma deben producir espuma que tenga la consistencia y densidad apropiadas para ocluir completamente la vía aérea superior de las aves domésticas; de modo que cuando se sumerge en la espuma, la oclusión de las vías respiratorias se produce de manera rápida y abrumadora, de modo que las aves no luchan indebidamente. En este momento, el tamaño de burbuja deseado de la espuma basada en agua usada para la despoblación de aves de corral no debe exceder 1,58 cm y preferiblemente debería ser menor. En sólo 15 minutos, la máquina elimina 15.000 pollos alojados en un galpón de 100 metros de largo por 12 de ancho. El equipo de sacrificio es conducido a la puerta del galpón. Se comienza a rociar espuma densa con altura ajustable. Cabe aclarar que no mata a las aves por contacto, no ahoga las aves y no desinfecta las aves. Produce un bloqueo del aire, por tal motivo la cabeza de las aves debe estar cubierta 19 �hasta la muerte. Para que el sistema funcione, debe haber una cobertura de 15 a 30 cm de espuma sobre las cabezas de las aves. La espuma a base de agua debe demostrar un tiempo de persistencia de no menos de 30 minutos (independientemente de las condiciones climáticas o la exposición solar) para asegurar que todas las aves han sido sacrificadas correctamente. En términos de tiempo hasta la muerte y porcentaje total de la población muerta cuando la espuma a base de agua es utilizado en cualquier tipo o edad de aves de corral, el sistema de espuma utilizado debe dar como resultado la muerte del 95% de las aves dentro de los 7 minutos o menos después de que las aves hayan sido completamente sumergidas en la espuma. 1.3.3 Dislocación cervical Para la eutanasia de un número reducido de aves puede realizarse el sacrificio mediante la dislocación del cuello (utilizando pinzas de Burdizzo, tijeras o las manos). La pinza de Burdizzo tiene particular utilidad para el sacrificio de aves de corral con cuello fuerte (patos, gansos, etc.). La técnica consiste en separar el cráneo y el cerebro de la médula espinal aplicando una presión a la base posterior del cráneo. 1.4 Eliminación de cadáveres Existen varios métodos para eliminar las aves muertas, desechos y otros desperdicios. Preferentemente se debe proceder al enterramiento en el mismo establecimiento u otro lugar adecuado para este fin, aprobado por el Senasa. Cuando no es posible o conveniente el enterramiento, la mejor opción es elaborar compostas o bien la incineración. Los huevos u otro material orgánico contaminante (guano, cama de galpón, restos de alimentos, productos, basura, etc.) deberán recogerse con cuidado a fin de que se elimine junto con las canales. 20 �1.4.1 El enterramiento Es el procedimiento más adecuado para la eliminación de animales y otros elementos de riesgo, ya que generalmente es cómodo, económico, rápido y seguro. 1.4.2 Incineración La incineración es el método menos recomendable para la eliminación de una gran cantidad de aves, principalmente por su elevado costo y por el tiempo que se requiere para hacerlos cenizas. 1.4.3 Compostaje El compostaje es un proceso de descomposición controlada de la materia orgánica. La descomposición ocurre en un ambiente aerobio en presencia de determinadas condiciones de pH, temperatura y humedad, en la cual microorganismos mesófilos y termófilos elevan la temperatura por un tiempo determinado permitiendo así la inactivación viral. 1.5 Eliminación de la cama, deyecciones de aves o productos avícolas La cama, las deyecciones, los huevos u otros deberán tratarse mediante un método idóneo para eliminar el virus. Dicho método deberá incluir una de las siguientes manipulaciones: • Se enterrarán con los cadáveres a una profundidad que impida el acceso a parásitos, aves silvestres u otros animales. • Se incinerarán o tratarán con vapor de agua a temperatura de 70 °C o mayor. • Se amontonarán y humidificarán (si resultara necesario para facilitar la fermentación), se cubrirán para mantener el calor de forma que se alcance una temperatura de fermentación mínima de 20°C y se mantendrán cubiertos durante 42 días. • En el caso de haber utilizado como método de sacrificio la espuma, la cama o guano debe enterrarse en forma separada de las aves sacrificadas. 21 �2. Sistema de Compartimentación La eventual presentación de enfermedades tales como la Influenza Aviar y enfermedad de Newcastle en nuestro país ocasionaría graves consecuencias sanitarias y económicas incluyendo un elevado número de muertes de aves por la enfermedad y por sacrifico, generando dificultades en toda la cadena productiva aviar, y restricciones a las exportaciones de productos avícolas. El sistema de compartimentación se rige bajo el marco de la normativa Resolución Senasa N°484/ 2017. La compartimentación son los procedimientos que utiliza un país para definir en su territorio, subpoblaciones de animales de estatus sanitario distintos a efectos del control de enfermedades o de comercio internacional. Es un procedimiento aceptado y recomendado por la OIE para facilitar el comercio, para mejorar la sanidad de los animales a través de medidas de bioseguridad eficaces, facilitando el control de enfermedades ante su introducción y para reducir la probabilidad y el impacto de los focos de enfermedades como la influenza aviar y la enfermedad de Newcastle. Los compartimentos se definen como una subpoblación de animales definida esencialmente por métodos de gestión y explotación relacionados con la bioseguridad (Código Sanitario de los Animales Terrestres, Capítulo 4.3). Se componen de explotaciones y unidades productivas que forman parte de un compartimento, tales como plantas de incubación, planta de alimento, granjas de reproductoras o cualquier otra infraestructura asociada. Las empresas avícolas que deseen inscribirse como “Compartimento libre de influenza aviar y enfermedad de Newcastle” deben presentar ante la Dirección Nacional de Sanidad Animal, la siguiente documentación: 22 �a) Solicitud de inscripción: cuyo contenido se aprueba como Anexo I de la citada Resolución. b) Manual de Buenas Prácticas de Manejo elaborado conforme con lo establecido en el Anexo II, de la citada Resolución. Las empresas avícolas que se encuentren interesadas en obtener la certificación, deben estar habilitados de conformidad con lo dispuesto en la Resolución Senasa Nº1699/2019 o inscriptos en los registros del Senasa, según corresponda de acuerdo a la explotación productiva que realicen, y deben cumplir con los planes sanitarios requeridos por este servicio Una vez analizada y aprobada la documentación remitida por la firma, el Programa de Sanidad Aviar, de la Dirección de Planificación y Estrategia de Sanidad Animal dependiente de la Dirección Nacional de Sanidad Animal otorgará el “Certificado de Compartimento libre de Influenza aviar y enfermedad de Newcastle” . 23 � Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Publicaciones SENASA Dublin Core The Dublin Core metadata element set is common to all Omeka records, including items, files, and collections. For more information see, http://dublincore.org/documents/dces/. Title A name given to the resource Módulo 3: Actuación ante la sospecha y confirmación de enfermedades exóticas. Publisher An entity responsible for making the resource available Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria. Date A point or period of time associated with an event in the lifecycle of the resource [201?] Contributor An entity responsible for making contributions to the resource Coordinación Técnica de Capacitación y Desarrollo y Carrera del personal Language A language of the resource Es Type The nature or genre of the resource Monografía Identifier An unambiguous reference to the resource within a given context B.S.0107 Abstract A summary of the resource. El Sistema de Registro y Notificación de Enfermedades Denunciables de los Animales es de aplicación obligatoria en todo el territorio de la República Argentina. El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (Senasa), es la autoridad de aplicación del Sistema. La base normativa de la notificación de enfermedades está fundada en la Resolución Senasa Nº 153/2021, la cual tiene por objetivo adecuar a la normativa internacional vigente en cada materia sobre los sistemas de notificación de enfermedades animales, de vigilancia epidemiológica y seguimiento epidemiológico continuo, análisis de riesgo, emergencias sanitarias y un dispositivo reglamentario que contemple todos los aspectos de protección y lucha contra las enfermedades. Esta norma abroga las Resoluciones N° 234/1996 del entonces Servicio Nacional de Sanidad Animal, la Resolución Senasa N°422/2003 y la Resolución Senasa N° 540/2010. Table Of Contents A list of subunits of the resource. 1. Control y erradicación 1.1. Sospecha de enfermedades de denuncia obligatoria 1.2. Implementación del plan de contingencia ante la confirmación de enfermedades exóticas. 1.3 Sacrificio sanitario 1.3.1. Gasificación con dióxido de carbono (CO2) 1.3.2 Método de espuma de alta hermeticidad 1.3.3 Dislocación cervical 1.4 Eliminación de cadáveres 1.4.1 Enterramiento 1.4.2 Incineración 1.4.3 Compostaje 1.5 Eliminación de la cama, deyecciones de aves o productos avícolas 2. Sistema de Compartimentación Bienestar Animal Veterinarios